本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2010年4月1日的第201080022738.8號(hào)發(fā)明名稱(chēng)為“用于結(jié)腸直腸癌體外診斷的防衛(wèi)素原-a6測(cè)定方法”的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

本發(fā)明涉及癌學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明的主題是通過(guò)確定取自患者的生物樣品中防衛(wèi)素原-a6(prodefensin-a6)的存在而用于在人類(lèi)患者中對(duì)結(jié)腸直腸癌進(jìn)行體外診斷的方法，所述方法可用于與結(jié)腸直腸癌有關(guān)的早期診斷、篩查、治療隨訪和預(yù)后、以及復(fù)發(fā)診斷。

結(jié)腸直腸癌(crc)是主要的公共健康問(wèn)題。其世界范圍的發(fā)病率在1996年據(jù)估計(jì)為875000例新病例?？紤]到兩種性別，在西方國(guó)家中它是發(fā)生最頻繁的癌癥，它通常被歸類(lèi)為因癌癥而死亡的前3個(gè)最普遍的原因?？紤]到所有階段，5年生存率在60％的范圍。

只有早期診斷提供了治愈性治療的希望。然而，目前沒(méi)有早期的血清學(xué)的篩查測(cè)試也沒(méi)有特異性的診斷測(cè)試。

目前在歐洲，結(jié)腸直腸癌的篩查使用兩種不同的途徑來(lái)進(jìn)行：第一，使用臨床奇異性測(cè)試，其在于尋找糞便中血液的存在(糞便潛血試驗(yàn)，fobt，例如以商品名名義上市的)。此技術(shù)已顯示了其臨床的實(shí)用性。當(dāng)其每2年被用于年齡在50和74之間的個(gè)體時(shí)，能減少15-20％因結(jié)腸直腸癌的死亡率。為此，有必要對(duì)超過(guò)一半的相關(guān)群體定期篩查，并如果發(fā)生陽(yáng)性測(cè)試則對(duì)其進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查，任選地隨后進(jìn)行合適的治療。

然而，此篩查技術(shù)受制于若干不利條件：

·此測(cè)試最主要的缺點(diǎn)是其一般的靈敏度，尤其對(duì)腺瘤(癌前異型增生病變)，若其尺寸大或代表嚴(yán)重發(fā)育異常，10例中有1例會(huì)導(dǎo)致癌癥的發(fā)展。

·此測(cè)試也病不很特異。糞便中血液的出現(xiàn)可能涉及非腫瘤情況：潰瘍性結(jié)腸炎、痔、肛瘺等。如果這樣的話(huà)，必需進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查調(diào)查，缺點(diǎn)將在下文中描述。

·最后，測(cè)試很難被解讀；因此它們必需在專(zhuān)業(yè)中心，由有資格的合格人員來(lái)解讀。

特異性針對(duì)人血紅蛋白的免疫學(xué)測(cè)試(fecaheme等)也已被描述。與相比，它們可能構(gòu)成了進(jìn)步，但它們本質(zhì)上顯示出相同的問(wèn)題。因此，由enterixinc.所上市的insure^tm使得可以探測(cè)出87％的患結(jié)腸直腸癌的患者和47％有癌前息肉的人。它是探測(cè)人糞便中血紅蛋白的測(cè)試，更具體地，是此分子的球蛋白部分。

第二個(gè)篩查策略是在50歲之后系統(tǒng)地進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查，這使得可以在理論上降低因結(jié)腸直腸癌的死亡率。然而，使用內(nèi)窺鏡檢查來(lái)降低死亡率的篩查方針在健康良好的個(gè)體中對(duì)此檢查的可接受性太低(在設(shè)立此篩查策略的歐洲國(guó)家中，對(duì)結(jié)腸鏡檢查的依從水平在2％左右)。存在不可忽略的穿孔的風(fēng)險(xiǎn)(0.1％)和結(jié)腸出血并死亡(1/10000)，它對(duì)于公共健康也太昂貴。此外，結(jié)腸鏡檢查要求非常限制性的先行結(jié)腸準(zhǔn)備，這在很大程度解釋了不佳的順從性。

