專利名稱：：二酸(5－雄甾烯－17－酮－3β羥基)酯用于制備藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯(式I)在制藥中的應(yīng)用。由于生活水平的提高和醫(yī)療保健的不斷進(jìn)步，人均壽命越來越長，使世界人口老齡化的趨勢越來越明顯。據(jù)中國老年協(xié)會(huì)專家指出，我國老年人口迅速增長，1990年以來，我國老年人口以平均每年3.32％的速度增長，到1994年底，全國60歲以上老年人口總數(shù)已達(dá)到1.1億，約占人口總數(shù)的9.5％。預(yù)計(jì)到本世紀(jì)末，我國將成為“老年型”國家。隨著老年人口增加，對(duì)老年性疾病的防治問題也越來越突出。因此，研制開發(fā)新的抗衰老及防治常見老年性疾病的新藥，已成為當(dāng)今醫(yī)藥學(xué)界的一個(gè)研究熱點(diǎn)。記憶力衰退、心腦血管疾病(如高血脂癥、高膽固醇癥、動(dòng)脈硬化等)、肥胖癥和糖尿病等是常見的老年性疾病，而且許多情況下是多種病癥同時(shí)出現(xiàn)于同一病人身上。但是，現(xiàn)有的治療這些疾病的藥物普遍存在著適用癥單一、療效不盡理想的問題。因此，研究開發(fā)一種對(duì)上述多種老年性疾病具有良好的綜合治療效果的藥物，這對(duì)方便老年性疾病的防治、保證老年人健康將具有十分重要的意義。本發(fā)明的目的是研究提供二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯(以下簡稱為式I化合物，其結(jié)構(gòu)如式I所示)用于制備藥物。該化合物對(duì)上述多種常見老年性疾病均具有良好的治療效果。式I中R′為n＝2-5，n′＝1-4即式I化合物依R′基團(tuán)的不同可分為兩類，一類為二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯(以下簡稱為式IA類化合物)，具體可以是乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯或丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯或丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯或戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯；另一類為二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯(以下簡稱為式IB類化合物)，具體可以是丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯或丁二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯或己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯。本發(fā)明包括式I化合物在制備用于治療高血脂癥、高膽固醇癥及肥胖癥的藥物中的應(yīng)用；式I化合物在制備用于降低病人血漿血小板聚集率以及抗血栓形成和抗動(dòng)脈硬化的藥物中的應(yīng)用；式I化合物在制備用于治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用；式I化合物在制備用于增強(qiáng)記憶力及治療記憶力衰退的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的式I化合物最優(yōu)選的是己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯(式II)。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明中的式I化合物在降血脂、降膽固醇、抗血小板聚集、抗血栓形成、抗動(dòng)脈硬化、降血糖以及增強(qiáng)和恢復(fù)記憶力等方面具有顯著的效果，由此可知，以式I化合物作為活性成份制備的藥物，將對(duì)相應(yīng)的病癥具有良好的治療效果，特別是對(duì)心血管疾病、糖尿病及記憶力衰退等常見的老年性疾病具有良好的綜合治療效果。實(shí)驗(yàn)還證明式I化合物具有低毒性和高安全性，適宜作為藥物應(yīng)用。本發(fā)明的式I化合物用于制備藥物，可與普通常規(guī)的藥劑填充劑配合，經(jīng)常規(guī)方法而制得；可根據(jù)需要制成適當(dāng)?shù)膭┬?