專(zhuān)利名稱(chēng)：大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清的用途和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液的用途和保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基及其制備方法，尤其是大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液用于制備保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基及制備方法。
背景技術(shù)：
胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES細(xì)胞)是具有全能分化潛能的細(xì)胞，體外培養(yǎng)極易發(fā)生分化，需加入細(xì)胞因子以抑制其分化。體外培養(yǎng)ES細(xì)胞的方法歸納起來(lái)有兩類(lèi)有飼養(yǎng)層培養(yǎng)法和無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)法。有飼養(yǎng)層培養(yǎng)法是早期的方法，主要應(yīng)用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)或STO細(xì)胞系作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，經(jīng)處理終止其分裂后制備成飼養(yǎng)單層，將ES細(xì)胞種植在這樣的單層上。MEF和STO都能分泌促進(jìn)ES細(xì)胞增生和抑制其自主分化的因子—白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)，含量在500～1000IU/ml(分泌型)；同時(shí)在MEF和STO基質(zhì)上還存在LIF(基質(zhì)型)。無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)法是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入重組的LIF制備成條件培養(yǎng)基。使用飼養(yǎng)層來(lái)培養(yǎng)ES細(xì)胞，具有很多缺點(diǎn)1、MEF生命有限，不能在體外長(zhǎng)期傳代。在體外傳代時(shí)間太長(zhǎng)，其產(chǎn)生促增生因子和抑制分化因子的能力會(huì)減弱甚至喪失；2、在ES細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，死亡的MEF或STO細(xì)胞染色體釋放出可能會(huì)引起ES細(xì)胞的突變及影響正常核型的保持。因此目前多使用無(wú)飼養(yǎng)層的含LIF的條件培養(yǎng)基，使ES細(xì)胞以未分化的、貼壁的、細(xì)胞集落的方式生長(zhǎng)。
白血病抑制因子(LIF)，美國(guó)專(zhuān)利US5166065對(duì)此有具體的描述，LIF是美國(guó)CHEMICON公司專(zhuān)利產(chǎn)品，是重組的細(xì)胞因子，不僅價(jià)格昂貴，市場(chǎng)售價(jià)為2600～3000人民幣/10μg，且按照產(chǎn)品推薦濃度，不能維持ES細(xì)胞在體外的增殖，需2倍、3倍或更高濃度才能達(dá)到要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種價(jià)格低廉、效果好，能保持鼠胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)不產(chǎn)生分化而增殖的培養(yǎng)基，以解決現(xiàn)有技術(shù)利用LIF加入鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)體外培養(yǎng)鼠ES細(xì)胞成本高且效果不佳的缺點(diǎn)。為此，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清的用途，所述大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清可用作保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基。大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清不僅可單獨(dú)作為保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基，還可在大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基輔料成為鼠胚胎干細(xì)胞的專(zhuān)用培養(yǎng)基。
一種保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基含有大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清及培養(yǎng)基輔料。這里所講的鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清就是取大鼠心臟按一定的方法制備出的心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