能被免疫測(cè)定檢驗(yàn)的腫瘤標(biāo)記物長(zhǎng)久以來(lái)在結(jié)腸直腸癌的背景下被描述。它們尤其是癌胚抗原(cea)和ca19-9。

cea被用作隨訪。它不能被用于結(jié)腸直腸癌的篩查或早期診斷，因?yàn)樗撵`敏度和特異性不夠。這是因?yàn)榇藰?biāo)記物被其它類(lèi)型的癌癥表達(dá)，而且在良性病理學(xué)中。無(wú)論如何，通過(guò)結(jié)合cea和另一腫瘤標(biāo)記物諸如ca19-9或ca72-4，有可能增加靈敏度而不喪失特異性。

ca19-9中生理變異的原因很罕見(jiàn)，但其它良性疾病(肝膽管的、胰腺的)，或惡性疾病會(huì)導(dǎo)致ca19-9的增加。因此，此單獨(dú)的標(biāo)記物對(duì)診斷也沒(méi)有意義。盡管如此，因其血清濃度與腫瘤大小和轉(zhuǎn)移的存在相關(guān)聯(lián)，它也能實(shí)現(xiàn)治療隨訪或復(fù)發(fā)的早期證實(shí)。

此外，商業(yè)上可獲得的測(cè)試已被提出，諸如：

由ambrilia上市的/colorectalert^md，是對(duì)crc的快速和相對(duì)非損傷性的測(cè)試篩查。檢測(cè)有結(jié)腸直腸病理狀況的個(gè)人的直腸黏液中的縮醛磷脂(一類(lèi)復(fù)合脂類(lèi)，是磷脂的一部分)，colorectalert^md檢測(cè)t-抗原，直腸黏液中的復(fù)合糖類(lèi)。/colorectalert^md測(cè)試包含將直腸黏液應(yīng)用于測(cè)試條，陽(yáng)性或陰性的結(jié)果基于希夫反應(yīng)。ambrilia研究了1787名個(gè)體，并證實(shí)/colorectalert^md探測(cè)出54％的早期結(jié)腸直腸癌和49％的各期結(jié)腸直腸癌。

由myriadgenetics上市的colaris,是探測(cè)血液中mlh1和msh2基因的突變測(cè)試，來(lái)篩查遺傳性非息肉性結(jié)腸癌(hnpcc癥)。測(cè)試的結(jié)果能在3周內(nèi)得到。myriad使用目前可用的最靈敏和最特異的測(cè)序技術(shù)。該測(cè)試是昂貴的。

由amdl上市的是篩查不同種類(lèi)型癌癥的測(cè)試(肺、結(jié)腸、乳房、肝臟、胃等)。因此它對(duì)crc不是特異的。所述測(cè)試的原理是基于雙夾心酶連免疫吸附技術(shù)(檢驗(yàn)dr-70抗原)。通過(guò)酶反應(yīng)(偶聯(lián)于生物素和鏈霉親和素的抗體)來(lái)完成顯示。顯色反應(yīng)指示癌癥的存在。

申請(qǐng)人如今令人吃驚地顯示出一種腺癌的特異標(biāo)記物，其由惡性結(jié)腸腫瘤的癌組織釋放并是這些腫瘤的特征，使其能在遠(yuǎn)離惡性腫瘤的生物樣品和腫瘤自身中被檢測(cè)到。

因此，本發(fā)明的第一個(gè)主題是體外診斷結(jié)腸直腸癌的方法，通過(guò)確定從懷疑患有結(jié)腸直腸癌的患者中采集的，優(yōu)選遠(yuǎn)離腫瘤的生物學(xué)樣本中防衛(wèi)素原-a6的存在。

本發(fā)明也涉及此方法在與結(jié)腸直腸癌相關(guān)的早期診斷、篩查、治療隨訪、預(yù)后、以及復(fù)發(fā)診斷中的用途。

因此，本發(fā)明的方法使得可以對(duì)結(jié)腸直腸癌進(jìn)行特異的和早期的診斷，借助于簡(jiǎn)單的測(cè)試，表現(xiàn)為搜尋從患者內(nèi)采集的生物樣品中防衛(wèi)素原-a6的存在，所述樣品優(yōu)選遠(yuǎn)離潛在的腫瘤。事實(shí)上，申請(qǐng)人出乎意料地顯示，結(jié)腸腫瘤不僅特異地分泌防衛(wèi)素原-a6，而且特別地從癌組織中釋放它，如同將在下文中以更多細(xì)節(jié)顯示的，它在使用本發(fā)明方法的生物樣品中的濃度與健康患者中確定的參考值相比較是增加了。

可在遠(yuǎn)離或不遠(yuǎn)離腫瘤的生物樣品中確定防衛(wèi)素原-a6的存在，因此使確認(rèn)成為可能，考慮到所尋找的病理狀況。因此，本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于使用遠(yuǎn)離潛在的腫瘤的樣品作為診斷樣品的可能性，因而使簡(jiǎn)單和非侵入性診斷成為可能，而組織診斷需要侵入性的活組織檢查。事實(shí)上，研究組織標(biāo)記物，例如在組織切片上(免疫組織化學(xué))，也許有預(yù)測(cè)意義，但對(duì)于結(jié)腸直腸癌的篩查和診斷沒(méi)有意義。