，如片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、糖漿劑或溶液劑等。以式I化合物為活性成份的藥物，通常以口服方式使用，當(dāng)然也可以采用其它給藥方式；其每天使用劑量一般為約0.1～1000毫克，成年人常用量為每天1～500毫克，最常用劑量為5～300毫克。每天一次或分?jǐn)?shù)次服用。本發(fā)明中的式IA類化合物可由5-雄甾烯-17-酮-3-磺酸鈉(式III)溶于乙二醇二甲醚中，加入二鹵代烷〔二碘(或溴)乙(或丙、丁、戊)烷〕(式IV)，在相轉(zhuǎn)移劑(四正丁基溴化銨)存在下反應(yīng)而制得。其反應(yīng)過程示意如下x＝I或Br，n＝2～5，R＝C19H27O式IV中n與式I中的n相同。本發(fā)明中的式IB類化合物可由3-羥基-5-雄甾烯-17-酮(式V)與相應(yīng)的二酰氯(即丙、丁、戊或己二酰氯)(式VI)在吡啶中室溫?cái)嚢璺磻?yīng)制得。其反應(yīng)過程示意如下2R-OH(式V)+XCO(CH2)n′OCX(式VI)吡啶↓攪拌R＝C19H27O，n′＝1-4，X＝Cl以下通過實(shí)例對(duì)式I化合物的制備方法作進(jìn)一步詳細(xì)說明制備實(shí)例1稱取3.68g5-雄甾烯-17-酮-3β-磺酸鈉鹽溶于50ml乙二醇二甲醚中，加入1.5g1，2-二碘乙烷及1.6g四正丁基溴化銨和20ml水，于60℃攪拌回流反應(yīng)4小時(shí)，得到的混合物冷卻后用乙醚萃取三次，合并萃取液，用水洗，再用無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，得到6.1g所需產(chǎn)物-乙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯(式II)。若分別用1，3-二碘丙烷或1，4二碘丁烷、1，5二碘戊烷代替上述實(shí)例1中的1，2-二碘乙烷，則最后得到的產(chǎn)物即分別為丙二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯或丁二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯或戊二醇二磺酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯。制備實(shí)例2；稱取2.88g3β-羥基-5-雄甾烯-17-酮溶于500ml吡啶溶液中，滴加入0.92g己二酰氯，室溫下攪拌反應(yīng)，TLC檢驗(yàn)反應(yīng)基本完成后，將反應(yīng)混合物傾入冰水中，用乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，依次用稀酸、水、冷飽和碳酸氫鈉洗，用無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑得式II化合物粗品，硅膠H柱層析得式II化合物純品2.1g。若分別用丙二酰氯、丁二酰氯或戊二酰氯代替上述實(shí)例2中的己二酰氯，則最后得到的產(chǎn)物即分別為丙二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯、丁二酸(5-雄甾烯-17酮-3β-羥基)酯或戊二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯。圖1是測定小鼠記憶力(實(shí)驗(yàn)實(shí)例5)所用的水迷宮結(jié)構(gòu)示意圖。下列實(shí)驗(yàn)實(shí)例將進(jìn)一步說明本發(fā)明的式I化合物的醫(yī)藥用途及其效果。實(shí)驗(yàn)實(shí)例2～5中的式I化合物均為己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯(式II)。實(shí)驗(yàn)實(shí)例1式I化合物急性毒性實(shí)驗(yàn)一、材料實(shí)驗(yàn)樣品式I化合物(8種，式IA類，n＝2，3，4，5；式IB類，n＝1，2，3，4)，由廣州時(shí)珍堂天然產(chǎn)物生理活性研究中心提供，批號(hào)分別為19960101，19960102，19960103，19960104，19960105，19960106，19960107，19960108。