專利名稱：異基因骨髓間充質干細胞移植嵌合模型的建立、鑒定及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及異基因骨髓源間充質多能干細胞的制備及鑒定方法，具體涉及一種建立以異基因骨髓源間充質多能干細胞誘導穩(wěn)定嵌合體及免疫耐受形成進而使異基因皮膚移植物長期存活的模型的方法。本發(fā)明還涉及一種在異基因組織器官移植受體體內誘導穩(wěn)定嵌合，形成免疫耐受，進而使異基因移植物長期存活的方法。本發(fā)明還涉及一種可誘導異基因組織器官移植免疫耐受形成的骨髓源間充質多能干細胞的制備方法。
背景技術：
異體器官移植是目前治療難治性終末器官性疾病的有效手段之一。而移植排斥反應仍然是影響器官移植成功的主要原因。目前普遍認為，解決異體移植排斥反應的關鍵在于誘導受體對供體的細胞、組織或器官產生持久的免疫耐受，即受體免疫系統(tǒng)對移植物抗原產生特異性免疫無反應性。為此，人們進行了長期不懈的努力。迄今為止，眾多研究者已探索了多種誘導免疫耐受的途徑，如利用MHC肽段的封閉作用(see Benichou G et al.Indirect T-cell allorecognition perspectivesfor peptide-based therapy in transplantation.Immunol Today，1997，1867-71)、阻斷共刺激通路、調節(jié)Th細胞轉換等手段阻斷抗移植物特異性免疫應答誘導免疫耐受(see Im SH，Barchan D，Souroujon MC，et al.Role of tolerogen conformation ininduction of oral tolerance in experimental autoimmune myasthenia gravis.JImmunol，2000m，1653599-3605.；Shimizu K，Schonbeck U，Mach F，et al.HostCD40 ligand deficiency induces long-term allograft survival and donor-specifictolerance in mouse cardiac transplantation but does not prevent graft arteriosclerosis.JImmunol，2000，1653506-3518.；Blancho G，Gianello PR，Lorf T，et al.Molecularand cellular events implicated in local tolerance to kidney allografts in miniatureswine.Transplantation，1997，6326-33.)；清除殺傷性淋巴細胞誘導免疫耐受(seeSasaki H，Xu XC，Smith D，et al.HLA-G expression protects poreine endothelialcells from xenogeneic cytotoxicity mediated by human natural killer cells.TranslantProc，1999，31953-954.；Carosella ED.HLA-Gfetomaternal tolerance.C R Acad SciIII，2000，323675-680.；Horuzsko A，Lenfant F，Munn DH，et al.Maturation ofantigen-presenting cells is compromised in HLA-G transgenic mice.IntImmunol，2001，13385-394.8 Borghans JA，De Boer RJ.Crossreactivity of the T-cellreceptor.Immunol Today，1998，19428-429.；Borghans JA，Boer RJ，Sercarz E，er al.Tcell vaccination in experimental autoimmune encephalomyelitisa mathe-maticalmodel.J Immunol，1998，1611087-1093.)