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濁點系統(tǒng)在生物轉化中的應用的制作方法

文檔序號:420939閱讀:811來源:國知局
專利名稱:濁點系統(tǒng)在生物轉化中的應用的制作方法
技術領域
本發(fā)明屬于微生物技術領域。具體涉及濁點系統(tǒng)在生物轉化中的應用。
背景技術
微生物轉化疏水性化合物常受到一些因素的嚴重制約底物在水中的溶解度很小,限制了其生物利用度和產(chǎn)物/底物對微生物的抑制和毒害作用。這些問題在生物降解有毒污染物時也經(jīng)常遇到。介質工程就是在轉化介質中加入具有生物相容性但本身不生物降解的組分以減輕或排除這些限制。因而有機溶劑兩相系統(tǒng)、雙水相系統(tǒng)、脂質體系統(tǒng)、膠束系統(tǒng)、油包水型微觀乳濁液或反膠束系統(tǒng)等新型介質系統(tǒng)不斷引入。
非離子表面活性劑膠束溶液,在溫度高于其濁點或有誘導物存在的條件下,會自動分相形成表面活性劑稀相和富含表面活性劑的凝聚層相,常稱為濁點系統(tǒng)(cloud point system,CPS)。濁點系統(tǒng)在分離技術中的應用已有多年。這一相系統(tǒng)具有易于控制、放大可靠、操作簡單等優(yōu)點而倍受青睞。尤其,該“系統(tǒng)”具有含水率高、條件溫和的優(yōu)點,不會損害引入的細胞和蛋白質等生物物質而受到生物分離工作者的重視。CPS應該具有較好的生物相容性。底物、產(chǎn)物可在兩相中實現(xiàn)不同的分配,基于兩相系統(tǒng)的微生物轉化可能排除潛在的產(chǎn)物、底物抑制或毒害。另外,如果產(chǎn)物和細胞能在不同相中分配就可通過萃取分離細胞以替代常規(guī)的機械分離。表面活性劑膠束溶液具有增溶作用,能顯著地增加疏水性物質的表觀溶解度,由此增強其生物利用度,刺激微生物轉化。盡管可能有如此多優(yōu)點,但濁點系統(tǒng)作為轉化介質還未見文獻報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于設計濁點系統(tǒng)的新應用。
本發(fā)明提供了濁點系統(tǒng)在生物轉化中的新應用,即采用一種或一種以上非離子表面活性劑形成濁點低于微生物轉化培養(yǎng)溫度的水溶液系統(tǒng)即濁點系統(tǒng),作為微生物轉化的介質。
本發(fā)明所述的非離子表面活性劑選自聚氧乙烯醇類、聚氧乙烯醚類或辛基酚聚氧乙烯類表面活性劑。
其中所述的聚氧乙烯醇類包括Brij30,Brij35,Brij56或C12E7;聚氧乙烯醚類包括Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、Span20、Span40、Span60或Span80;辛基酚聚氧乙烯類包括Triton X-100或Triton X-114。
本發(fā)明公開的濁點系統(tǒng)特別適用于1.疏水性化合物的微生物轉化;2.底物、產(chǎn)物抑制微生物生長;3.產(chǎn)物被微生物進一步降解;如膽固醇邊鏈的切除、甾體化合物轉化、有機污染沉淀物的降解等。
本發(fā)明以膽固醇的微生物邊鏈切除為模型,進一步說明篩選適當?shù)臐狳c系統(tǒng)作為介質工程的新方法。
膽固醇經(jīng)微生物邊鏈切除生成甾體藥物的重要中間體ADD是生物轉化疏水性化合物的典型例子。首先,膽固醇是典型的疏水性化合物,其在水中的溶解度常在1μM以下,而一般的甾體在0.01~0.1mM之間。其次,這一轉化的底物和產(chǎn)物對微生物都有毒害作用。
該轉化方法設計包括下列步驟(1)選擇表面活性劑表1 非離子表面活性劑的基本性質非離子表面結構通式*疏水基團 CMCHLBCP活性劑 (mM) (℃)聚氧乙烯醇Brij30 C12E4十二(烷)醇 0.02-0.069.54
