專利名稱：雄甾－1，4雙烯－3，17－雙酮生物轉(zhuǎn)化濁點(diǎn)系統(tǒng)的優(yōu)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及雄甾-1，4雙烯-3，17-雙酮生物轉(zhuǎn)化濁點(diǎn)系統(tǒng)的優(yōu)化方法背景技術(shù)生物催化劑的特殊性質(zhì)使得生物轉(zhuǎn)化技術(shù)重新受到企業(yè)界和科研工作者的重視。特別是高選擇性和反應(yīng)條件溫和，特別適合于合成和修飾天然化合物。即使對某一生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)開發(fā)了簡單的化學(xué)合成途徑，生物轉(zhuǎn)化的高化學(xué)選擇性和空間選擇性也可排除化學(xué)合成途徑中必要的保護(hù)和去保護(hù)步驟。然而，盡管人們對生物轉(zhuǎn)化有著濃厚的興趣，工業(yè)應(yīng)用常受到實(shí)際困難的制約。如疏水性底物在水中的溶解度低，限制了其生物利用度；底物、產(chǎn)物可能抑制或毒害微生物。非水介質(zhì)因其獨(dú)特的功能在生物轉(zhuǎn)化中起著重要的作用，近年來取得了很大的進(jìn)步。本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種新系統(tǒng)，該系統(tǒng)是非離子表面活性劑膠束溶液，在溫度高于其濁點(diǎn)或有誘導(dǎo)物存在的條件下，會自動(dòng)分相形成表面活性劑稀相和富含表面活性劑的凝集層相。即采用一種或一種以上非離子表面活性劑形成濁點(diǎn)低于微生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)溫度的水溶液系統(tǒng)即濁點(diǎn)系統(tǒng)(cloud point system，CPS)，作為微生物轉(zhuǎn)化的介質(zhì)。在CPS中，形成了油包水和水包油的微觀乳濁液。表面活性劑液滴具有增溶能力，充當(dāng)著底物的儲藏庫和產(chǎn)物的抑制劑。強(qiáng)化了底物的利用度，排除了產(chǎn)物的抑制。連續(xù)的表面活性劑相中存在水泡，相當(dāng)于一個(gè)微反應(yīng)噐，能使微生物免受表面活性劑的毒害作用。濁點(diǎn)系統(tǒng)的生物相容性和對底物生物利用度的強(qiáng)化作用已被證實(shí)。
利用Mycrobacterium sp.NRRL B-3683進(jìn)行膽固醇的邊鏈切除生產(chǎn)ADD(雄甾-1，4雙烯-3，17-雙酮)和4-AD(雄甾-4烯-3，17-雙酮)的途徑如式1所示。在這微生物轉(zhuǎn)化中，ADD和4-AD的摩爾比為10∶1。
式1膽固醇的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)ADD和4-AD的途徑 盡管引入新的甾體藥物已很有限，但提高選擇性微生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)率，特別是甾醇的邊鏈切除的產(chǎn)率以便利用價(jià)格低廉的天然原料一直是人們努力的方向。人們嘗試了各種方法以增加底物的溶解度或排除產(chǎn)物的抑制作用，如雙水相系統(tǒng)、有機(jī)溶劑兩相系統(tǒng)、有機(jī)介質(zhì)、脂質(zhì)體系統(tǒng)等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于設(shè)計(jì)濁點(diǎn)系統(tǒng)應(yīng)用中提高生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)率的優(yōu)化方法，特別是提供膽固醇邊鏈切除生產(chǎn)ADD(雄甾-1，4雙烯-3，17-雙酮)和4-AD(雄甾-4烯-3，17-雙酮)的濁點(diǎn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化優(yōu)化生產(chǎn)方法。
本發(fā)明經(jīng)大量的實(shí)驗(yàn)證明，在濁點(diǎn)系統(tǒng)中表面活性劑濃度和底物濃度對轉(zhuǎn)化產(chǎn)率具有較大的影響。本發(fā)明通過優(yōu)化底物、表面活性劑濃度，建立了生產(chǎn)ADD和4-AD的CPS的優(yōu)化條件，底物濃度和轉(zhuǎn)化效率和其它轉(zhuǎn)化系統(tǒng)相比都有明顯提高。
本發(fā)明公開的優(yōu)化生產(chǎn)ADD和4-AD的濁點(diǎn)系統(tǒng)參數(shù)為非離子表面活性劑采用Triton X-100和Triton X-114，其質(zhì)量比是1∶0.5-1.5；混合表面活性劑的濃度是5-10g/100ml；底物膽固醇的濃度是0.5-2.0g/100ml；微生物菌種采用Mycrobacterium sp.NRRL B-3683，微生物轉(zhuǎn)化時(shí)間為5-9天。在此優(yōu)化條件下，ADD+4-AD產(chǎn)率高達(dá)3.5-10g/L，對應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為80-93％。