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；NIH系小鼠，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，批號(hào)95A50二、方法與結(jié)果八種式I化合物分別按以下方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)選擇健康NIH系小鼠，體重20+2g，20只，雄雌各半，將式I化合物以1％羧甲基纖維素鈉配成20mg/ml懸浮液，對(duì)小鼠一次灌胃式I化合物懸浮液0.8ml/20g體重，連續(xù)觀察七天，小鼠活動(dòng)敏捷，毛皮光滑，未引起死亡或異常反應(yīng)，限于給藥濃度和體積不能再增大，不能測出其LD50。故進(jìn)行最大耐受量試驗(yàn)。選擇健康小鼠20只，雌雄各半，于24小時(shí)內(nèi)分3次灌服式I化合物懸浮液(20mg/ml)，每次0.5mg/20g體重，總劑量達(dá)1.5g/kg體重。觀察7天，此期間讓小鼠自由進(jìn)食和飲水，小鼠活動(dòng)敏捷，毛皮光滑，未引起死亡或?qū)С７磻?yīng)。三、結(jié)論1、小鼠每天對(duì)式I化合物最大耐受量應(yīng)不小于0.5×3×20×50＝1.5g/kg2、按體表面積換算，相當(dāng)于70kg成年人用量(50mg)的232.7倍(0.5×3×20×387.9÷50)由此可知，式I化合物對(duì)人體服用安全。實(shí)驗(yàn)實(shí)例2式I化合物對(duì)大鼠高血脂模型形成的抑制作用一、實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)樣品式I化合物，由廣州時(shí)珍堂天然產(chǎn)物生理活性研究中心提供，批號(hào)19960108。陽性對(duì)照藥LIPANTAYL(力平脂)，法國科尼大藥廠生產(chǎn)，批號(hào)104940499實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD系健康雄性大白鼠，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，合格書檢證號(hào)96A02。實(shí)驗(yàn)試劑膽固醇試劑盒，甘油三酯試劑盒，β-脂蛋白試劑盒，高密度脂蛋白膽固醇試劑盒，均由上海市榮盛生物試劑廠提供，生產(chǎn)日期分別為960913，960922，961020，960824。二、實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果(一)、對(duì)大鼠脂代謝紊亂預(yù)防性給藥模型的作用選取健康SD系大白鼠，雄性，200+20g，共90只，在實(shí)驗(yàn)環(huán)境下給普通飲料喂養(yǎng)，觀察6天，無發(fā)現(xiàn)異常。然后剪尾取血，分離血清，測定其各項(xiàng)血脂指標(biāo)，淘汰異常血脂指標(biāo)的動(dòng)物，選取血脂指標(biāo)正常者進(jìn)行隨機(jī)分組，分為式I化合物低、中、高劑量組，陽性對(duì)照組、正常對(duì)照組及高脂對(duì)照組，每組10只。各組大鼠每天上午灌服高脂食物(80％豬油+4％膽酸鈉+4％膽固醇+12％蛋黃粉)20ml/kg體重，每天晚上正常對(duì)照組及高脂對(duì)照組灌服用3ml/100g體重1％羧甲基纖維素鈉溶液，而其余各組大鼠分別灌服相應(yīng)不同式I化合物或陽性對(duì)照藥(用1％羧甲基纖維素鈉配成懸浮液)。連續(xù)灌服30天。取血前禁食12小時(shí)，提供飲水。將各組大鼠摘眼取血，分離血清測定各項(xiàng)血脂指標(biāo)，結(jié)果見表2-1。表2-1式I化合物對(duì)大鼠脂代謝紊亂預(yù)防性給藥血脂指標(biāo)的影響(n＝10，X±SD)與高脂對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，按照70g體重成年人每天服用300mg換算，陽性對(duì)照組大鼠用量等效相當(dāng)其用量的3倍。(二)、對(duì)大鼠脂代謝紊亂治療性給藥模型的作用選擇健康SD系大白鼠，雄性，200±20g，共80只，隨機(jī)選出10只，作為正常對(duì)照組，供給食物和飲水，剩下70只作高脂模型組，這批大鼠每天上午定時(shí)灌服高脂食物(80％豬油+4％膽酸鈉+4％膽固醇+12％蛋黃粉)20ml/kg體重，連續(xù)灌服30天。第31天禁食12小時(shí)，剪尾取血，分離血清，測定甘油三酯TC含量，挑出高于600mg/dl的大鼠50只，隨機(jī)分為5組，即式I化合物低、中、高劑量給、陽性對(duì)照組及高脂對(duì)照組，每組10只。每天晚上正常對(duì)照組及高脂對(duì)照組大鼠灌服3ml/100g體重1％羧甲基纖維素鈉溶液，而其余各組大鼠分別灌服相應(yīng)不同濃度式I化合物或陽性對(duì)照藥(以1％羧甲基纖維素鈉配成懸浮液)連續(xù)給藥25天，第26天禁食12小時(shí)，將大鼠取血測定各項(xiàng)血指標(biāo)，結(jié)果見表2-2。