；建立受體體內嵌合體誘導免疫耐受(see Reinsmoen NL，Jackson A，McSherry C，et al.Organ-specific patterns ofdonor antigen specific hyporeactivity and peripheral blood allogeneic microchimerismin lung，kidney，and liver transplant recipients.Transplantation，1995，601546-1554.；Pham SM，Mitruka SN，Youm W，et al.Mixed hematopoietic chimerism inducesdonor-specific tolerance for lung allografts in rodents.Am J Respir Crit Care Med，1999，159199-205.；Levy AE，Alexander JW，Babcock GF.A strategy for generatingconsistent long-term donor-specific tolerance to solid organ a1lografts.TranspImmunol，1997，583-88.；梁曉燕，陳宗佑，錢詩光，等，術前輸注供者CD80low/CD86low樹突狀細胞延長小鼠同種異體移植心臟存活。中國病理生理雜志，2000，161249-1254.；Thomas Wekerle.Transplantation tolerance induced bymixed chimerism.The J Heart and Lung Transp，2001，20，8817-823.)。
其中，關于嵌合體的建立，人們已嘗試于術前移植供體骨髓或輸注供體血液的方法(see Reinsmoen NL，Jackson A，McSherry C，et al.Organ-specific patternsof donor antigen specific hyporeactivity and peripheral blood allogeneicmicrochimerism in lung，kidney，and liver transplant recipients.Transplantation，1995，601546-1554.；Pham SM，Mitruka SN，Youm W，et al.Mixed hematopoieticchimerism induces donor-specific tolerance for lung allografts in rodents.Am J RespirCrit Care Med，1999，159199-205.)。他們認為骨髓和血液中含大量造血干細胞，具有很強的增殖與分化潛能，容易形成嵌合體進而誘導免疫耐受。但要使骨髓移植成為誘導器官移植耐受的主流，目前來說還不太可能，因為骨髓移植前的免疫抑制處理就是一個很大的障礙；此外，致死劑量照射后的機會感染，骨髓移植后可能出現(xiàn)的排斥反應，移植物抗宿主反應等等目前都還無法解決。胚胎干細胞雖然可以誘導免疫耐受，但存在著眾所周知的倫理學方面的問題。因此，尋找一個更好的能誘導嵌合體形成的細胞群體，是當務之急。
近年來有文獻報道骨髓源間充質多能干細胞可以在體外非特異性的抑制混合淋巴細胞培養(yǎng)和有絲分裂原誘導的T細胞增殖；在體內實驗中，觀察到間充質多能干細胞可延長皮膚移植物存活時間，還能促進異基因骨髓、骨及其它組織的移植物存活(see Kevin M，Amelia B.Stromal cell modulation of the immunesystem.Graft，2000，3324-328.；Bartholomew A，Sturgeon C，Siatskas M，F(xiàn)errer K，etal.Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolongskin graft survival in vivo.Exp Hematol.2002；342-48.)。我們研究室建立了比較穩(wěn)定的骨髓源間充質多能干細胞的培養(yǎng)體系。對此類細胞進行了體內和體外誘導分化試驗，表明培養(yǎng)的骨髓源間充質多能干細胞可在體內和體外重建造血(參見呼瑩，馬麗，馬冠杰，等。具骨髓間充質多能干細胞表型的成體干細胞移植造血。中國醫(yī)學科學院學報，2002，2420-24.)。但關于間充質多能干細胞能否誘導穩(wěn)定嵌合體的形成、能否誘導針對供者源組織器官的特異性免疫耐受的發(fā)生以及其是否可以使再次異基因器官移植長期存活目前均未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明旨在填補現(xiàn)有技術的空白，提供一種建立異基因骨髓源間充質多能干細胞誘導穩(wěn)定嵌合體及免疫耐受形成進而使異基因皮膚移植物長期存活的模型的方法。本發(fā)明還提供了一種在異基因組織器官移植受體體內誘導穩(wěn)定嵌合，形成免疫耐受，進而使異基因移植物長期存活的方法。本發(fā)明還提供了一種制備可誘導異基因組織器官移植免疫耐受形成的骨髓源間充質多能干細胞的方法。