下面通過具體的實(shí)驗(yàn)過程對本發(fā)明以膽固醇為原料生產(chǎn)ADD和4-AD的CPS的優(yōu)化條件作進(jìn)一步描述1、微生物與培養(yǎng)微生物微生物菌種Mycobacterium sp.NRRL B 3683。它能實(shí)現(xiàn)膽固醇的邊鏈切除，生成產(chǎn)物ADD和4-AD，其比例為10∶1。
培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基(100ml)0.5g酵母浸出膏，1.2g瓊脂粉，1g甘油，0.05g K2HPO4，0.1g(NH4)2SO4，0.05g MgSO4·7H2O。
種子培養(yǎng)基(100ml)0.5g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.05g MgSO4·7H2O，1.0g甘油，0.2g膽固醇，0.2g TritonX-100。
轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(100ml)1.0g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.2g MgSO4·7H2O，一定量的膽固醇和混合表面活性劑Triton X-100∶Triton X-114＝1∶1)。
微生物培養(yǎng)微生物在28℃、220rpm、有氧、20/250ml裝量條件下活化培養(yǎng)3天，取活化種子按1∶10比例在裝量為22/250ml條件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)7天。取轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液分析。
2、分析方法取1ml樣品用4ml甲醇浸泡2hr。離心后取0.8ml上清進(jìn)行HPLC分析。用Hypersil C18柱，流動(dòng)相為甲醇∶水(4∶1)，流速為0.7ml/min，檢測波長為254nm。
3、結(jié)果與討論1)微生物轉(zhuǎn)化時(shí)間的優(yōu)化混合表面活性劑的質(zhì)量比為Triton X-100與Triton X-114之比為1∶1。以底物濃度為1.5g/100ml、表面活性劑濃度為4g/100ml進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，時(shí)間的影響如圖1所示。圖1為微生物轉(zhuǎn)化的時(shí)間曲線。結(jié)果表明7天時(shí)的產(chǎn)物濃度最高。再延長轉(zhuǎn)化時(shí)間反而降低。這表明產(chǎn)物可被微生物進(jìn)一步降解?？赡芫N誘變時(shí)使ADD和4-AD進(jìn)一步降解的關(guān)鍵酶，9a-羥化酶沒有完全失活。
2)混和表面活性劑濃度的影響混和表面活性劑濃度為0.5～4.0g/100ml，底物濃度為0.5g/100ml時(shí)微生物轉(zhuǎn)化的結(jié)果如圖2所示。圖2為最終產(chǎn)物濃度隨表面活性劑濃度的變化。在表面活性劑濃度較低時(shí)，產(chǎn)率隨表面活性劑濃度的增加而增加，這可歸因于表面活性劑的增溶能力。表面活性劑膠束充當(dāng)?shù)孜锏膬Υ鎺旌彤a(chǎn)物的萃取劑，隨表面活性劑濃度的增加，底物的生物利用度增加且產(chǎn)物的抑制作用被解除。但在表面活性劑濃度較高時(shí)，產(chǎn)率隨表面活性劑濃度的增加而降低，表現(xiàn)出高表面活性劑濃度的抑制作用。最終產(chǎn)物濃度隨表面活性劑濃度變化的曲線表明，對一定底物濃度存在最優(yōu)的表面活性劑濃度。
3)底物濃度的影響底物濃度為0.025～3g/100ml，混和表面活性劑濃度為2g/100ml時(shí)微生物轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖3所示。圖3為產(chǎn)物隨底物濃度的變化。在底物濃度較小，產(chǎn)率隨底物濃度的增加而穩(wěn)定地增加且表現(xiàn)出較好的線性關(guān)系。當(dāng)?shù)孜餄舛容^高時(shí)，產(chǎn)率穩(wěn)定于一個(gè)常數(shù)。這可歸因于表面活性劑的增溶能力。結(jié)果表明，要得到較高的產(chǎn)物濃度和轉(zhuǎn)化率，對一定的表面活性劑濃度存在一個(gè)對應(yīng)的臨界底物濃度(如表面活性劑濃度為2g/100ml，最大終產(chǎn)物濃度為6200mg/L，對應(yīng)的臨界底物濃度為0.85g/100ml)。