C12E7十二(烷)醇 0.07 12.5 65Brij35 C12E23十二(烷)醇 0.09 16.9 >100Brij56 C16E10鯨脂 12.9 64-69聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯Span 20 C12S6十二(烷)酸 8.6Span 40 C16S6十六(烷)醛 6.7Span 60 C18S6十八酸 4.7Span 80 C18S6十八烯酸 4.3Tween 20C12S6E20十二(烷)酸0.04-0.0616.7Tween 40C16S6E20十六(烷)醛 29a 15.6Tween 60C18S6E20十八酸 27a 14.9Tween 80C18S6E20十八烯酸 0.01-0.0215乙醇酚乙氧基化物Triton X-100 C8ΦE9-10辛基苯酚0.2 13.5 64Triton X-114 C8ΦE7-8辛基苯酚0.3 12.8 22*S6表示山梨聚糖環(huán);En表示乙撐氧基團的數(shù)量;Cn表示烴基鏈中的碳原子數(shù);Φ表示酚環(huán).a表示mg/L。
選擇了三類非離子表面活性劑中的14種表面活性劑進行篩選。其基本性質如表1所示。聚氧乙烯醇(Brij30,Brij35,F(xiàn)luka;Brij56,C12E7,上海助劑廠)。聚氧乙烯醚(Tween20,Tween40,Tween60,Tween80,Span20,Span40,Span60,Span80,上海試劑有限公司)。辛基酚聚氧乙烯(Triton X-100,上海試劑有限公司;Triton X-114,F(xiàn)luka)。
(2)微生物轉化微生物菌種Mycobacterium sp.NRRL B 3683。它能實現(xiàn)膽固醇的變鏈切除,生成產(chǎn)物ADD和4-AD,其比例為10∶1。
培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基(100ml)0.5g酵母浸出膏,1.2g瓊脂粉,1g甘油,0.05g H2HPO4,0.1g (NH4)2SO4,0.05g MgSO4·7H2O;種子培養(yǎng)基(100ml)0.5g(NH4)2SO4,0.45g Na2HPO4,0.34gKH2PO4,0.05g MgSO4·7H2O,1.0g甘油,0.2g膽固醇,0.2g TritonX-100;轉化培養(yǎng)基(100ml)1.0g(NH4)2SO4,0.45g Na2HPO4,0.34gKH2PO4,0.2g MgSO4·7H2O,0.5g膽固醇,2.0g非離子表面活性劑。
微生物培養(yǎng)微生物在28℃、220rpm、20/250ml裝量條件下有氧活化培養(yǎng)3天,取活化種子按1∶10比例在裝量為22/250ml條件下轉化培養(yǎng)7天。取轉化培養(yǎng)液分析。
本發(fā)明的轉化分析試驗報告如下1.HPLC取1ml轉化液用4ml甲醇浸泡2hr。離心后取0.8ml上清進行HPLC分析。用Hypersil C18柱,流動相為甲醇∶水(4∶1),流速為0.7ml/min,檢測波長為254nm測得的AAD和4-AD結果如圖1所示。
2.TLC底物和產(chǎn)物在CPS中的分配用TLC分析來確定。TLC在Silicagel 60 F254(Merck)高效薄層層析板上進行。氯仿∶乙醚(1∶3)為展層劑,磷鉬酸溶液中浸泡、烘干,加熱顯色,底物和產(chǎn)物(ADD、4-AD)可分開。ADD、4-AD、膽固醇的Rf值分別為0.42,0.47,0.67。
3.濁點測定濁點測定采用目測法觀察溶液變渾濁時的溫度。緩慢升高溶液溫度,記下溶液變混濁時的溫度,然后緩慢降低溶液溫度,記下溶液澄清時的溫度。取兩者的平均值作為濁點。
4.增溶測定按Triton X-100和Triton X-114的不同比例配制表面活性劑濃度為2%的過飽和ADD溶液。溶液置具塞玻璃容器,在220rpm、28℃的條件下震蕩72hr。膜濾(膜孔徑為20μm,上海醫(yī)藥工業(yè)研究院生產(chǎn))后用HPLC進行ADD的定量分析。
結果與分析(1)非離子表面活性劑篩選選擇合適的介質進行微生物轉化,介質生物相容性或對微生物潛在的毒性是篩選轉化介質的前提。介質的潛在毒性可用微生物在含表面活性劑的轉化介質轉化產(chǎn)生ADD的最終產(chǎn)物濃度來表征。圖2是不同表面活性劑溶液的轉化結果。
在高表面活性劑濃度下,只有Triton X-114在微生物轉化條件下形成能CPS,其ADD的最終產(chǎn)物濃度最高。和Triton X-114同一系列的表面活性劑(Triton X-100)不具有生物相容性。說明濁點系統(tǒng)是使表面活性劑的生物相容性得到改善的原因。