表2-2式I化合物對(duì)大鼠脂代謝率紊亂治療性給藥血脂指標(biāo)的影響(n＝10，X±SD)與高脂對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01三、結(jié)論由大鼠脂代謝紊亂預(yù)防性給藥和大鼠脂代謝治療性給藥模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明式I化合物能夠顯著降低高脂大鼠的總膽固醇、甘油三酯、β-脂蛋白含量，同時(shí)增強(qiáng)高密度脂蛋白膽固醇含量，說明式I化合物對(duì)高血脂、高膽固醇癥以及肥胖癥具有良好治療及預(yù)防作用。實(shí)驗(yàn)實(shí)例3式I化合物對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性血栓形成的抑制作用一、實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)用品；式I化合物，由中山大學(xué)時(shí)珍堂天然產(chǎn)物生理活性研究中心提供，批號(hào)19960108陽性對(duì)照藥腦益嗪(Cinnarizine)，由廣東省利民制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)碼19960109實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD系健康雄性大白鼠，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證書檢證字96A02二、實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果選擇健康SD系大鼠，體重275±20g，雄性共50只，隨機(jī)分成5組，每組10只，即式I化合物高、中、低劑量組、陽性對(duì)照組和空白對(duì)照組。式I化合物、陽性對(duì)照藥用1％羧甲基纖維素鈉配成相應(yīng)濃度懸浮液。連續(xù)給藥16天，第16天給藥前禁食12小時(shí)，給藥1小時(shí)后，用4％戊巴比妥鈉42mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥體位固定動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，進(jìn)行頸動(dòng)脈-頸靜脈環(huán)插管手術(shù)將大鼠氣管分離，插入一短塑料管，隨時(shí)將氣管分泌物從套管中吸出。剖離左頸總動(dòng)脈，右側(cè)頸外靜脈，取一段聚乙烯軟質(zhì)塑料細(xì)管(長管為7.3cm，內(nèi)徑0.15cm，管厚為0.03cm)，內(nèi)放入一根8cm長的醫(yī)用縫合絲線，塑料管兩端用小管將絲線拉直夾緊，將多余的絲線夾在塑料管外，即塑料管內(nèi)絲線實(shí)際長度為7.3cm，用肝素生理鹽水充滿聚乙烯管。將聚乙烯管的一端插入右側(cè)頸外靜脈，另一端插入左頸總動(dòng)脈，結(jié)扎固定。準(zhǔn)備好后，打開血流，血流從左頸總動(dòng)脈流至聚乙烯管內(nèi)，返回右外側(cè)靜脈管，準(zhǔn)確開放血流15min后，立即中斷血流，迅速取出絲線，用電子分析天平稱總濕重。總濕重量減去絲線重得血栓濕重，計(jì)算血栓抑制率血栓制率(％)＝(空白組血栓濕重-給藥組血栓濕重)×100％/空白組在栓濕重結(jié)果見表3-1表3-1式I化合物對(duì)大鼠血栓形成的抑制作用(X±SD，N＝10)與空白對(duì)照組相比，*P＜0.05三、結(jié)論大鼠實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈血栓形成模型反映整體動(dòng)物血液中血小板的粘附聚集功能，血栓結(jié)構(gòu)類似動(dòng)脈中的白色血栓，故與生理病理情況比較接近。由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見與空白對(duì)照組相比，式I化合物低、中、高劑量組對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈血栓形成的抑制率分別為10％，20.1％，25.9％，具明顯量級(jí)關(guān)系，P值具有顯著性差異，提示式I化合物對(duì)血液血小板粘附聚集有抑制作用。