本發(fā)明的建立模型的方法的技術方案可通過以下步驟實現(xiàn)(一)實驗模型構建的技術方案自成年BALB/C小鼠的骨髓中分離獲得并體外培養(yǎng)擴增原始多能間充質多能干細胞，對其表型進行鑒定；并將適量的供體BALB/C小鼠骨髓源多能間充質多能干細胞和一定量的C57BL/6小鼠骨髓細胞共同植入經致死量照射的成年C57BL/6小鼠體內。150天后檢測受者骨髓及脾臟的T細胞嵌合狀態(tài)；然后進行異基因皮膚移植實驗并進行MLR和ConA誘導增殖實驗以檢測受者體內產生的針對供者源組織的特異的免疫耐受，得小鼠原始骨髓源間充質多能干細胞誘導穩(wěn)定嵌合體及免疫耐受形成模型。
(二)實驗模型構建的具體步驟1供體小鼠骨髓源間充質多能干細胞的制備將6-8周齡的雄性BALB/C小鼠(購于北京大學醫(yī)學部實驗動物中心)脫脊處死，無菌取其后肢的脛骨和股骨，以預冷的D-Hank’s液D-Hanks液配方(g/L)0.4g KCl、0.06g KH2PO4、8.00g NaCl、0.35g NaHCO3、0.12g Na2HPO4.12H2O、0.01g酚紅，加超純水至1000ml沖出骨髓細胞，經反復吹打分散細胞后，使之成單細胞懸液。用D-Hank’s液和不完全RPMI1640培養(yǎng)液(購于LIFETECHNOLOGIES公司)各洗滌細胞一次(離心條件均為1000rpm、10min)，經Ficoll(購于中國醫(yī)學科學院血液學研究所)密度梯度離心獲得單個核細胞，經磁珠法(購于MACS公司)去除CD45+Ter119+細胞，然后加入特制的培養(yǎng)基(此培養(yǎng)基含DMEM、F12、MCDB-201、2％FBS、10ng/ml EGF、10ng/ml PDGF-bb和10ng/ml LIF等成分，均購于sigma公司)，按3×105/cm2接種至培養(yǎng)瓶中，置于37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24-48小時后，棄除懸浮細胞，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，2-3天換液一次，至細胞80-90％匯合后，以含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化3分鐘，傳代培養(yǎng)。表型鑒定和后續(xù)實驗所用細胞均為第二代細胞。而且，在移植前細胞經MACS去除Sca-1+細胞。
2供體小鼠骨髓細胞的制備將7-8周齡的雌性C57BL/6小鼠(購于中國軍事醫(yī)學科學院動物部)脫脊處死，無菌取其后肢的脛骨和股骨，以預冷的D-Hank’s液沖出骨髓細胞，經反復吹打分散細胞后，使之成單細胞懸液。以EDTA-NH4Cl配方(g/L)8.29g NH4Cl、1.0012g KHCO3、29.225mg EDTA，加超純水至1000ml去除紅細胞，再以D-Hank’s液洗滌二次(離心條件均為1000rpm、10min)。用0.2％臺盼蘭染色按常規(guī)方法計算活細胞率，并以PBS調整細胞至所需濃度備用。
3受體小鼠的準備將7-8周齡的雌性C57BL/6小鼠進行致死量照射(Gammacell 40、CES IUM137、Atomic Energy of Canada Limited Radiochemical公司)，照射劑量為850Rad。4骨髓移植將1×107的雌性C57BL/6小鼠的骨髓細胞和5×105的雄性BALB/C骨髓源間充質多能干細胞共同經尾靜脈植入經上述處理的受體小鼠體內。
5統(tǒng)計學分析數據分析采用SPSS 11.0軟件配對T檢驗。