為了使鼠胚胎干細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)達(dá)到更好的效果，在將大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液和谷胺酰胺配制組合成為能保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基，谷胺酰胺在培養(yǎng)基中的終濃度為1～4mmol/L。
同樣的大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液和非必需氨基酸也可配制成組合物作為能保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基，非必需氨基酸的終濃度為0.1mmol/L。
大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液與終濃度為1～4mmol/L谷胺酰胺及終濃度為0.1mmol/L非必需氨基酸也可共同組合，成為能保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基。
上述這三種方式組合成的鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)基，還可分別加入含量為0.05mmol/L的2-巰基乙醇各自構(gòu)成組配更完善的鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)基。
為了使培養(yǎng)基保持有充分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可在培養(yǎng)基中加入胎牛血清，胎牛血清的含量為10％～20％，如可在大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中加入含量為終濃度為1～4mmol/L的谷胺酰胺和含量為10％～20％胎牛血清組成能保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基。
現(xiàn)有技術(shù)中，是在培養(yǎng)液中加入LIF，能使鼠胚胎干細(xì)胞(鼠ES細(xì)胞)保持一種未分化的自我更新?tīng)顟B(tài)，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液除了單獨(dú)用作鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)可保持不分化而增殖，而且其細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)比只用LIF要好得多，更利于ES細(xì)胞的貼壁、增殖和克隆形成；在和LIF聯(lián)合用作培養(yǎng)時(shí)也能保持鼠ES細(xì)胞不分化而增殖，且效果比單獨(dú)使用LIF好。在大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液與LIF聯(lián)合用作培養(yǎng)基時(shí)，LIF的含量選用1000單位/ml(即unit/ml)較合適。為確保能保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基的效果，通常選用2～3周齡大鼠心肌細(xì)胞1～6代培養(yǎng)上清液，這種情形取得的大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液通常質(zhì)量較好，能保證鼠ES細(xì)胞在體外能迅速增殖而不產(chǎn)生分化。
一種用于制備保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基的方法，所述的大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清的制備方法按如下順序進(jìn)行a.取清潔級(jí)SD大鼠，處死，取心臟，去除心包膜及血塊、結(jié)締組織，洗滌，剪碎；
b.將小組織塊移入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10％～20％牛血清的DMEM培養(yǎng)基，內(nèi)含終濃度為1～4mmol/L谷胺酰胺，PH7.2～7.4；此為第一代心肌細(xì)胞，記為G1，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至瓶底面積的70％～80％時(shí)，進(jìn)行傳代，記為G2，如此傳代，收集各代心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清，于-30℃，備用。
為培養(yǎng)出更理想的大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液?？稍谏鲜龇椒ǖ牟襟Ea后增加消化步驟m.將處理好的心臟剪碎物用0.02％-0.25％EDTA-胰蛋白酶在37℃消化15min，期間不斷輕輕振蕩，洗滌，離心，棄上清，保留沉淀細(xì)胞及小組織塊。再進(jìn)行b步驟。
所述的培養(yǎng)基的制備方法中的牛血清為可用胎牛血清。
鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液的制備過(guò)程中提及的洗滌通常用無(wú)鈣鎂的緩沖液洗滌，如可用磷酸鹽緩沖液洗滌。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)及效果(1)大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液可直接用作鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)基，不需加入其它組分。(2)用本發(fā)明培養(yǎng)鼠ES細(xì)胞，使鼠ES細(xì)胞在體外培養(yǎng)保持不分化而增殖，效果比LIF好。根據(jù)LIF提供的產(chǎn)品說(shuō)明，鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，LIF最適濃度是1000單位/ml(即1000unit/ml)，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)此濃度不能使鼠ES細(xì)胞維持未分化增殖方式，需增加LIF濃度，而本發(fā)明使ES細(xì)胞體外生長(zhǎng)狀況良好。(3)本發(fā)明取材于大鼠心肌細(xì)胞，成本低，而LIF價(jià)格較為昂貴。(4)本發(fā)明不僅制備簡(jiǎn)單，且在促進(jìn)ES細(xì)胞貼壁、增值、克隆形成等方面優(yōu)于LIF。
四

圖1為實(shí)施例1所配培養(yǎng)基培養(yǎng)的鼠胚胎干細(xì)胞鼠ES細(xì)胞集落(4×10倍)
圖2為實(shí)施例2所配培養(yǎng)基培養(yǎng)的鼠胚胎干細(xì)胞鼠ES細(xì)胞集落(10×10倍)圖3為實(shí)施例2所配培養(yǎng)基培養(yǎng)的鼠胚胎干細(xì)胞鼠ES細(xì)胞集落(4×10倍)五具體實(shí)施方式
實(shí)施例11.1 準(zhǔn)備以下材料1.1.1 鼠胚胎干細(xì)胞系(mouse embryonic stem cell)由Robertson E.博士惠贈(zèng)。
1.1.2 大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清自備1.1.3 谷氨酰胺(L-glutamine，上海生工，Amresco產(chǎn)品分裝，LotNo.1490B40)。
1.1.4 胎牛血清1.1.5 Gibco公司Dulbecco`s Modified Eagle Medium(DMEM)高糖培養(yǎng)基1.1.6 EDTA-胰蛋白酶1.1.7 0.1％明膠溶液明膠(gelatin，華美生物工程公司，Lot No.0205)用三蒸水稍加熱后配成0.1％，0.22μm濾膜過(guò)濾，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 1.1.8 堿性磷酸酶染色所用試劑萘酚AS-MX磷酸酯；二甲基甲酰胺購(gòu)自上海生工；2-氨基-2-甲基-1，3丙二醇，上?；瘜W(xué)試劑公司進(jìn)口分裝；堅(jiān)牢藍(lán)RR，購(gòu)自Fluka公司。
1.1.9 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
1.2 制備方法按如下步驟1.2.1 大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清制備將3周齡的大鼠斷頸處死，用75％酒精浸泡10分鐘，取出心臟，去除心包膜及血塊、結(jié)締組織，用磷酸鹽緩沖液(即PBS，pH調(diào)至7.4)洗滌，除去血液，剪碎。用0.02％-0.25％EDTA-胰蛋白酶在37℃消化15min，期間不斷輕輕振蕩，加入10倍量PBS進(jìn)行洗滌，1200轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄上清，將沉淀細(xì)胞及小組織塊移入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)心肌細(xì)胞培養(yǎng)液采用貼片法于37℃，5％CO2中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含15％胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM高糖培養(yǎng)基，內(nèi)含終濃度為2mmol/L谷胺酰胺(glutamin)，PH7.2～7.4。此為第一代心肌細(xì)胞，記為G1，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至瓶底面積的70％～80％時(shí)，進(jìn)行傳代，記為G2，收集1-6代細(xì)胞的培養(yǎng)液，1200rpm離心8min，上清用0.22μm過(guò)濾，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 1.2.2培養(yǎng)板預(yù)處理 在24孔培養(yǎng)板中加入0.1％明膠溶液，以蓋滿(mǎn)孔底為宜，室溫中放置30min，吸棄明膠溶液，將培養(yǎng)板中殘留的溶液吹干，整個(gè)過(guò)程注意無(wú)菌操作。將培養(yǎng)板密封，備用，4℃可放置2周。這樣處理過(guò)的培養(yǎng)板會(huì)使細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)更貼壁。