(2)CPS生物相容性和提高生物利用度的機理濁點系統(tǒng)發(fā)生相分離后,直接在稀相和凝聚層相加入油溶性染料(蘇丹黑B)染色后在顯微鏡下觀察,結果如圖3所示。圖3為CPS稀相和凝聚層相的顯微觀察。在稀相,小的表面活性劑液滴或膠束因染有染料而顯黑色。這是水包油微觀乳濁液。在凝聚層相,形成油包水的微觀乳濁液。黑色的背景表示連續(xù)的表面活性劑相,它相當于底物的儲藏庫和產(chǎn)物的萃取劑。在連續(xù)的表面活性劑相中存在大的水泡,這為細胞提供了水環(huán)境。它相當于一個微反應器,使細胞屏蔽于表面活性劑而免受其毒害作用。細胞在表面活性劑介質中的生物相容性得到改善。在凝聚層相的水泡中有同CPS的稀相類似的結構,存在水包油微觀乳濁液。物質交換可發(fā)生于表面活性劑液滴之間、水泡之間、連續(xù)相和非連續(xù)相之間等相界面處。液滴的聚并更加快了物質交換。這使在水中溶解度很小的疏水性化合物的生物利用度得到提高。
通過TLC分析,底物和產(chǎn)物在CPS中的分配如圖4所示。圖4為濁點系統(tǒng)中底物、產(chǎn)物的分配。底物基本上濃縮于凝集層相。凝集層相對底物優(yōu)良的溶解能力有利于底物的溶解。ADD和底物相似也分配于凝集層相。細胞在兩相的分配采用血球計數(shù)法(hemocytometermethod)測定。其凝聚層相和稀相的分配系數(shù)大概為10,表明Mycobacterium sp.的表面是疏水的。這和文獻報道稱Mycobacterium是所謂的疏水性微生物一致。
(3)強化CPS的增溶能力混和系統(tǒng)的濁點如圖2所示,只有Triton X-114的膠束溶液,其濁點低于微生物轉化的培養(yǎng)溫度而形成兩相表現(xiàn)出良好的生物相容性。表面活性劑溶液的濁點和增溶能力可通過添加不同表面活性劑互配形成混和表面活性劑膠束溶液來調節(jié)。為了強化CPS的增溶能力,選用TritonX-100形成混和表面活性劑膠束溶液。如圖5所示,圖5為混合系統(tǒng)的濁點。當Triton X-100所占的質量分率高于20%時,系統(tǒng)的濁點高于微生物的轉化培養(yǎng)溫度(28℃)。轉化培養(yǎng)基中的主要成分對系統(tǒng)的濁點影響都很小。微生物轉化產(chǎn)物ADD能明顯地降低混和系統(tǒng)的濁點,有可能使混和系統(tǒng)的濁點降低到培養(yǎng)溫度以下,混和系統(tǒng)由一相變成兩相。
混和系統(tǒng)的增溶能力混和表面活性劑膠束溶液對ADD的增溶能力隨Triton X-114的質量分率的變化如圖6所示。圖6為混和表面活性劑系統(tǒng)的增溶能力。從純表面活性劑溶液的增溶能力可以看出Triton X-100的增溶能力優(yōu)于Triton X-114。當Triton X-114的質量分率低于50%時,混和系統(tǒng)的增溶能力隨Triton X-114含量的增加而降低。但在Triton X-114的質量分率達到70%時,混和系統(tǒng)對ADD的增溶能力出現(xiàn)最大值。如圖3所示,在CPS中,凝聚層相中表面活性劑的存在形式完全不同于表面活性劑膠束溶液中的膠束結構。這表明表面活性劑膠束溶液的增溶能力強烈地受濁點影響。由圖5可知,底物和產(chǎn)物ADD在CPS中的兩相有相同的分配規(guī)律。由ADD的增溶數(shù)據(jù),我們可以推斷底物也應該具有相似的增溶規(guī)律。
混和系統(tǒng)的微生物轉化經(jīng)微生物轉化7天后具有不同Triton X-114的質量分率的混和轉化系統(tǒng)的分相行為和ADD的產(chǎn)率如圖7所示。圖7為相分離的產(chǎn)物隨混和系統(tǒng)中表面活性劑質量分率的變化。只有Triton X-100的質量分率低于50%時相分離才會發(fā)生。ADD的最終產(chǎn)物濃度不但比純Triton X-100系統(tǒng)的高而且比純Triton X-114系統(tǒng)的高。ADD的最終產(chǎn)物濃度隨Triton X-114質量分率的變化與系統(tǒng)對ADD的增溶結果具有類似的變化趨勢,且都在Triton X-114質量分率為70%時出現(xiàn)最大值。混和系統(tǒng)中高ADD產(chǎn)率可歸因于系統(tǒng)中表面活性劑的增溶能力,它強化了底物的溶解,增加了其生物利用度。同時萃取了產(chǎn)物,解除了產(chǎn)物的抑制。
