本發(fā)明屬于生物分析方法領(lǐng)域，具體涉及一種利用icp-ms和熒光成像檢測全血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctc)的方法。

背景技術(shù)：

據(jù)我國國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，在2015年我國新發(fā)癌癥病例429.2萬，癌癥死亡281.4萬。肝癌的發(fā)病率位于肺癌、胃癌和食管癌之后位列第四，而肝癌的死亡率僅次于肺癌和胃癌。同時(shí)肝癌也是目前世界最多發(fā)的癌癥之一，尚未有有效的治愈手段，尤其是到了肝癌晚期階段。大多數(shù)癌癥引起的死亡是由于最初的癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的。與其他許多疾病相似，早期診斷對于癌癥的有效治療至關(guān)重要。發(fā)展切實(shí)可行的肝癌早期診斷方案目前仍然是一項(xiàng)重大的挑戰(zhàn)。

電感耦合等離子體質(zhì)譜(icp-ms)是一種元素特異性的檢測器，因其具有靈敏度高、線性范圍寬、多元素多同位素同時(shí)檢測、抗基體干擾能力強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于環(huán)境、食品以及生物樣品中痕量元素及其形態(tài)分析。近年來，隨著元素標(biāo)記策略不斷發(fā)展，icp-ms技術(shù)的應(yīng)用已拓展到生物定量分析和質(zhì)譜細(xì)胞計(jì)數(shù)等領(lǐng)域。常用的元素標(biāo)簽通常有內(nèi)源性元素、金屬離子螯合物、含金屬元素的聚合物以及含金屬元素的納米粒子等。但icp-ms作為破壞性檢測器也有一定的局限性，它能給出含量但卻無法給出可視化的圖像。而生物圖像中往往包含著豐富的信息，對于避免出現(xiàn)假陰性或假陽性的結(jié)果有重要意義。同樣，用于光學(xué)成像的生物探針往往因?yàn)閺?fù)雜的生物基質(zhì)自發(fā)熒光而無法給出實(shí)際生物樣品中的定量結(jié)果。

此外，生物基質(zhì)例如全血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞含量極少且成分復(fù)雜，為了獲得可接受的檢測靈敏度，有必要在用icp-ms檢測前采用合適的樣品前處理手段將目標(biāo)細(xì)胞從基質(zhì)復(fù)雜的懸浮液中分離和富集。由于磁性納米粒子性質(zhì)穩(wěn)定，具有較大的比表面積，且在磁場作用下能快速分離，因此磁性納米粒子很適合用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離。但是磁分離存在固有的缺陷，在清洗步驟中磁性顆粒會有部分損失，這會造成測量誤差、信號波動以及靈敏度降低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測方法的不足，本發(fā)明提供了一種基于磁免疫捕獲量子點(diǎn)標(biāo)記的方法檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞。該方法利用免疫磁珠高效捕捉循環(huán)腫瘤細(xì)胞，利用量子點(diǎn)實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的定量檢測以及成像，多核磁性納米粒子中摻雜的cs可以作為內(nèi)標(biāo)元素，提高了方法的抗干擾能力和可靠性。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案具體如下：

一種利用icp-ms和熒光成像檢測全血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法，包括以下步驟：

(1)在銫鹽溶液中加入硅源，通過堿催化反應(yīng)得到cs摻雜納米二氧化硅；

(2)向o/w反向微乳液中依次加入磁性納米粒子和cs摻雜納米二氧化硅，然后加入濃氨水進(jìn)行攪拌，再分次加入正硅酸乙酯進(jìn)行攪拌，最后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷進(jìn)行攪拌，洗滌后得到氨基改性cs摻雜多核磁性納米粒子，即mmnps-nh2；

(3)將mmnps-nh2與anti-epcam抗體加入hepes緩沖液中，然后加入edc和n-羥基硫代琥珀酰亞胺進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，再加入tris-hcl緩沖液封閉多余的活性位點(diǎn)，得到mmnps-anti-epcam探針磁球；

(4)利用金屬量子點(diǎn)標(biāo)記asgpr抗原，得到qds-anti-asgpr標(biāo)記探針；

(5)將mmnps-anti-epcam探針磁球在1％牛血清蛋白溶液中封閉處理，然后加入除去紅細(xì)胞的全血樣品，室溫孵育，然后磁分離棄去上清液，并用pbs緩沖液清洗磁球；然后加入過濾的脫脂奶粉進(jìn)行封閉，再加入qds-anti-asgpr標(biāo)記探針進(jìn)行孵育，然后磁分離棄去上清液；

(6)將步驟(5)的產(chǎn)物用酸液分散，置于icp-ms中檢測，得到cs與量子點(diǎn)中金屬元素的質(zhì)譜峰強(qiáng)度，比對工作曲線，得到全血樣品中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的準(zhǔn)確含量；