1.2.3能保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制，取大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清加入終濃度為2mmol/L谷胺酰胺，終濃度為15％的胎牛血清混合，構(gòu)成培養(yǎng)基，即鼠ES培養(yǎng)基。
1.3鼠ES細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇ES細(xì)胞，用明膠預(yù)處理的培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞，37℃，5％CO2中培養(yǎng)24小時(shí)后換液，以后每24小時(shí)半量換液。接種ES時(shí)應(yīng)注意將ES細(xì)胞吹打成單個(gè)細(xì)胞，因?yàn)镋S細(xì)胞團(tuán)的存在可刺激細(xì)胞分化。
1.4驗(yàn)證采用偶氮偶聯(lián)法進(jìn)行堿性磷酸酶染色(AKP染色)。未分化ES細(xì)胞AKP陽(yáng)性(細(xì)胞染成蘭色)；分化細(xì)胞AKP陰性(細(xì)胞染成黃色)。
上述培養(yǎng)好的鼠ES細(xì)胞放在顯微鏡下觀(guān)察。
1.5 結(jié)果顯微鏡下觀(guān)察到上述ES細(xì)胞生長(zhǎng)均非常迅速，24～48h可觀(guān)察到有小的ES細(xì)胞集落形成，細(xì)胞體積小，核大，核漿比例大，細(xì)胞排列緊密。AKP染色陽(yáng)性。傳6代后仍能呈現(xiàn)集落生長(zhǎng)，AKP測(cè)定仍為陽(yáng)性。
鼠ES細(xì)胞集落生長(zhǎng)狀況如圖1所示。
實(shí)施例22.1 準(zhǔn)備以下材料2.1 準(zhǔn)備以下材料2.1.1 鼠胚胎干細(xì)胞系(mouse embryonic stem cell)由Robertson E.博士惠贈(zèng)。
2.1.2 大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清自備2.1.3 谷氨酰胺(L-glutamine，上海生工，Amresco產(chǎn)品分裝，LotNo.1490B40)。
2.1.4 Gibco公司Dulbecco`s Modified Eagle Medium(DMEM)高糖培養(yǎng)基2.1.5胎牛血清2.1.6 EDTA-胰蛋白酶2.1.7 0.1％明膠溶液明膠(gelatin，華美生物工程公司，Lot No.0205)用三蒸水稍加熱后配成0.1％，0.22μm濾膜過(guò)濾，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.1.8 堿性磷酸酶染色所用試劑萘酚AS-MX磷酸酯；二甲基甲酰胺購(gòu)自上海生工；2-氨基-2-甲基-1，3丙二醇，上海化學(xué)試劑公司進(jìn)口分裝；堅(jiān)牢藍(lán)RR，購(gòu)自Fluka公司。
2.1.9 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
2.1.10 15％FCS-DMEM，含白血病抑制因子1000unit/ml(recombinantmurine leukemia inhibitory factor，rmLIF，購(gòu)自Chemicon，LotNo.11161032；)2.2 制備方法按如下步驟2.2.1 大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清制備將2周齡的大鼠斷頸處死，，取出心臟，去除心包膜及血塊、結(jié)締組織，用磷酸鹽緩沖液(即PBS，pH調(diào)至7.4)洗滌，除去血液，剪碎。用0.02％-0.25％EDTA-胰蛋白酶在37℃消化15min，期間不斷輕輕振蕩，加入10倍量PBS進(jìn)行洗滌，1200轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄上清，將沉淀細(xì)胞及小組織塊移入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)心肌細(xì)胞培養(yǎng)液采用貼片法于37℃，5％CO2中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含15％胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM高糖培養(yǎng)基，終濃度為2mmol/L谷胺酰胺(glutamin)，PH7.2～7.4。此為第一代心肌細(xì)胞，記為G1，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至瓶底面積的70％～80％時(shí)，進(jìn)行傳代，記為G2，收集1-6代細(xì)胞的培養(yǎng)液，1200rpm離心8min，上清用0.22μm過(guò)濾，分裝，-30℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.2.2 培養(yǎng)板預(yù)處理 在24孔培養(yǎng)板中加入0.1％明膠溶液，以蓋滿(mǎn)孔底為宜，室溫中放置30min，吸棄明膠溶液，將培養(yǎng)板中殘留的溶液吹干，整個(gè)過(guò)程注意無(wú)菌操作。將培養(yǎng)板密封，備用，4℃可放置2周。這樣處理過(guò)的培養(yǎng)板會(huì)使細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)更貼壁。