實(shí)驗(yàn)實(shí)例4式I化合物降血糖藥效學(xué)研究一、實(shí)驗(yàn)材料1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NIH系小鼠，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，批號(hào)95A502.實(shí)驗(yàn)試劑(1)四氧嘧啶(Alloxan)，SingmaChemicalCo.生產(chǎn)。(2)佐脲霉素(Streptozocin)。AldrichChemicalCo.生產(chǎn)。(3)血糖試劑盒(葡萄糖氧化酶法)，由保定長城臨床試劑公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)(93)II藥準(zhǔn)字D-21-7號(hào)。(4)陽性對(duì)照藥格列本脲片(優(yōu)降糖)，由天津市力生制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)9702008。二、實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果1.對(duì)正常小鼠的血糖含量的影響選擇健康小鼠50只，雄性，隨機(jī)分為5組，即正常對(duì)照組、式I化合物低、中、高劑量及陽性對(duì)照組。正常對(duì)照組灌服等體積1％羧甲基纖維素鈉溶液，式I化合物及陽性對(duì)照藥分別用1％羧甲基纖維素鈉配成相應(yīng)濃度的懸浮液(見表4-1)。連續(xù)給藥8天，末次給藥后2小時(shí)摘眼取血，葡萄糖氧化酶法測血糖。取血前各組小鼠均禁食8小時(shí)。結(jié)果見表4-1。表4-1式I化合物對(duì)正常小鼠血糖含量的作用(X±SD，n＝10)</tables>與正常對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.012.對(duì)四氧嘧啶高血糖模型小鼠血糖含量的影響選擇健康小鼠70只雄性，禁食不禁水36小時(shí)后，腹腔注射200mg/kg體重四氧嘧啶制作高血糖模型。注射后48小時(shí)，斷尾取血測血糖含量，取血前小鼠禁食不禁水8小時(shí)。選取血糖值高于10mM/L以上的動(dòng)物50只，隨機(jī)分為5組式I化合物高、中、低劑量組、空白對(duì)照組及陽性對(duì)照組。分組后，每天給藥一次，共給藥3次，給藥劑量與方法同上述實(shí)驗(yàn)1。末次給藥后2小時(shí)，摘眼取血測血糖含量。取血前小鼠禁食不禁水8小時(shí)。結(jié)果見表4-2。表4-2式I化合物對(duì)四氧嘧啶高血糖模型小鼠血糖含量的作用(n＝10，X±SD)</tables>與空白對(duì)照組相比，**P＜0.013.對(duì)鏈佐脲霉素高血糖模型大鼠血糖含量的影響選取健康大鼠70只，雄性，禁食不禁水36小時(shí)后，腹腔注射鏈佐脲霉素70mg/kg體重，制備高血糖動(dòng)物模型。其余實(shí)驗(yàn)方法同上述實(shí)驗(yàn)2。結(jié)果見表4-3。表4-2式I化合物對(duì)鏈佐脲霉素高血糖模型小鼠血糖含量的作用(X±SD，n＝10)</tables>與空白對(duì)照組相比，**P＜0.01三、結(jié)論由上述結(jié)果可知，式I化合物低、中、高劑量對(duì)正常小鼠血糖含量、四氧嘧啶高血糖模型以及鏈佐脲霉素高血糖模型小鼠血糖含量具有降低作用。與空白對(duì)照組相比，具有非常顯著性差異，由此可知，式I化合具有降血糖作用。實(shí)驗(yàn)實(shí)例5式I化合物對(duì)小鼠改善記憶作用一、實(shí)驗(yàn)材料1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NIH系小鼠，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，批號(hào)95A502.實(shí)驗(yàn)試齊樟柳堿(Anixodine)，SigmaChemicalCo.提供。陽性對(duì)照藥腦復(fù)康(乙酰胺吡咯烷酮片Piracetami)，由廣州市醫(yī)藥工業(yè)研究所生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)(93)。粵衛(wèi)藥準(zhǔn)字第A9-016號(hào)。AlCl3·6H2O，分析純，由北京順義縣李遂化工廠生產(chǎn)。羧甲基纖維素鈉(CMC)，分析純，由廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。