(7)將步驟(5)的產(chǎn)物用pbs緩沖液重懸，然后將溶液轉(zhuǎn)移到96孔板中，靜置待細(xì)胞沉降至96孔板底部后，置于熒光顯微鏡下觀察循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量及形貌。

步驟(1)的操作步驟具體為：將銫鹽溶于去離子水中，再加乙醇，超聲分散，再加入硅源繼續(xù)攪拌，即得到cs摻雜納米二氧化硅。

所述的銫鹽為cscl，所述的硅源為3-氨丙基三乙氧基硅烷或正硅酸乙酯，離子水和乙醇的體積比為1:7。

步驟(2)中所述的o/w反向微乳液由多庫酯鈉、水和庚烷組成，其中，水和庚烷的體積比為＝18:1，每900毫升o/w反向微乳液中含有2.2克多庫酯鈉。

步驟(2)中所述的氨基改性cs摻雜多核磁性納米粒子，其粒徑為100-150nm。

步驟(4)中所述的金屬量子點(diǎn)為cdse、cds、cdte、znse、inp、inas中的一種。

步驟(5)中mmnps-anti-epcam探針磁球在1％牛血清蛋白溶液中封閉處理的時(shí)間為1h。

步驟(6)中所述的酸液為濃度為1mol·l^-1的硝酸溶液。

所述的mmnps-anti-epcam探針磁球和qds-anti-asgpr標(biāo)記探針均需提前用1％bsa封閉1小時(shí)；步驟(5)中用pbs緩沖液清洗磁球是為了排除干擾，保證測定的準(zhǔn)確性；步驟(6)所述的工作曲線具體是對人工配制的已知ctc含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)樣品中ctc的數(shù)量為橫坐標(biāo)，以量子點(diǎn)中金屬元素與內(nèi)標(biāo)元素的質(zhì)譜峰強(qiáng)度比值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)樣品中ctc的數(shù)量與量子點(diǎn)中金屬元素與內(nèi)標(biāo)元素cs的質(zhì)譜峰強(qiáng)度比值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

本發(fā)明的原理具體如下：

本發(fā)明通過抗體包被的cs摻雜多核磁性納米粒子，捕獲全血樣本中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行磁分離，然后加入量子點(diǎn)修飾的抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記，以量子點(diǎn)作為icp-ms以及熒光成像的共同標(biāo)簽，可以用熒光顯微鏡對ctc進(jìn)行成像，也可以將其經(jīng)硝酸分散后直接引入icp-ms檢測，通過icp-ms檢測抗體上標(biāo)記的量子點(diǎn)中的元素實(shí)現(xiàn)ctc的定量計(jì)數(shù)。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果：

1、本發(fā)明通過單一量子點(diǎn)標(biāo)記，提供了一種icp-ms計(jì)數(shù)定量與熒光成像相結(jié)合檢測ctc的手段，可同時(shí)獲取圖像信息和定量結(jié)果。

2、本發(fā)明基于icp-ms具有優(yōu)異的同位素質(zhì)量數(shù)分辨率及絕對定量能力，基于含穩(wěn)定同位素的納米粒子標(biāo)記和icp-ms檢測的生物分析方法具有強(qiáng)的多目標(biāo)分析物同時(shí)分析及精準(zhǔn)定量的能力。

3、免疫磁珠的引入使得本發(fā)明可以應(yīng)用于復(fù)雜實(shí)際樣品的分析，在生物醫(yī)學(xué)研究和臨床應(yīng)用等領(lǐng)域?qū)υ缙谠\斷、高通量檢測和精準(zhǔn)定量等方面發(fā)揮積極的作用。

4、本發(fā)明在免疫磁珠摻雜內(nèi)標(biāo)元素可以消除因分析過程中免疫磁珠的損失對實(shí)驗(yàn)結(jié)果測定造成的誤差，進(jìn)一步提高了方法的穩(wěn)定性和可靠性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明氨基改性cs摻雜多核磁性納米粒子的制備過程示意圖。

圖2為實(shí)施例1所制備的氨基改性cs摻雜多核磁性納米粒子的透射電鏡圖。

圖3為目標(biāo)細(xì)胞和非目標(biāo)細(xì)胞的icp-ms分析結(jié)果圖。

圖4為目標(biāo)細(xì)胞和非目標(biāo)細(xì)胞的熒光成像圖；其中，圖4(a)、圖4(c)、圖4(e)為目標(biāo)細(xì)胞的熒光成像圖，圖4(b)、圖4(d)、圖4(f)為非目標(biāo)細(xì)胞的熒光成像圖。