2.2.3 能保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制，取大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清加入終濃度為3mmol/L谷胺酰胺，含量為10％的胎牛血清，含量為1000unit/ml的LIF混合，構(gòu)成培養(yǎng)基，即鼠ES培養(yǎng)基。
2.3 鼠ES細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇ES細(xì)胞，用明膠預(yù)處理的培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞，37℃，5％CO2中培養(yǎng)24小時(shí)后換液，以后隔天換液。接種ES時(shí)應(yīng)注意將ES細(xì)胞吹打成單個(gè)細(xì)胞，因?yàn)镋S細(xì)胞團(tuán)的存在可刺激細(xì)胞分化。
2.4 驗(yàn)證采用偶氮偶聯(lián)法進(jìn)行堿性磷酸酶染色(AKP染色)。未分化ES細(xì)胞AKP陽(yáng)性(細(xì)胞染成蘭色)；分化細(xì)胞AKP陰性(細(xì)胞染成黃色)。
上述培養(yǎng)好的鼠胚胎干細(xì)胞放在顯微鏡下觀(guān)察。
2.5 結(jié)果顯微鏡下觀(guān)察到上述ES細(xì)胞生長(zhǎng)均非常迅速，24～48h可觀(guān)察到有小的ES細(xì)胞集落形成，細(xì)胞體積小，核大，核漿比例大，細(xì)胞排列緊密。AKP染色陽(yáng)性。傳6代后仍能呈現(xiàn)集落生長(zhǎng)，AKP測(cè)定仍為陽(yáng)性。
鼠ES細(xì)胞集落生長(zhǎng)狀況如圖2、圖3所示。
實(shí)施例33.1 準(zhǔn)備以下材料3.1.1 鼠胚胎干細(xì)胞系(mouse embryonic stem cell)由Robertson E.博士惠贈(zèng)。
3.1.2 大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清自備3.1.3 非必需氨基酸(non-essential amino acids solution，Gibco公司，Lot No.1127865)3.1.4 Gibco公司Dulbecco`s Modified Eagle Medium(DMEM)高糖培養(yǎng)基3.1.5 胎牛血清3.1.6 0.1％明膠溶液明膠(gelatin，華美生物工程公司，Lot No.0205)用三蒸水稍加熱后配成0.1％，0.22μm濾膜過(guò)濾，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.1.7 堿性磷酸酶染色所用試劑萘酚AS-MX磷酸酯；二甲基甲酰胺購(gòu)自上海生工；2-氨基-2-甲基-1，3丙二醇，上?；瘜W(xué)試劑公司進(jìn)口分裝；堅(jiān)牢藍(lán)RR，購(gòu)自Fluka公司。
3.1.8 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
3.2 制備方法按如下步驟3.2.1 大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清制備將3周齡的大鼠斷頸處死，取出心臟，去除心包膜及血塊、結(jié)締組織，用磷酸鹽緩沖液(即PBS，pH調(diào)至7.4)洗滌，除去血液，剪碎。將小組織塊移入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)心肌細(xì)胞培養(yǎng)液采用貼片法于37℃，5％CO2中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含15％胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM高糖培養(yǎng)基，內(nèi)含終濃度為3mmol/L谷胺酰胺(glutamin)，PH7.2～7.4。此為第一代心肌細(xì)胞，記為G1，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至瓶底面積的70％～80％時(shí)，進(jìn)行傳代，記為G2，收集1-6代細(xì)胞的培養(yǎng)液，1200rpm離心8min，上清用0.22μm過(guò)濾，分裝，-30℃保存?zhèn)溆谩?br> 3.2.2培養(yǎng)板預(yù)處理 在24孔培養(yǎng)板中加入0.1％明膠溶液，以蓋滿(mǎn)孔底為宜，室溫中放置30min，吸棄明膠溶液，將培養(yǎng)板中殘留的溶液吹干，整個(gè)過(guò)程注意無(wú)菌操作。將培養(yǎng)板密封，備用，4℃可放置2周。這樣處理過(guò)的培養(yǎng)板會(huì)使細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)更貼壁。
3.2.3 能保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制，取大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清加入終濃度為0.1mmol/L非必需氨基酸，終濃度為20％的胎牛血清混合，構(gòu)成培養(yǎng)基，即鼠ES培養(yǎng)基。