二、試驗(yàn)方法(一)、式I化合物對(duì)正常小鼠記憶能力的影響1跳臺(tái)試驗(yàn)1.1原理反應(yīng)箱底鋪有通36V的電銅柵，動(dòng)物受到電擊，其正常反應(yīng)是跳上箱內(nèi)絕緣的平臺(tái)以避免傷害性刺激。多數(shù)動(dòng)物可能再次或多次跳至銅柵上，受到電擊又迅速跳回平臺(tái)，如此訓(xùn)練5min，并記錄每鼠受到電擊的次數(shù)或叫錯(cuò)誤次數(shù)，以此作為學(xué)習(xí)成績。24h或48h重作測驗(yàn)，此即記憶保持測驗(yàn)。記錄受電擊的動(dòng)物數(shù)，第一次跳下平臺(tái)的潛伏期和3min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)。1.2方法跳臺(tái)儀；該裝置為10×10×60cm3的被動(dòng)回避條件反射箱，用黑色塑料板分隔成5間，底面鋪以銅柵，間距為0.5cm，可以通電，電壓強(qiáng)度由一變壓器控制。每間左后角置一高和直徑均為4.5cm的絕緣平臺(tái)。選擇健康NIH系小鼠100只，18～22g，雌雄各半，隨機(jī)分成五組，每組20只，雌雄各半，即空白對(duì)照組，式I化合物低、中、高劑量組及陽性對(duì)照組，式I化合物及陽性對(duì)照藥用1％羧甲基纖維素鈉配成懸浮劑，空白對(duì)照組小鼠灌服等體積1％CMC作對(duì)照。按表5-1劑量灌胃給藥30天。末次給藥后次日開始訓(xùn)練。將動(dòng)物放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境3min，然后立即通以36V的交流電。動(dòng)物受到電擊，其正常反應(yīng)是跳回平臺(tái)，以回避傷害性刺激。多數(shù)動(dòng)物可能再次或多次跳至銅柵上，受到電擊又迅速跳回平臺(tái)上，如此訓(xùn)練5min(同一試驗(yàn)中所有小鼠訓(xùn)練時(shí)間相同)，記錄后5min的錯(cuò)誤次數(shù)，以此作為學(xué)習(xí)成績。24h后重作測驗(yàn)，此即記憶保持測驗(yàn)。記錄受電擊的動(dòng)物數(shù)第一次跳下平臺(tái)的潛伏期和3min內(nèi)的錯(cuò)誤總數(shù)，同時(shí)計(jì)算動(dòng)物出現(xiàn)錯(cuò)誤反應(yīng)的頻率。結(jié)果見表5-1。2避暗法2.1原理利用小鼠嗜暗的習(xí)性設(shè)計(jì)一個(gè)裝置，一半是暗室，一半是明室，中間有一小洞相連。暗室底部鋪有通電的銅柵。實(shí)驗(yàn)者手持秒表，記錄小鼠入明室至入暗室的時(shí)間(潛伏期，秒)。2.2方法避暗儀該裝置分明暗兩室。明室大小為11cm×3.2cm，其上方約20cm處懸一40W燈泡。暗室較大，大小為17cm×3.2cm，兩室之間有一直徑約3cm的圓洞。兩室底部均鋪以銅柵。暗室底部中間位置的銅柵可以通電，電擊強(qiáng)度可在一旋鈕上任意選擇，一般采用40V電壓。選擇健康NIH系小鼠100只，18～22g，雌雄各半，隨機(jī)分成五組，每組20只，雌雄各半，即空白對(duì)照組，式I化合物低、中、高劑量組及陽性對(duì)照組。按表5-2劑量給藥30天。末次給藥后次日開始訓(xùn)練，實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠面部背向洞口放入明室，同時(shí)開始計(jì)時(shí)。動(dòng)物穿過洞口進(jìn)入暗室受到電擊，立即停止計(jì)時(shí)，取出小鼠，記錄每鼠從放暗室的潛伏期和5min內(nèi)的電擊次數(shù)，同時(shí)記錄5min內(nèi)進(jìn)入暗室(錯(cuò)誤反應(yīng))的動(dòng)物百分率。結(jié)果見表5-2。3水迷宮試驗(yàn)3.1原理動(dòng)物都有一種“探索”和“更替”傾向，當(dāng)離開一個(gè)臂時(shí)，總是跑向“久”未跑過的“新”臂。小鼠不愿在水中，因而尋找能爬出的階梯，訓(xùn)練后，小鼠能記住找到階梯的路線。該裝置是由迷宮游泳箱配合實(shí)驗(yàn)者記錄小鼠游泳時(shí)間及錯(cuò)誤次數(shù)。迷宮游泳箱由聚乙烯材料制成，長100cm，寬10cm，高30cm；內(nèi)徑長90cm，高30cm，泳道寬12cm，泳道走向固定(結(jié)構(gòu)如圖1所示)。3.2方法選擇健康NIH系小鼠100只，18～22g，雌雄各半，隨機(jī)分成五組，每組20只，雌雄各半，即空白對(duì)照組，式I化合物低、中、高劑量組及陽性對(duì)照組。按表5-3劑量灌胃給藥。連續(xù)給藥30d，末次給藥次日開始訓(xùn)練。