(三)構建的實驗模型的檢測1培養(yǎng)的原始骨髓源間充質多能干細胞的表型測定①CD34、MHC I、MHC II、CD45和CD44、CD13、CD29表型檢測將貼壁細胞消化，調整細胞濃度為5×105/管，各管細胞分別以適當濃度的FITC標記的單克隆抗體(mAb)進行染色，染色體系終體積為50μl，所用mAb包括FITC標記的CD13、CD34、CD44、CD29、MHCI和MHCII類抗原；以FITC標記的大鼠IgG為同型對照(所有單抗均購于BD公司)。染色條件為4℃ 45分鐘。用流式細胞儀(FACS Calibur型)檢測。結果顯示CD34、MHC I、MHC II、CD45均為陰性；低表達CD13；高表達CD44和CD29，見圖1。
②Flk-1表型檢測將貼壁細胞消化，調整細胞濃度為5×105/管，共兩管，一為對照管，另一為實驗管。以0.1％皂素1ml室溫破膜1小時，以PBA洗液洗滌2次，離心后，棄上清；實驗管中加入Flk-1mAb(購于BD公司)，對照管中加入無關單抗(購于BD公司)，4℃過夜。以PBA洗液洗滌兩次，兩管中各加入FITC標記的二抗(購于BD公司)，4℃45分鐘，以PBA(含1％BSA和0.01％疊氮鈉的PBS)洗液洗滌兩次，以染色緩沖液定容至0.5ml。用流式細胞儀檢測。結果可見Flk-1表達率為91.57％，見圖1。
2流式細胞儀測定嵌合H-2Kd和CD3雙陽性細胞的檢測分別制備骨髓源間充質多能干細胞移植小鼠的脾臟和骨髓的單個核細胞懸液，溶紅細胞后進行抗體染色。參考廠家提供的說明書。取適量的上述兩種細胞，加入生物素化的抗H-2Kd單抗孵育過夜，以洗液(含1％BSA和0.01％疊氮鈉的PBS)洗滌兩次，然后加入適當稀釋后的FITC-鏈霉親和素和PE-CD3單抗，以PE-大鼠IgG同型對照為對照，4℃孵育45分鐘。用上述洗液洗滌細胞兩次。流式細胞儀測定。結果如圖2所示，脾臟中H-2Kd和CD3雙陽性的細胞占5.97％，骨髓中陽性細胞為0.87％，提示骨髓源間充質多能干細胞移植后150天，外周血中仍存在供者來源的細胞，形成了穩(wěn)定的T細胞嵌合體。一般認為供體來源T細胞比例＞5％，穩(wěn)定存在100天以上為穩(wěn)定嵌合(Fandrich F，Lin X，Chai GX，et al.Preimplantation-stage stem cells inducelong-term allogeneic graft acceptance without supplementary host conditioning.Nature Med 2002；8171-178.)。
3異基因供者來源皮膚移植實驗將供體BALB/C小鼠用0.5％戊巴比妥鈉(70mg/kg體重)麻醉后，10％硫化鈉脫毛處理，酒精消毒，取胸背部皮膚，放入預冷的D-Hank’s液中備用。然后以同樣方法將骨髓源間充質多能干細胞移植C57BL/6小鼠和未處理C57BL/6小鼠麻醉、脫毛、消毒，在胸背部做移植床，將供體BALB/C小鼠皮膚移植到移植床上，縫合，包扎。置于無菌條件下飼養(yǎng)，7天后，拆除敷料，連續(xù)觀察移植物存活情況。90天后皮膚移植物仍存活，未出現(xiàn)移植物抗宿主病(GVHD)現(xiàn)象，也沒有觀察到慢性排斥反應，見圖3。未處理組C57BL/6小鼠的皮膚移植物在移植后8-9天出現(xiàn)排斥現(xiàn)象。
4混合淋巴細胞培養(yǎng)實驗分別制備刺激細胞(BALB/C小鼠脾細胞)和效應細胞(骨髓源間充質多能干細胞移植組C57Bl/6小鼠脾細胞和未處理組C57BL/6小鼠脾細胞)，溶紅細胞后調整細胞濃度為5×106。在96孔U型底培養(yǎng)板中加入刺激細胞，100μl/孔，照射30Gy后，再加入效應細胞，100μl/孔，對照孔不加效應細胞。共培養(yǎng)5天。培養(yǎng)結束前18小時，加H3-TdR，1μCi/孔，培養(yǎng)結束后，用Liquid scintillation &luminescence counter儀測定。結果計算刺激指數(stimulating index，SI)＝刺激管cmp/對照管cmp均值。結果顯示骨髓源間充質多能干細胞移植組小鼠MLR的SI(刺激指數)均值為1.793，未處理組C57BL/6小鼠MLR的SI均值為7.278，將骨髓源間充質多能干細胞移植組C57BL/6小鼠MLR的SI值和未處理組C57BL/6小鼠MLR的SI值進行配對T檢驗，P＝0.022(P＜0.05)，有顯著性差異，見圖4。提示骨髓源間充質多能干細胞移植組C57BL/6小鼠只對供者源組織(BALB/C)具有低反應性。