3.3 鼠ES細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇ES細(xì)胞，用明膠預(yù)處理的培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞，37℃，5％CO2中培養(yǎng)24小時(shí)換液，以后隔天換液。接種ES時(shí)應(yīng)注意將ES細(xì)胞吹打成單個(gè)細(xì)胞，因?yàn)镋S細(xì)胞團(tuán)的存在可刺激細(xì)胞分化。
3.4 驗(yàn)證采用偶氮偶聯(lián)法進(jìn)行堿性磷酸酶染色(AKP染色)。未分化ES細(xì)胞AKP陽(yáng)性(細(xì)胞染成蘭色)；分化細(xì)胞AKP陰性(細(xì)胞染成黃色)。
上述培養(yǎng)好的鼠胚胎干細(xì)胞放在顯微鏡下觀(guān)察。
3.5 結(jié)果顯微鏡下觀(guān)察到上述ES細(xì)胞生長(zhǎng)均非常迅速，24～48h可觀(guān)察到有小的ES細(xì)胞集落形成，細(xì)胞體積小，核大，核漿比例大，細(xì)胞排列緊密。AKP染色陽(yáng)性。傳6代后仍能呈現(xiàn)集落生長(zhǎng)，AKP測(cè)定仍為陽(yáng)性。
實(shí)施例44.1 準(zhǔn)備以下材料4.1.1 鼠胚胎干細(xì)胞系(mouse embryonic stem cell)由Robertson E.博士惠贈(zèng)。
4.1.2 大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清自備4.1.3 谷氨酰胺(L-glutamine，上海生工，Amresco產(chǎn)品分裝，LotNo.1490B40)。
4.1.4 Gibco公司Dulbecco`s Modified Eagle Medium(DMEM)培養(yǎng)基4.1.5 胎牛血清4.1.6 2-巰基乙醇4.1.7 堿性磷酸酶染色所用試劑萘酚AS-MX磷酸酯；二甲基甲酰胺購(gòu)自上海生工；2-氨基-2-甲基-1，3丙二醇，上?；瘜W(xué)試劑公司進(jìn)口分裝；堅(jiān)牢藍(lán)RR，購(gòu)自Fluka公司。
4.1.8 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
4.2 制備方法按如下步驟4.2.1 大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清制備將3周齡的大鼠斷頸處死，取出心臟，去除心包膜及血塊、結(jié)締組織，用磷酸鹽緩沖液(即PBS，pH調(diào)至7.4)洗滌，除去血液，剪碎。將小組織塊移入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)心肌細(xì)胞培養(yǎng)液采用貼片法于37℃，5％CO2中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含15％胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基，內(nèi)含終濃度為4mmol/L谷胺酰胺(glutamin)，PH7.2～7.4。此為第一代心肌細(xì)胞，記為G1，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至瓶底面積的70％～80％時(shí)，進(jìn)行傳代，記為G2，收集1-6代細(xì)胞的培養(yǎng)液，1200rpm離心8min，上清用0.22μm過(guò)濾，分裝，-30℃保存?zhèn)溆谩?br> 4.2.2 能保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制，取大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清加入終濃度為0.1mmol/L非必需氨基酸，終濃度為20％的胎牛血清，終濃度為0.05mmol/L 2-巰基乙醇混合，構(gòu)成培養(yǎng)基，即鼠ES培養(yǎng)基。
4.3 鼠ES細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇ES細(xì)胞，用明膠預(yù)處理的培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞，37℃，5％CO2中培養(yǎng)24小時(shí)后換液，以后隔天換液。接種ES時(shí)應(yīng)注意將ES細(xì)胞吹打成單個(gè)細(xì)胞，因?yàn)镋S細(xì)胞團(tuán)的存在可刺激細(xì)胞分化。
4.4 驗(yàn)證采用偶氮偶聯(lián)法進(jìn)行堿性磷酸酶染色(AKP染色)。未分化ES細(xì)胞AKP陽(yáng)性(細(xì)胞染成蘭色)；分化細(xì)胞AKP陰性(細(xì)胞染成黃色)。
上述培養(yǎng)好的鼠胚胎干細(xì)胞放在顯微鏡下觀(guān)察。
4.5 結(jié)果顯微鏡下觀(guān)察到上述ES細(xì)胞生長(zhǎng)均非常迅速48h可觀(guān)察到有小的ES細(xì)胞集落形成，細(xì)胞體積小，核大，核漿比例大，細(xì)胞排列緊密。AKP染色陽(yáng)性。傳6代后仍能呈現(xiàn)集落生長(zhǎng)，AKP測(cè)定仍為陽(yáng)性。
實(shí)施例55.1 準(zhǔn)備以下材料5.1.1 鼠胚胎干細(xì)胞系(mouse embryonic stem cell)由Robertson E.博士惠贈(zèng)。