訓(xùn)練期間繼續(xù)給藥，每天一次。迷宮泳道水深15cm，水溫25±1℃。試驗(yàn)時(shí)，將小鼠放于如圖1所示水迷宮泳道的起點(diǎn)(S)處，開始計(jì)時(shí)，觀察到達(dá)終點(diǎn)(G)所需時(shí)間，以及出現(xiàn)錯(cuò)誤次數(shù)。將小鼠訓(xùn)練時(shí)間限定為120s。在120s內(nèi)未達(dá)到終點(diǎn)的小鼠均記為120s。第一次訓(xùn)練前將小鼠放在梯子附近，使其自動(dòng)爬上3次。以后每次訓(xùn)練前將小鼠放在梯子附近，使其自動(dòng)爬上1次。試驗(yàn)分階段進(jìn)行，視動(dòng)物學(xué)習(xí)成績逐步加長路程。第一次訓(xùn)練時(shí)用一檔板在(A)處開始訓(xùn)練。第二次訓(xùn)練加長路程，從(B)處開始，此路程約訓(xùn)練3次，至動(dòng)物數(shù)80％以上達(dá)到終點(diǎn)，末次從起點(diǎn)進(jìn)行訓(xùn)練。最后計(jì)算各組動(dòng)物的錯(cuò)誤次數(shù)，到達(dá)終點(diǎn)的時(shí)間及到達(dá)終點(diǎn)的動(dòng)物數(shù)。一周后進(jìn)行消退試驗(yàn)。結(jié)果見表5-3。(二)、式I化合物對(duì)AlCl3所致的急性衰老模型小鼠記憶功能的影響1“Y”型迷宮試驗(yàn)“Y”型迷宮試驗(yàn)；“Y”型盒，有3個(gè)臂，相鄰的2臂夾角為120°，每臂為30cm×10cm×10cm。3臂中，有1臂的1/2區(qū)域?yàn)榘踩珔^(qū)，迷宮底部鋪以銅柵電極。安全區(qū)鋪銅柵，但不能導(dǎo)電。試驗(yàn)時(shí)將動(dòng)物放在非安全區(qū)的一臂頂端，然后給與電擊，動(dòng)物慌忙逃竄，最后偶然進(jìn)入安全區(qū)。這時(shí)為訓(xùn)練1次。如此反復(fù)訓(xùn)練三次，記錄第三次到達(dá)安全區(qū)所需時(shí)間(秒)。24h后，重復(fù)測試，記錄到達(dá)安全區(qū)所需的時(shí)間。選擇健康NIH系小鼠，60只，體重18～22g，雌雄各半，隨機(jī)分成五組，每組10只，即空白對(duì)照組，式I化合物低、中、高劑量組，陽性對(duì)照組(腦復(fù)康)組及正常對(duì)照組。除正常對(duì)照組外，每組小鼠每天皮下注射一次AlCl370mg/kg，連續(xù)注射七天。同時(shí)各組小鼠按表5-4劑量灌胃給藥，連續(xù)給藥25天，然后將各組小鼠進(jìn)行“Y”型迷宮測試。結(jié)果見表5-4。2跳臺(tái)試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法同(一)之1。結(jié)果見表5-5。3明暗試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法同(一)之2。結(jié)果見表5-6。(三)、式I化合物對(duì)樟柳堿造成小鼠記憶獲得性障礙的影響1跳臺(tái)試驗(yàn)選擇健康NIH系小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分成6組，每組10只，雌雄各半，即空白對(duì)照組、式I化合物低、中、高劑量組、陽性對(duì)照組(腦復(fù)康組)及正常對(duì)照組。按表5-7劑量灌胃給藥，連續(xù)給藥30天。測試前10min除正常對(duì)照組小鼠外，各組小鼠腹腔注射樟柳堿5mg/kg體重。實(shí)驗(yàn)方法同(一)之1。結(jié)果見表5-7。2Y型迷宮試驗(yàn)選擇健康NIH系小鼠60只，雌雄各半，10～22g隨機(jī)分成6組，每組10只，雌雄各半，即空白對(duì)照式I化合物低、中、高劑量組、陽性對(duì)照組(腦復(fù)康組)及正常對(duì)照組。按表5-8劑量灌胃給藥，連續(xù)給藥30天。測試前10min除正常對(duì)照組小鼠外，各組小鼠腹腔注射樟柳堿5mg/kg體重。實(shí)驗(yàn)方法同(二)之1。結(jié)果見表5-8。3明暗箱試驗(yàn)選擇健康NIH系小鼠60只，雌雄各半，18～22g隨機(jī)分成6組，每組10只，雌雄各半，即空白對(duì)照組式I化合物低、中、高劑量組、陽性對(duì)照組(腦復(fù)康組)及正常對(duì)照組。按表5-9劑量灌胃給藥，連續(xù)給藥30天。測試前10min除正常對(duì)照組小鼠外，各組小鼠腹腔注射樟柳堿5mg/kg體重。試驗(yàn)方法同(一)之2。結(jié)果見表5-9。