圖5為實(shí)施例5得到的ctc模型細(xì)胞數(shù)量與標(biāo)記量子點(diǎn)和內(nèi)標(biāo)元素的質(zhì)譜峰強(qiáng)度比值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但這些實(shí)施例僅限于說明本發(fā)明，并不能限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中所使用的細(xì)胞樣本先用商品化氯化銨型紅細(xì)胞裂解液處理去除紅細(xì)胞。

實(shí)施例l：氨基改性cs摻雜多核磁性納米粒子、mmnps-anti-epcam探針磁球以及qds-anti-asgpr標(biāo)記探針的制備

氨基改性cs摻雜多核磁性納米粒子的制備過程示意圖如圖1所示，具體步驟如下：

(1)采用共沉淀法制備磁性納米粒子fe3o4：首先稱取1.35gfecl3·6h2o、0.5gfecl2·4h2o，加入25ml去離子水中；待固體完全溶解后，在氬氣氛圍中機(jī)械攪拌并于80℃加熱回流；當(dāng)溶液顏色變?yōu)樯铋偌t色時(shí)，調(diào)大氬氣流速，快速加入12.5ml濃氨水，此時(shí)，溶液顏色由橘紅色變?yōu)楹谏焕^續(xù)加熱攪拌20min，然后冷卻至室溫，得到磁性納米粒子fe3o4，采用磁分離方法分別用去離子水和乙醇洗滌磁球三次，產(chǎn)物保存于6ml去離子水中待用。

(2)采用堿催化法制備cs摻雜納米二氧化硅：將5.0mgcscl溶于1ml去離子水中，再加7ml乙醇，超聲分散5min，再加入35μl3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)攪拌24h，得到cs摻雜納米二氧化硅。

(3)反向微乳液法合成氨基改性cs摻雜多核磁性納米粒子：將2.2g多庫酯鈉和860μl水加入48ml庚烷中攪拌10min；然后加入300μl磁性納米粒子fe3o4分散液攪拌30min，再緩慢加入300μlcs摻雜納米二氧化硅水分散液，攪拌10min后加入224μl濃氨水，繼續(xù)攪拌15min后加入430μlteos，繼續(xù)攪拌24h后加入100μlteos，繼續(xù)攪拌20min后加入100μl3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，攪拌24h，所得固體產(chǎn)物用丙酮、乙醇、去離子水洗滌數(shù)次，得到氨基改性cs摻雜多核磁性納米粒子，即mmnps-nh2，保存于5ml去離子水中待用。

(4)將mmnps-nh2與anti-epcam抗體加入hepes緩沖液中，然后加入edc和n-羥基硫代琥珀酰亞胺，再加入tris-hcl緩沖液進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，得到mmnps-anti-epcam探針磁球。

(5)利用量子點(diǎn)(cdse、cds、cdte、znse、inp或inas)標(biāo)記asgpr抗原，得到qds-anti-asgpr標(biāo)記探針。

實(shí)施例2：氨基改性cs摻雜多核磁性納米粒子的表征

采用透射電子顯微鏡(tem)觀察實(shí)施例1制備的mmnps-nh2，其tem照片如圖2所示。從圖2可以看出，mmnps-nh2分散性較好，粒徑較為均一，在100-150nm左右，可以明顯觀察到一個磁球內(nèi)包含多個fe3o4核。

實(shí)施例3：目標(biāo)細(xì)胞和非目標(biāo)細(xì)胞的icp-ms分析

本實(shí)施例以硒化鎘(cdse)量子點(diǎn)作為標(biāo)記量子點(diǎn)，選取表達(dá)asgpr抗原(肝特異性跨膜糖蛋白)的hepg2細(xì)胞為目標(biāo)對象，選取了不表達(dá)asgpr的人舌鱗癌細(xì)胞cal27細(xì)胞和人宮頸癌細(xì)胞hela細(xì)胞作為陰性對照細(xì)胞。a組含hepg2細(xì)胞，b組含1×10⁴個hela細(xì)胞，c組含1×10⁴個cal-27細(xì)胞，d組含1×10⁴個hepg2細(xì)胞，e組含1×10⁴個hepg2細(xì)胞和1×10⁵個hela細(xì)胞，f組含1×10⁴個hepg2細(xì)胞和1×10⁵個cal-27細(xì)胞。

取2μl制備好的mmnps-anti-epcam探針磁球，用200μl牛血清蛋白溶液(1％bsa)封閉0.5h，以便減小探針的非特異性吸附；然后加入待測細(xì)胞置于90rpm搖床室溫孵育1h，之后磁分離棄去上清液并用1×pbs緩沖液清洗磁球，加入5％過濾的脫脂奶粉置于90rpm搖床室溫孵育0.5h以封閉磁球表面的非特異性吸附位點(diǎn)；封閉完成后，加入0.25μl的qds-anti-asgpr標(biāo)記探針置于90rpm搖床室溫孵育40min；磁分離后棄去上清液，用1×pbs緩沖液清洗磁球3次，洗去未反應(yīng)以及非特異性吸附的標(biāo)記探針。清洗結(jié)束后，加入100μl1mol·l^-1的hno3溶液分散磁球，最后將磁球引入icp-ms檢測¹¹⁴cd和¹³³cs信號。