本發(fā)明在Triton X-100和Triton X-114組成的CPS實現(xiàn)了膽固醇邊鏈切除生成甾體藥物的重要中間體ADD的微生物轉化。在這一系統(tǒng)中,形成了油包水和水包油的微觀乳濁液。表面活性劑液滴具有增溶能力,充當著底物的儲藏庫和產(chǎn)物的萃取劑。強化了底物的生物利用度,排除了產(chǎn)物的抑制。連續(xù)的表面活性劑中存在水泡,相當于一個微反應器,能使微生物免受表面活性劑的毒害作用。而且,CPS的增溶能力可由混合表面活性劑來調節(jié)。所有這些表明,CPS是介質工程中有前途的方法。


圖-1 ADD和4-AD的HPLC譜2在不同表面活性劑轉化介質中ADD的濃度圖3 CPS稀相和凝聚層相的顯微觀察A.凝聚層相,油/水乳濁液,×40倍.
B.凝聚層相中的水泡,水/油乳濁液,×600倍C.稀相,水/油乳濁液,×600倍圖4濁點系統(tǒng)中底物、產(chǎn)物的分配1.標準品;2.稀相;3.凝聚層相圖5混和系統(tǒng)的濁點100ml2.0g非離子表面活性劑(□);1.0g(NH4)2SO4,0.45gNa2HPO4,0.34g KH2PO4,0.2g MgSO4·7H2O,2.0g非離子表面活性劑(◇);1.0g(NH4)2SO4,0.45g Na2HPO4,0.34g KH2PO4,0.2gMgSO4·7H2O,0.1g膽固醇,2.0g非離子表面活性劑(△);1.0g(NH4)2SO4,0.45g Na2HPO4,0.34g KH2PO4,0.2g MgSO4·7H2O,0.1g ADD,2.0g非離子表面活性劑(O).
圖6混和表面活性劑系統(tǒng)的增溶能力圖7相分離和產(chǎn)物隨混和系統(tǒng)中表面活性劑質量分率的變化
具體實施例方式
實施例1微生物轉化微生物菌種Mycobacterium sp.NRRL B 3683它能實現(xiàn)膽固醇的變鏈切除,生成產(chǎn)物ADD和4-AD,其比例為10∶1。
培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基(100m1)0.5g酵母浸出膏,1.2g瓊脂粉,1g甘油,0.05g H2HPO4,0.1g(NH4)2SO4,0.05g MgSO4·7H2O;種子培養(yǎng)基(100ml)0.5g(NH4)2SO4,0.45g Na2HPO4,0.34gKH2PO4,0.05g MgSO4·7H2O,1.0g甘油,0.2g膽固醇,0.2g TritonX-100;轉化培養(yǎng)基(100ml)1.0g(NH4)2SO4,0.45g Na2HPO4,0.34gKH2PO4,0.2g MgSO4·7H2O,1.45g膽固醇,10.0g混合Triton X-100和Triton X-114(1∶1)微生物培養(yǎng)微生物在28℃、220rpm、 20/250ml裝量條件下有氧活化培養(yǎng)3天,取活化種子按1∶10比例在裝量為22/250ml條件下轉化培養(yǎng)7天。取轉化培養(yǎng)液分析。
結果ADD和4-AD(10∶1)的濃度為10g/L,轉化率為93%(摩爾轉化率)。
實施例2微生物轉化微生物菌種Mycobacterium sp.NRRL B 3683,它能實現(xiàn)膽固醇的變鏈切除,生成產(chǎn)物ADD和4-AD,其比例為10∶1。
培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基(100ml)0.5g酵母浸出膏,1.2g瓊脂粉,1g甘油,0.05g H2HPO4,0.1g(NH4)2SO4,0.05g MgSO4·7H2O;
種子培養(yǎng)基(100ml)0.5g(NH4)2SO4,0.45g Na2HPO4,0.34gKH2PO4,0.05g MgSO4·7H2O,1.0g甘油,0.2g混合植物甾醇,0.2gTriton X-100;轉化培養(yǎng)基(100ml)1.0g(NH4)2SO4,0.45g Na2HPO4,0.34gKH2PO4,0.2g MgSO4·7H2O,2.0g混合植物甾醇,10.0g混合TritonX-100和Triton X-114(1∶1)微生物培養(yǎng)微生物在28℃、220rpm、20/250ml裝量條件下有氧活化培養(yǎng)3天,取活化種子按1∶10比例在裝量為22/250ml條件下轉化培養(yǎng)7天。取轉化培養(yǎng)液分析。