5有絲分裂原誘導增殖實驗分別制備骨髓源間充質多能干細胞移植組C57BL/6小鼠脾細胞和未處理組C57BL/6小鼠脾細胞，溶紅細胞后調整細胞濃度為5×106。在96孔U型底培養(yǎng)板中加入上述細胞，100μl/孔，實驗孔中加入ConA(購于SIGMA公司)，終濃度為5μg/ml。對照孔不加ConA。共培養(yǎng)3天。培養(yǎng)結束前18小時，加H3-TdR(購于上海原子核研究所)，1μCi/孔，培養(yǎng)結束后測定及計算方法同前。結果顯示骨髓源間充質多能干細胞移植組C57BL/6小鼠的SI均值為31.92，未處理組C57BL/6小鼠的SI均值為34.99，同樣將骨髓源間充質多能干細胞移植組C57BL/6小鼠ConA誘導的SI值和未處理組C57BL/6小鼠ConA誘導的SI值進行配對T檢驗，P＝0.417(P＞0.05)，無顯著性差異，見圖4。提示骨髓源間充質多能干細胞移植組C57BL/6小鼠對其他抗原(如ConA)的反應與未處理組C57BL/6小鼠相比無明顯差異。
本發(fā)明的一種在異基因細胞、組織或器官移植受體體內誘導穩(wěn)定嵌合，形成免疫耐受，進而使異基因移植物長期存活的方法的技術方案可通過以下步驟實現(xiàn)自供體(BALB/C小鼠)骨髓中分離獲得并體外培養(yǎng)擴增原始多能間充質干細胞，對其表型進行鑒定；并將適量的供體骨髓源多能間充質干細胞和一定量的受體(C57BL/6小鼠)骨髓細胞共同植入免疫系統(tǒng)已被基本破壞的受體體內，遂可在受體體內誘導產生穩(wěn)定的T細胞嵌合體，形成免疫耐受，進而使異基因移植物長期存活。
術語“基本破壞”是指若不進行骨髓移植，經致死處理后的受體小鼠體內殘留的骨髓細胞將不足以對受體小鼠產生免疫保護作用。所述“致死處理”包括通過致死量輻射、施用特異性毒素、施用附著于毒素或放射性同位素上的特異性單克隆抗體，或這些技術的結合等方法以基本上全部除去受體鼠的骨髓干細胞。經上述處理后，受體鼠體內可能仍會殘留一些骨髓細胞，但由于其數量很少，因此若不進行骨髓移植，在一般實驗室條件下受體鼠將無法存活。
本發(fā)明對免疫系統(tǒng)已被基本破壞的受體小鼠(C57BL/6)經尾靜脈注射經表型鑒定的供體小鼠BALB/C(H-2Kd)的骨髓源間充質干細胞(5×105/100ul/只)和受體小鼠(C57BL/6)的骨髓細胞(1×107/100ul/只)。在150天后分別制備骨髓源間充質干細胞移植小鼠的脾臟和骨髓的單核細胞懸液，以流式細胞儀檢測受體鼠骨髓及脾臟的T細胞嵌合狀態(tài)，結果顯示脾臟中H-2Kd和CD3雙陽性的細胞占5.97％，骨髓中陽性細胞為0.87％，提示骨髓源間充質干細胞移植后150天，外周血中仍存在供者來源的細胞，形成了穩(wěn)定的T細胞嵌合體一般認為供體來源白細胞比例＞5％，穩(wěn)定存在100天以上為穩(wěn)定嵌合(19 Fandrich F，LinX，Chai GX，et al.Preimplantation-stage stem cells induce long-term allogeneic graftacceptance without supplementary host conditioning.Nature Med 2002；8171-178.)。然后進行異基因皮膚移植實驗；并進行MLR和ConA誘導增殖實驗以檢測受體小鼠體內產生的針對供者源組織的特異的免疫耐受狀態(tài)，證實骨髓源間充質干細胞移植組C57BL/6小鼠只對供者源組織(BALB/C)具有低反應性。
本發(fā)明填補了現(xiàn)有技術的空白，首次提供了一種建立以異基因骨髓源間充質多能干細胞誘導穩(wěn)定嵌合體及免疫耐受形成進而使異基因皮膚移植物長期存活的模型的方法。本發(fā)明還提供了一種在異基因組織器官移植受體體內誘導穩(wěn)定嵌合，形成免疫耐受，進而使異基因移植物長期存活的方法以及一種制備可誘導異基因組織器官移植免疫耐受形成的骨髓源間充質多能干細胞的方法。
由于在本方法中同時移植了受者源的骨髓細胞，可使受者在經致死量照射后免疫能力有一定程度的恢復，出現(xiàn)機會感染的可能性大大下降；同時已公認的骨髓源間充質多能干細胞有較低的免疫原性，故移植后出現(xiàn)排斥反應的機率也較骨髓移植低得多。移植過程中未涉及供者來源的成熟的淋巴細胞，因此，間充質多能干細胞移植發(fā)生移植物抗宿主病的可能性不大，較骨髓移植可能更合理。本結果為免疫耐受的誘導提供了一個新的途徑，也為異基因細胞、組織、器官移植(包括骨髓移植)的進一步發(fā)展開辟了一個新途徑。


圖1為培養(yǎng)的原始骨髓源間充質多能干細胞的表型FACS檢測結果。