以¹¹⁴cd和¹³³cs的質(zhì)譜峰強(qiáng)度比值為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖3所示，cal27細(xì)胞和人hela細(xì)胞得到的信號值與方法的空白值相近，hepg2細(xì)胞得到的信號值明顯高于其他兩種細(xì)胞，因此本發(fā)明能特異性識別檢測hepg2細(xì)胞。此外，過量的cal27細(xì)胞和人hela細(xì)胞的存在并不會影響本發(fā)明對hepg2細(xì)胞的檢測，說明本方法對hepg2細(xì)胞具有良好的選擇性。

實(shí)施例4：目標(biāo)細(xì)胞和非目標(biāo)細(xì)胞熒光成像

本實(shí)施例以硒化鎘(cdse)量子點(diǎn)作為標(biāo)記量子點(diǎn)，選取表達(dá)asgpr抗原的hepg2細(xì)胞為目標(biāo)對象，選取了不表達(dá)asgpr的人乳腺癌細(xì)胞mcf-7細(xì)胞作為陰性對照細(xì)胞。a組為hepg2細(xì)胞，b組為1×10⁴個mcf-7細(xì)胞。

取2μl制備好的mmnps-anti-epcam探針，用200μl牛血清蛋白溶液(1％bsa)封閉0.5h，以便減小探針的非特異性吸附。加入細(xì)胞置于90rpm搖床室溫孵育1h。之后磁分離棄去上清液并用1×pbs緩沖液清洗磁球，加入5％過濾的脫脂奶粉置于90rpm搖床室溫孵育0.5h以封閉磁球表面的非特異性吸附位點(diǎn)。封閉完成后，加入0.25μl的qds-anti-asgpr標(biāo)記探針置于90rpm搖床室溫孵育40min。磁分離后棄去上清液，用1×pbs緩沖液清洗磁球3次，洗去未反應(yīng)以及非特異性吸附的標(biāo)記探針。加入50μl的1×pbs緩沖液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到96孔板中。靜置10min待細(xì)胞沉降至96孔板底部后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞成像，采用561nm的光源作為激發(fā)光源。

實(shí)施例5：加標(biāo)人血樣分析

本實(shí)施例以硒化鎘(cdse)量子點(diǎn)作為標(biāo)記量子點(diǎn)，選取表達(dá)asgpr抗原的hepg2細(xì)胞為ctc模型細(xì)胞，將其加入健康人血樣中作為加標(biāo)人血樣用于分析。

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取2μl制備好的mmnps-anti-epcam探針，用200μl牛血清蛋白溶液(1％bsa)封閉0.5h，以便減小探針的非特異性吸附；加入待測細(xì)胞置于90rpm搖床室溫孵育1h，之后磁分離棄去上清液并用1×pbs緩沖液清洗磁球，加入5％過濾的脫脂奶粉置于90rpm搖床室溫孵育0.5h以封閉磁球表面的非特異性吸附位點(diǎn)；封閉完成后，加入0.25μl的qds-anti-asgpr標(biāo)記探針置于90rpm搖床室溫孵育40min，磁分離后棄去上清液，用1×pbs緩沖液清洗磁球3次，洗去未反應(yīng)以及非特異性吸附的標(biāo)記探針；清洗結(jié)束后，加入100μl1mol·l^-1的hno3分散磁球，最后將其引入icp-ms檢測¹¹⁴cd和¹³³cs信號。

選取200、500、1000、2000、5000、10000、20000、30000個hepg2細(xì)胞建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以hepg2細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)，以¹¹⁴cd和¹³³cs的質(zhì)譜峰強(qiáng)度比值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖5所示。

(2)加標(biāo)人血樣中ctc的檢測

向人全血中分別加入500、1000、2000、5000、10000個hepg2細(xì)胞，采用與(1)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法檢測人血樣中¹¹⁴cd和¹³³cs信號。將¹¹⁴cd和¹³³cs的質(zhì)譜峰強(qiáng)度比值對照(1)中所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出人全血中ctc的含量，結(jié)果如表1所示。加標(biāo)回收率在86％-104％之間，加標(biāo)回收率良好，表明本發(fā)明具有良好的抗干擾能力，可以用于實(shí)際人血樣中ctc的定量檢測。

表1人全血樣品加標(biāo)回收結(jié)果

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。