三、結(jié)論從小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)，明暗箱試驗(yàn)、水迷宮試驗(yàn)，Y型迷宮試驗(yàn)結(jié)果，式I化合物能夠明顯增強(qiáng)正常小鼠的記憶功能，改善AlCl3或樟柳所致小鼠記憶障礙，減緩記憶的消退，與空白對(duì)照組相比，具有顯著性差異。表5-1對(duì)正常小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的影響(X±SD，n＝20)與空白對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01表5-2對(duì)小鼠明暗箱實(shí)驗(yàn)的影響(X±SD，n＝20)與空白對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01表5-3對(duì)正常小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響(X±SD，n＝20)與空白對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01表5-4式I化合物對(duì)AlCl3所致的急性衰老模型小鼠Y型迷宮實(shí)驗(yàn)的影響(X±SD，n＝20)與空白對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01表5-5式I化合物對(duì)AlCl3所致急性衰老模型小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)的影響(X±SD，n＝20)與空白對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01表5-6式I化合物對(duì)AlCl3所致的急性衰老模型小鼠明暗箱實(shí)驗(yàn)的影響(X±SD，n＝20)與空白對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01表5-7式I化合物對(duì)樟柳堿所致小鼠記憶獲得性障礙跳臺(tái)模型的影響(X±SD，n＝10)與空白對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01表5-8式I化合物對(duì)樟柳堿所致小鼠記憶獲得性障礙模型Y型迷宮實(shí)驗(yàn)的影響(X±SD，n＝10)與空白對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01表5-9式I化合物對(duì)樟柳堿所致小鼠記憶獲得性障礙模型明暗箱實(shí)驗(yàn)的影響(X±SD，n＝10)與空白對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01本發(fā)明還對(duì)式I化合物的其它幾種化合物以實(shí)例2-5相同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，獲得相似的結(jié)果，說明式I化合物在降血脂、降膽固醇、抗血小板聚集、抗血栓形成、降血糖以及增強(qiáng)和恢復(fù)記憶力等方面同樣具有顯著的治療效果。權(quán)利要求1.式I化合物二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯在制備用于治療高血脂癥、高膽固醇癥及肥胖癥的藥物中的應(yīng)用。式I中R′為n＝2-5，n′＝1-42.權(quán)利要求1中的式I化合物在制備用于降低病人血漿血小板聚集率以及抗血栓形成和抗動(dòng)脈硬化的藥物中的應(yīng)用。3.權(quán)利要求1中的式I化合物在制備用于治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用。4.權(quán)利要求1中的式I化合物在制備用于增強(qiáng)記憶力及治療記憶力衰退的藥物中的應(yīng)用。5.按照權(quán)利要求1～4之一的應(yīng)用，其中的式I化合物為己二酸(5-雄甾烯-17-酮-3β-羥基)酯。全文摘要本發(fā)明涉及式Ⅰ化合物,二酸(5－雄甾烯－17－酮－3β－羥基)酯在制藥中的應(yīng)用。式Ⅰ化合物作為藥物,對(duì)心腦血管疾病、糖尿病及記憶力衰退等疾病具有良好的治療效果。文檔編號(hào)A61P9/10GK1176786SQ9710899公開日1998年3月25日申請(qǐng)日期1997年7月18日優(yōu)先權(quán)日1997年7月18日發(fā)明者許東暉,許實(shí)波申請(qǐng)人:中山大學(xué)