4)底物濃度的優(yōu)化高底物濃度是影響微生物轉(zhuǎn)化經(jīng)濟(jì)性的一個(gè)重要因素。底物和表面活性劑濃度相互影響著最終產(chǎn)物濃度。故采用底物濃度1～2.2g/100ml，不同的混和表面活性劑濃度進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，結(jié)果如圖4所示。圖4為底物濃度的優(yōu)化。從圖4可估計(jì)出在一定表面活性劑濃度時(shí)最大最終產(chǎn)物濃度對應(yīng)的臨界底物濃度。結(jié)果如圖5所示。圖5為臨界底物濃度和表面活性劑濃度的相互關(guān)系。在表面活性劑濃度為2～8g/100ml時(shí)，對應(yīng)一定表面活性劑濃度時(shí)的最大產(chǎn)物濃度隨表面活性劑濃度的增加而增加。當(dāng)表面活性劑濃度達(dá)到10g/100ml時(shí)，其最大產(chǎn)物濃度不再明顯增加，高表面活性劑濃度時(shí)最大產(chǎn)物濃度出現(xiàn)停滯現(xiàn)象。隨表面活性劑濃度的增加，可能導(dǎo)致物質(zhì)傳遞，特別是氧傳遞受到抑制。
表1 微生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的基本參數(shù)底物產(chǎn)物 介質(zhì) 微生物底物濃度 轉(zhuǎn)化率膽固醇 ADD，4-AD雙水相系統(tǒng)分枝桿菌 1g/L 80％谷甾醇 4-AD 有機(jī)介質(zhì) 固定化分枝桿菌12mM 89％植物甾醇4-AD PPG溶劑 分枝桿菌 5-30g/L 90％有機(jī)兩相系谷甾醇 4-AD 統(tǒng)固定化分枝桿菌5g/L 70％膽固醇 ADD，4-AD濁點(diǎn)系統(tǒng) 分枝桿菌 1.45g/100ml 93％定義轉(zhuǎn)化率為ADD和4-AD與膽固醇的摩爾數(shù)之比。1g膽固醇完全轉(zhuǎn)化時(shí)可到0.74g ADD和4-AD(ADD∶4-AD＝10∶1)。從圖6可得到在表面活性劑濃度為8g/100ml時(shí)對應(yīng)的臨界底物濃度為1.45g/100ml。如表1所示，轉(zhuǎn)化率，特別是底物濃度(對應(yīng)著最終產(chǎn)物濃度)都有很大的提高。
結(jié)論表面活性劑濃度和底物濃度對轉(zhuǎn)化產(chǎn)率相互影響。本發(fā)明通過優(yōu)化底物、表面活性劑濃度，建立了CPS的優(yōu)化條件。底物的濃度和轉(zhuǎn)化效率和其它轉(zhuǎn)化系統(tǒng)相比都有明顯提高，表明CPS是優(yōu)良的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。


圖1微生物轉(zhuǎn)化的時(shí)間曲線圖2最終產(chǎn)物濃度隨表面活性劑濃度的變化圖3產(chǎn)率隨底物濃度的變化圖4底物濃度的優(yōu)化表面活性劑濃度(g/100ml)×(2)；◇(4)；△(6)；○(8)；●(10)圖5臨界底物濃度和表面活性劑濃度的相互關(guān)系
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例膽固醇的邊鏈切除，優(yōu)化CPS的系統(tǒng)參數(shù)實(shí)施例1.
1.微生物與培養(yǎng)微生物微生物菌種Mycobacterium sp.NRRL B 3683。它能實(shí)現(xiàn)膽固醇的邊鏈切除，生成產(chǎn)物ADD和4-AD，其比例為10∶1。
培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基(100ml)0.5g酵母浸出膏，1.2g瓊脂粉，1g甘油，0.05g K2HPO4，0.1g(NH4)2SO4，0.05g MgSO4·7H2O。
種子培養(yǎng)基(100ml)0.5g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.05g MgSO4·7H2O，1.0g甘油，0.2g膽固醇，0.2g TritonX-100。
轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(100ml)1.0g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.2g MgSO4·7H2O，1.5g膽固醇，10g表面活性劑(TritonX-100∶Triton X-114＝1∶1)。
微生物培養(yǎng)微生物在28℃、220rpm、有氧、20/250ml裝量條件下活化培養(yǎng)3天，取活化種子按1∶10比例在裝量為22/250ml條件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)7天。取轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液分析。
分析方法取1ml樣品用4ml甲醇浸泡2hr。離心后取0.8ml上清進(jìn)行HPLC分析。用Hypersil C18柱，流動(dòng)相為甲醇∶水(4∶1)，流速為0.7ml/min，檢測波長為254nm。
結(jié)果產(chǎn)物濃度(ADD∶4-AD＝10∶1)為10g/L.