5.1.2 大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清自備5.1.3 谷氨酰胺(L-glutamine，上海生工，Amresco產(chǎn)品分裝，LotNo.1490B40)。
5.1.4 Gibco公司Dulbecco`s Modified Eagle Medium(DMEM)高糖培養(yǎng)基5.1.5 EDTA-胰蛋白酶5.1.6 0.1％明膠溶液明膠(gelatin，華美生物工程公司，Lot No.0205)用三蒸水稍加熱后配成0.1％，0.22μm濾膜過(guò)濾，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 5.1.7 堿性磷酸酶染色所用試劑萘酚AS-MX磷酸酯；二甲基甲酰胺購(gòu)自上海生工；2-氨基-2-甲基-1，3丙二醇，上?；瘜W(xué)試劑公司進(jìn)口分裝；堅(jiān)牢藍(lán)RR，購(gòu)自Fluka公司。
5.1.8 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
5.2 制備方法按如下步驟5.2.1 大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清制備將2周齡的大鼠斷頸處死，用75％酒精浸泡10分鐘，取出心臟，去除心包膜及血塊、結(jié)締組織，用磷酸鹽緩沖液(即PBS，pH調(diào)至7.4)洗滌，除去血液，剪碎。用0.02％-0.25％EDTA-胰蛋白酶在37℃消化15min，期間不斷輕輕振蕩，加入10倍量PBS進(jìn)行洗滌，1200轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄上清，將沉淀細(xì)胞及小組織塊移入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)心肌細(xì)胞培養(yǎng)液采用貼片法于37℃，5％CO2中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含15％胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM高糖培養(yǎng)基，內(nèi)含終濃度為2mmol/L谷胺酰胺(glutamin)，PH7.2～7.4。此為第一代心肌細(xì)胞，記為G1，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至瓶底面積的70％～80％時(shí)，進(jìn)行傳代，記為G2，收集1-6代細(xì)胞的培養(yǎng)液，1200rpm離心8min，上清用0.22μm過(guò)濾，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 5.2.2 培養(yǎng)板預(yù)處理 在24孔培養(yǎng)板中加入0.1％明膠溶液，以蓋滿(mǎn)孔底為宜，室溫中放置30min，吸棄明膠溶液，將培養(yǎng)板中殘留的溶液吹干，整個(gè)過(guò)程注意無(wú)菌操作。將培養(yǎng)板密封，備用，4℃可放置2周。這樣處理過(guò)的培養(yǎng)板會(huì)使細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)更貼壁。
5.2.3 能保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制，取收集的大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清直接作為鼠ES培養(yǎng)基。
5.3 鼠ES細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇ES細(xì)胞，用明膠預(yù)處理的培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞，37℃，5％CO2中培養(yǎng)24小時(shí)后換液，以后隔天換液。接種ES時(shí)應(yīng)注意將ES細(xì)胞吹打成單個(gè)細(xì)胞，因?yàn)镋S細(xì)胞團(tuán)的存在可刺激細(xì)胞分化。
5.4 驗(yàn)證采用偶氮偶聯(lián)法進(jìn)行堿性磷酸酶染色(AKP染色)。未分化ES細(xì)胞AKP陽(yáng)性(細(xì)胞染成蘭色)；分化細(xì)胞AKP陰性(細(xì)胞染成黃色)。
上述培養(yǎng)好的鼠胚胎干細(xì)胞放在顯微鏡下觀(guān)察。
5.5 結(jié)果顯微鏡下觀(guān)察到上述ES細(xì)胞生長(zhǎng)均非常迅速，24～48h可觀(guān)察到有小的ES細(xì)胞集落形成，細(xì)胞體積小，核大，核漿比例大，細(xì)胞排列緊密。AKP染色陽(yáng)性。
權(quán)利要求
1.一種大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清的用途，其特征在于所述大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清用作保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基。
2.一種保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基，其特征在于所述的培養(yǎng)基含有大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清及培養(yǎng)基輔料。