圖2為BALB/C小鼠骨髓源間充質多能干細胞移植150天后C57BL/6受體小鼠脾臟及骨髓嵌合狀態(tài)流式細胞儀檢測結果。
圖3為皮膚移植實驗結果。
A為皮膚移植實驗后14天移植的皮膚存活良好；B為皮膚移植后30天移植的皮膚存活良好，已長出毛發(fā)。
圖4為MLR和ConA誘導增殖實驗結果。
具體實施例方式
實施例1制備供體(BALB/C)小鼠骨髓源間充質多能干細胞，以FACS對培養(yǎng)擴增的bMSC進行表型檢測。
將6-8周齡的雄性BALB/C小鼠(購于北京大學醫(yī)學部實驗動物中心)脫脊處死，無菌取其后肢的脛骨和股骨，以預冷的D-Hank’s液(D-Hanks液配方(g/L)0.4g KCl、0.06g KH2PO48.00g、NaCl、0.35g NaHCO3、0.12g Na2HPO4.12H2O、0.01g酚紅，加超純水至1000ml)沖出骨髓細胞，經反復吹打分散細胞后，使之成單細胞懸液。D-Hank’s液和不完全RPMI1640培養(yǎng)液(購于LIFETECHNOLOGIES公司)各洗滌細胞一次(離心條件均為1000rpm，10min)，經Ficoll(購于中國醫(yī)學科學院血液學研究所)密度梯度離心獲得單個核細胞，經磁珠法(購于MACS公司)去除CD45+Ter119+細胞，然后加入特制的培養(yǎng)基(此培養(yǎng)基含DMEM，F(xiàn)12、MCDB-201、2％FBS、10ng/ml EGF、10ng/ml PDGF-bb和10ng/ml LIF等成分，均購于sigma公司)，按8×105/cm2接種至培養(yǎng)瓶中，置于37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24-48小時后，棄除懸浮細胞，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，2-3天換液一次，至細胞80-90％匯合后，以含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化3分鐘，傳代培養(yǎng)。表型鑒定和后續(xù)實驗所用細胞均為第二代細胞。而且，在移植前細胞經磁珠法去除Sca-1+細胞。
骨髓源間充質多能干細胞的CD34、MHC I、MHC II、CD45和CD13、CD44、CD29表型檢測將貼壁細胞消化，調整細胞濃度為5×105/管，各管細胞分別以適當濃度的FITC標記的單克隆抗體(mAb)進行染色，染色體系終體積為50μl，所用mAb包括FITC標記的CD13，CD34，CD44，CD29，MHCI和MHCII類抗原；以FITC標記的大鼠IgG為同型對照(所有單抗均購于BD公司)。染色條件為4℃45分鐘。用流式細胞儀(FACS Calibur型)檢測。結果顯示CD34、MHC I、MHC II、CD45均為陰性；低表達CD13；高表達CD44和CD29，見圖1。
骨髓源間充質多能干細胞的Flk-1表型檢測將貼壁細胞消化，調整細胞濃度為5×105/管，共兩管，一為對照管，另一為實驗管。以0.1％皂素1ml室溫破膜1小時，以PBA洗液洗滌2次，離心后，棄上清；實驗管中加入Flk-1mAb(購于BD公司)，對照管中加入無關單抗(購于BD公司)，4℃過夜。以PBA洗液洗滌兩次，兩管中各加入FITC標記的二抗(購于BD公司)，4℃ 45分鐘，以PBA(含1％BSA和0.01％疊氮鈉的PBS)洗液洗滌兩次，以染色緩沖液定容至0.5ml。用流式細胞儀檢測。結果可見Flk-1表達率為91.57％，見圖1。實施例2供體小鼠骨髓細胞的制備將7-8周齡的雌性C57BL/6小鼠(購于中國軍事醫(yī)學科學院動物部)脫脊處死，無菌取其后肢的脛骨和股骨，以預冷的D-Hank’s液沖出骨髓細胞，經反復吹打分散細胞后，使之成單細胞懸液，以EDTA-NH4Cl(配方(g/L)8.29g NH4Cl、1.0012g KHCO3、29.225mg EDTA，加超純水至1000ml)去除紅細胞，再以D-Hank’s洗滌二次(離心條件均為1000rpm，10min)。用0.2％臺盼蘭染色按常規(guī)方法計算活細胞率，并以PBS調整細胞至所需濃度備用。
實施例3骨髓移植將20只7-8周齡的C57BL/6小鼠隨機分成兩組，10只/組。兩組小鼠均進行致死量照射(Gammacell 40，CES IUM 137，Atomic Energy of Canada LimitedRadiochemical公司)，照射劑量為850Rad。然后根據表1將的雌性C57BL/6小鼠的骨髓細胞(1×107/100ul/只)和雄性BALB/C小鼠的骨髓源間充質多能干細胞(5×105/100ul/只)共同經尾靜脈植入經上述處理的受體小鼠體內。40天后，在10只處理組受體小鼠中，除有1只小鼠不明原因死亡外，其余9只小鼠的背部黑毛中出現(xiàn)了白毛，范圍逐漸擴展到頸部和腹部；而對照組受體小鼠則未出現(xiàn)上述現(xiàn)象。