結果ADD和4-AD(10∶1)的濃度為8.2g/L,轉化率為76%(摩爾轉化率)。
實施例3微生物轉化微生物菌種Mycobacterium sp.NRRL B 3683,它能實現(xiàn)膽固醇的變鏈切除,生成產(chǎn)物ADD和4-AD,其比例為10∶1。
培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基(100ml)0.5g酵母浸出膏,1.2g瓊脂粉,1g甘油,0.05g H2HPO4,0.1g(NH4)2SO4,0.05g MgSO4·7H2O;種子培養(yǎng)基(100ml)0.5g(NH4)2SO4,0.45g Na2HPO4,0.34gKH2PO4,0.05g MgSO4·7H2O,1.0g甘油,0.2g膽固醇,0.2g TritonX-100;轉化培養(yǎng)基(100ml)1.0g(NH4)2SO4,0.45g Na2HPO4,0.34gKH2PO4,0.2g MgSO4·7H2O,2.0g膽固醇,10.0g混合Triton X-1148ml。
微生物培養(yǎng)微生物在28℃、220rpm、20/250ml裝量條件下有氧活化培養(yǎng)3天,取活化種子按1∶10比例在裝量為22/250ml條件下轉化培養(yǎng)7天。取轉化培養(yǎng)液分析。
結果ADD和4-AD(10∶1)的濃度為6.45g/L,轉化率為60%(摩爾轉化率)。
權利要求
1.一種濁點系統(tǒng)在生物轉化中的應用方法,其特征在于該方法采用一種或一種以上非離子表面活性劑形成濁點低于微生物轉化培養(yǎng)溫度的水溶液系統(tǒng),作為微生物轉化的介質。
2.根據(jù)權利要求1所述的濁點系統(tǒng)在生物轉化中的應用方法,其特征在于其中所述的非離子表面活性劑為聚氧乙烯醇類、聚氧乙烯醚類或辛基酚聚氧乙烯類表面活性劑。
3.根據(jù)權利要求2所述的濁點系統(tǒng)在生物轉化中的應用方法,其特征在于其中所述的聚氧乙烯醇類包括Brij30,Brij35,F(xiàn)luka,Brij56或C12E7;聚氧乙烯醚類包括Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、Span20、Span40、Span60或Span80;辛基酚聚氧乙烯類包括TritonX-100或Triton X-114。
4.根據(jù)權利要求1所述的濁點系統(tǒng)在生物轉化中的應用方法,其特征在于其中所述的微生物轉化是指疏水性化合物的微生物轉化,或底、產(chǎn)物抑制微生物生長,或產(chǎn)物被微生物進一步降解。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物技術領域。本發(fā)明公開了濁點系統(tǒng)在生物轉化中應用的方法,即采用一種或一種以上非離子表面活性劑形成濁點低于微生物轉化培養(yǎng)溫度的水溶液系統(tǒng)即濁點系統(tǒng),作為微生物轉化的介質。該系統(tǒng)特別適用于疏水性化合物的微生物轉化,能解除底、產(chǎn)物抑制,排除產(chǎn)物降解。本發(fā)明濁點系統(tǒng)形成了油包水和水包油的微觀乳濁液,表面活性劑液滴具有增溶能力,充當著底物的儲藏庫和產(chǎn)物的萃取劑,強化了底物的生物利用度,排除了產(chǎn)物的抑制。連續(xù)的表面活性劑中存在水泡,相當于一個微反應器,能使微生物免受表面活性劑的毒害作用,從而提高了生物相容性。
文檔編號C12N1/38GK1483815SQ0314211
公開日2004年3月24日 申請日期2003年8月7日 優(yōu)先權日2003年8月7日
發(fā)明者王志龍, 陳代杰, 戈梅, 金一平, 葉偉東 申請人:上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責任公司, 上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責
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