實(shí)施例2.
1.微生物與培養(yǎng)微生物微生物菌種Mycobacterium sp.NRRL B 3683。它能實(shí)現(xiàn)膽固醇的邊鏈切除，生成產(chǎn)物ADD和4-AD，其比例為10∶1。
培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基(100ml)0.5g酵母浸出膏，1.2g瓊脂粉，1g甘油，0.05g K2HPO4，0.1g(NH4)2SO4，0.05g MgSO4·7H2O。
種子培養(yǎng)基(100ml)0.5g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.05g MgSO4·7H2O，1.0g甘油，0.2g膽固醇，0.2g TritonX-100。
轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(100ml)1.0g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.2g MgSO4·7H2O，1.5g膽固醇，6g表面活性劑(TritonX-100∶Triton X-114＝1∶1.2)。
微生物培養(yǎng)微生物在28℃、220rpm、有氧、20/250ml裝量條件下活化培養(yǎng)3天，取活化種子按1∶10比例在裝量為22/250ml條件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)7天。取轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液分析。
分析方法取1ml樣品用4ml甲醇浸泡2hr。離心后取0.8ml上清進(jìn)行HPLC分析。用Hypersil C18柱，流動(dòng)相為甲醇∶水(4∶1)，流速為0.7ml/min，檢測波長為254nm。
結(jié)果產(chǎn)物濃度(ADD∶4-AD＝10∶1)為8g/L.
實(shí)施例3.
1.微生物與培養(yǎng)微生物微生物菌種Mycobacterium sp.NRRL B 3683。它能實(shí)現(xiàn)膽固醇的邊鏈切除，生成產(chǎn)物ADD和4-AD，其比例為10∶1。
培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基(100ml)0.5g酵母浸出膏，1.2g瓊脂粉，1g甘油，0.05g K2HPO4，0.1g(NH4)2SO4，0.05g MgSO4·7H2O。
種子培養(yǎng)基(100ml)0.5g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.05g MgSO4·7H2O，1.0g甘油，0.2g膽固醇，0.2g TritonX-100。
轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(100ml)1.0g(NH4)2SO4，0.45g Na2HPO4，0.34gKH2PO4，0.2g MgSO4·7H2O，1.0g膽固醇，10g表面活性劑(TritonX-100∶Triton X-114＝1∶0.8)。
微生物培養(yǎng)微生物在28℃、220rpm、有氧、20/250ml裝量條件下活化培養(yǎng)3天，取活化種子按1∶10比例在裝量為22/250ml條件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)7天。取轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液分析。
分析方法取1ml樣品用4ml甲醇浸泡2hr。離心后取0.8ml上清進(jìn)行HPLC分析。用Hypersil C18柱，流動(dòng)相為甲醇∶水(4∶1)，流速為0.7ml/min，檢測波長為254nm。
結(jié)果產(chǎn)物濃度(ADD∶4-AD＝10∶1)為7g/L.
權(quán)利要求
1.雄甾-1，4雙烯-3，17-雙酮生物轉(zhuǎn)化濁點(diǎn)系統(tǒng)的優(yōu)化方法，該方法以膽固醇為原料，以微生物Mgcobacterium sp.NRRL B 3683.為菌種進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，其特征在于該方法所用的介質(zhì)為濁點(diǎn)系統(tǒng)，各參數(shù)為非離子表面活性劑采用質(zhì)量比是1∶0.5-1.5的Triton X-100和TritonX-114，混合表面活性劑的濃度是5-10g/100ml，底物膽固醇的濃度是0.5-2.0g/100ml，微生物轉(zhuǎn)化時(shí)間為5-9天。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了濁點(diǎn)系統(tǒng)在微生物轉(zhuǎn)化中應(yīng)用的優(yōu)化方法，特別是公開了從膽固醇生產(chǎn)ADD和4－AD的濁點(diǎn)系統(tǒng)的優(yōu)化參數(shù)。采用本發(fā)明方法底物濃度為0.5－2.0/100ml時(shí)，可使微生物轉(zhuǎn)化ADD和4－AD產(chǎn)率高達(dá)3.5－10g/L，對應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為80－93％，顯著優(yōu)于其它轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。
文檔編號C12P33/00GK1483833SQ0314211
公開日2004年3月24日 申請日期2003年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月7日
發(fā)明者陳代杰, 王志龍, 戈梅, 葉偉東, 金一平 申請人:上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責(zé)任公司, 上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責(zé)