表1組別 輸入的細胞 只數 毛色變化處理組異基因Flk-1+bMSCs+同基因骨 N＝10有白毛出現(xiàn)(9*)髓細胞對照組只輸同基因骨髓細胞 N＝10無白毛出現(xiàn)10)*一只于細胞移植后第10天不明原因死亡實施例4用流式細胞儀檢測嵌合狀態(tài)在骨髓移植150天后隨機抽取了3只處理組小鼠進行3批次檢測。先將小鼠處死，取其脾臟及骨髓，制備成單細胞懸液，用抗H-2Kd單抗和CD3單抗檢測雙陽性細胞。3次實驗結果相似。圖2顯示了其中一次實驗結果。a和b為脾臟細胞，雙陽性細胞占5.97％；c和d為骨髓細胞，雙陽性細胞占0.87％。提示骨髓源間充質多能干細胞移植小鼠的外周血中形成了穩(wěn)定的嵌合。
實施例5皮膚移植實驗隨機抽取了4只處理組小鼠進行了皮膚移植試驗。
BALB/C小鼠骨髓源間充質多能干細胞移植組C57BL/6小鼠在細胞移植后5月進行BALB/C小鼠來源皮膚移植實驗。將供體BALB/C小鼠用0.5％戊巴比妥鈉(70mg/kg體重)麻醉后，10％硫化鈉脫毛處理，酒精消毒，取胸背部皮膚，放入預冷的D-Hank’s液中備用。然后以同樣方法將骨髓源間充質多能干細胞移植C57BL/6小鼠和未處理C57BL/6小鼠麻醉、脫毛、消毒，在胸背部做移植床，將供體BALB/C小鼠皮膚移植到移植床上，縫合，包扎。置于無菌條件下飼養(yǎng)，7天后，拆除敷料，連續(xù)觀察移植物存活情況。觀察到90天，4只實驗小鼠異基因皮膚物仍存活。未出現(xiàn)GVHD現(xiàn)象，也沒有觀察到慢性排斥反應。圖3顯示4只皮膚移植實驗成功小鼠中的1只的照片。A為皮膚移植實驗后14天移植的皮膚存活良好；B為皮膚移植后30天移植的皮膚存活良好，已長出毛發(fā)(因在移植實驗中未注意移植皮膚的頭尾方向，將其橫向放置，故移植皮膚的毛發(fā)與受者皮膚的毛發(fā)生長方向交叉)。未處理組C57BL/6小鼠的皮膚移植物在移植后8-9天出現(xiàn)排斥現(xiàn)象。
實施例6 H3增殖實驗取3只皮膚移植實驗成功(皮膚移植物存活至少90天)的小鼠進行3批次的H3增殖實驗。
混合淋巴細胞培養(yǎng)實驗分別制備刺激細胞(BALB/C小鼠脾細胞)和效應細胞(骨髓源間充質多能干細胞移植組C57BL/6小鼠脾細胞和未處理組C57BL/6小鼠脾細胞)，溶紅細胞后調整細胞濃度為5×106。在96孔U型底培養(yǎng)板中加入刺激細胞，100μl/孔，照射30Gy后，再加入效應細胞，100μl/孔，對照孔不加效應細胞。共培養(yǎng)5天。培養(yǎng)結束前18小時，加H3-TdR，1μCi/孔，培養(yǎng)結束后，用Liquid scintillation& luminescence counter儀測定。結果計算刺激指數(stimulating index，SI)＝刺激管cmp/對照管cmp均值。結果顯示骨髓源間充質多能干細胞移植組小鼠MLR的SI(刺激指數)均值為1.793，未處理組C57BL/6小鼠MLR的SI均值為7.278，將骨髓源間充質多能干細胞移植組C57BL/6小鼠MLR的SI值和未處理組C57BL/6小鼠MLR的SI值進行配對T檢驗(SPSS 11.0軟件)，P＝0.022(P＜0.05)，有顯著性差異，3批次實驗結果一致，見圖4。提示骨髓源間充質多能干細胞移植組C57BL/6小鼠只對供者源組織(BALB/C)具有低反應性。
有絲分裂原誘導增殖實驗分別制備骨髓源間充質多能干細胞移植組C57BL/6小鼠脾細胞和未處理組C57BL/6小鼠脾細胞，溶紅細胞后調整細胞濃度為5×106。在96孔U型底培養(yǎng)板中加入上述細胞，100μl/孔，實驗孔中加入ConA(購于SIGMA公司)，終濃度為5μg/ml。對照孔不加ConA。共培養(yǎng)3天。培養(yǎng)結束前18小時，加H3-TdR(購于上海原子核研究所)，1μCi/孔，培養(yǎng)結束后測定及計算方法同前。結果顯示骨髓源間充質多能干細胞移植組C57BL/6小鼠的SI均值為31.92，未處理組C57BL/6小鼠的SI均值為34.99，同樣將骨髓源間充質多能干細胞移植組C57BL/6小鼠ConA誘導的SI值和未處理組C57BL/6小鼠ConA誘導的SI值進行配對T檢驗(SPSS 11.0軟件)，P＝0.417(P＞0.05)，無顯著性差異，3批次實驗結果一致，見圖4。提示骨髓源間充質多能干細胞移植組C57BL/6小鼠對其他抗原(如ConA)的反應與未處理組C57BL/6小鼠相比無明顯差異。