3.如權(quán)利要求2所述的保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基，其特征在于所述的培養(yǎng)基為大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清和下式之一或下式兩者的組合物。①終濃度為1～4mmol/L谷胺酰胺②終濃度為0.1mmol/L非必需氨基酸
4.如權(quán)利要求3所述的保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基，其特征在于所述的培養(yǎng)基還含有終濃度為0.05mmol/L 2-巰基乙醇。
5.如權(quán)利要求3或4所述的保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基，其特征在于所述的培養(yǎng)基還含有10％～20％的胎牛血清。
6.如權(quán)利要求5所述的保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基，其特征在于所述的培養(yǎng)基還含有終濃度為1000單位/ml的LIF。
7.如權(quán)利要求1-4之一所述的能保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基，其特征在于所述的大鼠采用2～3周齡。
8.如權(quán)利要求7所述的保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基，其特征在于所述大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清為1～6代大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清。
9.一種用于制備如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于所述的大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清的制備方法按如下順序進(jìn)行a.取清潔級(jí)SD大鼠，處死，取心臟，去除心包膜及血塊、結(jié)締組織，洗滌，剪碎；b.將小組織塊移入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10％～20％牛血清的DMEM培養(yǎng)基，內(nèi)含終濃度1～4mmol/L谷胺酰胺，PH7.2～7.4；此為第一代心肌細(xì)胞，記為G1，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至瓶底面積的70％～80％時(shí)，進(jìn)行傳代，記為G2，如此傳代，收集各代心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清，于-20℃～-30℃冷藏，備用。
10如權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于所述的大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清的制備方法在步驟a后增加消化步驟m.處理好的心臟剪碎物用0.02％～0.25％EDTA-胰蛋白酶在37℃消化15min，期間不斷輕輕振蕩、洗滌，離心，棄上清，保留沉淀細(xì)胞及小組織塊。
11.如權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于所述的牛血清為胎牛血清。
12.如權(quán)利要求9-11之一所述的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于所述洗滌用無(wú)鈣鎂的緩沖液洗滌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清的用途，大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清用作保持鼠胚胎干細(xì)胞不分化而增殖的培養(yǎng)基及其制備方法。大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清既可單獨(dú)作鼠胚胎干細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基，也可與培養(yǎng)基輔料組配成組合物作為鼠胚胎干細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供了這種培養(yǎng)基的制備方法。用本發(fā)明培養(yǎng)鼠胚胎干細(xì)胞(鼠ES細(xì)胞)，使鼠ES細(xì)胞在體外培養(yǎng)保持不分化而增殖，效果比白血病抑制因子(LIF)好。本發(fā)明取材于大鼠心肌細(xì)胞，成本低，且制備簡(jiǎn)單，在促進(jìn)ES細(xì)胞貼壁、增值、克隆形成等方面優(yōu)于LIF。
文檔編號(hào)C12N5/00GK1570086SQ0314172
公開(kāi)日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2003年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月18日
發(fā)明者李蘭娟, 曹紅翠 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院, 李蘭娟, 曹紅翠