權利要求
1.一種建立異基因骨髓源間充質多能干細胞移植誘導穩(wěn)定嵌合及特異耐受模型的方法，其特征在于，所述方法包括自供體小鼠體內的骨髓中分離獲得并體外培養(yǎng)擴增異基因多能間充質多能干細胞，對其表型進行鑒定；將適量的供體小鼠異基因骨髓源多能間充質多能干細胞和一定量的受體小鼠骨髓細胞一同植入經致死量照射的受體小鼠體內；檢測受體小鼠的T細胞嵌合狀態(tài)，并進行異基因皮膚移植實驗和特異性免疫耐受狀態(tài)的鑒定，得異基因骨髓源間充質多能干細胞移植誘導穩(wěn)定嵌合及特異耐受模型。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述供體異基因骨髓源間充質多能干細胞具有CD34-、CD45-、MHC I-、MHC II-，CD13低表達和Flk-1、CD29、CD44高表達的表型。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述供體異基因骨髓源間充質多能干細胞中除去了具有Sca-1+表型和CD45+Ter119+表型的細胞。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述受體特異性免疫耐受狀態(tài)的鑒定為進行MLR和ConA誘導增殖實驗。
5.一種在異基因細胞、組織或器官移植受體體內誘導穩(wěn)定嵌合，形成免疫耐受，進而使異基因移植物長期存活的方法，其特征在于，所述方法包括在受體免疫系統(tǒng)被基本破壞的情況下，引入供體異基因骨髓源間充質多能干細胞和受體骨髓細胞；待受體體內形成穩(wěn)定的T細胞嵌合后，將異基因移植物植入受體。
6.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述異基因移植物為皮膚。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述供體異基因骨髓源間充質多能干細胞具有CD34-、CD45-、MHC I-、MHC II-，CD13低表達和Flk-1、CD29、CD44高表達的表型。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述供體異基因骨髓源間充質多能干細胞中除去了具有Sca-1+表型和CD45+Ter119+表型的細胞。
9.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述受體免疫系統(tǒng)被基本破壞為給予受體致死量輻射。
10.一種可誘導異基因組織器官移植免疫耐受形成的骨髓源間充質多能干細胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括自異基因哺乳動物供體骨髓中分離獲得并體外培養(yǎng)擴增多能間充質多能干細胞，除去具有Sca-1+表型和CD45+Ter119+表型的細胞，鑒定分離出具有CD34-、CD45-、MHC I-、MHCII-，CD13低表達和Flk-1、CD29、CD44高表達表型的間充質多能干細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及異基因骨髓源間充質多能干細胞的制備及鑒定方法，具體涉及一種建立以異基因骨髓間充質多能干細胞誘導穩(wěn)定嵌合體及免疫耐受形成進而使異基因皮膚移植物長期存活的模型的方法。本發(fā)明還涉及一種在異基因組織、器官移植受體體內誘導穩(wěn)定嵌合，形成免疫耐受，進而使異基因移植物長期存活的方法，包括在受體免疫系統(tǒng)被基本破壞的情況下，引入供體異基因骨髓源間充質多能干細胞和受體骨髓細胞；待受體體內形成穩(wěn)定的T細胞嵌合后，將異基因移植物植入受體。本發(fā)明還涉及一種可誘導異基因組織器官移植免疫耐受形成的骨髓源間充質多能干細胞的制備方法。本發(fā)明可應用于異基因組織器官移植研究中。
文檔編號C12N15/09GK1576364SQ0314188
公開日2005年2月9日 申請日期2003年7月29日 優(yōu)先權日2003年7月29日
發(fā)明者趙春華, 鄧為民, 韓欽 申請人:趙春華