防衛(wèi)素是一類(lèi)參與宿主防御微生物攻擊的抗菌肽。它們由30到40個(gè)氨基酸組成，具有選擇性分解膜的特性。類(lèi)似其它的真核蛋白，防衛(wèi)素能以成熟蛋白的形式或前體的形式存在。

前體，也稱(chēng)前體蛋白，由前肽和成熟部分組成。因此，防衛(wèi)素原-a6是成熟的防衛(wèi)素-a6蛋白的前體蛋白，由100個(gè)氨基酸組成，包含信號(hào)肽(氨基酸1-19)、前肽(氨基酸20-65)和成熟的防衛(wèi)素-a6蛋白(氨基酸66-100)。

通常，前體蛋白長(zhǎng)久以來(lái)被認(rèn)為僅僅是代謝分子。然而，若干近來(lái)的實(shí)例，尤其是在神經(jīng)肽領(lǐng)域，指出在某些情況下，前體蛋白具有生物活性，其是特異的并與其能生成的成熟蛋白分離的。誠(chéng)然，前體蛋白的序列包括成熟蛋白，例如防衛(wèi)素原的序列包括防衛(wèi)素，但它們的等電點(diǎn)和分子量是不同的。因此，防衛(wèi)素和防衛(wèi)素原被認(rèn)為是兩種不同的蛋白。

防衛(wèi)素α5和α6基本上是小腸帕內(nèi)特細(xì)胞產(chǎn)生的。在克羅恩病中，防衛(wèi)素α5和α6的mrna在結(jié)腸組織中過(guò)表達(dá)。nam等人鑒定防衛(wèi)素α6是結(jié)腸癌的潛在標(biāo)記物。nam等人發(fā)展了競(jìng)爭(zhēng)性elisa測(cè)定，其特異地檢驗(yàn)防衛(wèi)素α6。他們確定了閥值(30ng/ml)，超過(guò)此值，患者被診斷為患有結(jié)腸直腸癌。在分析18份來(lái)自健康供者和49份癌癥的血清中，他們獲得了69.4％的診斷靈敏度，83.3％的診斷特異性。所述文件中沒(méi)有提及防衛(wèi)素α6的前體，防衛(wèi)素原α6。

因此，防衛(wèi)素α6的前體，防衛(wèi)素原-a6(swissprotno.q01524)從未被描述為可被使用作與癌癥尤其是結(jié)腸直腸癌相關(guān)的標(biāo)記物，且從未在遠(yuǎn)離或不遠(yuǎn)離惡性腫瘤的生物樣品中被檢測(cè)過(guò)。

表述“確定前體蛋白的存在”適用于表示確定超過(guò)對(duì)健康患者設(shè)定的參考值。尋找的前體可為完整的100個(gè)氨基酸的前體，沒(méi)有信號(hào)肽的前體蛋白(氨基酸20到100)或單獨(dú)的前肽(氨基酸20到65)。它也可以是后者的片段，諸如排除成熟蛋白(氨基酸66到100)的前肽的片段，和其片段。

依照本發(fā)明的特定實(shí)施方案，沒(méi)有信號(hào)肽的防衛(wèi)素原-a6的前體的存在被確定。此前體在swiss-prot數(shù)據(jù)庫(kù)中的被描述的序列是seqidno.1(eplqaeddplqakayeadaqeqrgandqdfavsfaedassslralgstraftchcrrscysteysygtctvmginhrfccl；相當(dāng)于氨基酸20-100)。優(yōu)選地，前體本身的存在至少有序列seqidno.2(eplqaeddplqakayeadaqeqrgandqdfavsfaedassslralg)，最多有序列seqidno.1被確定。

正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，存在蛋白多態(tài)性，上述給出的序列只不過(guò)是指示性的。它們是swiss-prot數(shù)據(jù)庫(kù)中指出的共有序列，但氨基酸置換以可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員評(píng)估的百分比存在，以考慮其是否是相同的蛋白。類(lèi)似地，前肽氨基酸65位的切割位點(diǎn)是理論上的，僅僅以指示的形式給出。

表述“被結(jié)腸腫瘤釋放”適用于表示不論機(jī)制的主動(dòng)或被動(dòng)分泌，由腫瘤細(xì)胞自身或因腫瘤發(fā)展導(dǎo)致細(xì)胞表型病變或修飾的臨近非腫瘤細(xì)胞釋放的腫瘤標(biāo)記物。

表述“以本發(fā)明方法完成的生物樣品”適用于表示任何有可能含有感興趣的腫瘤標(biāo)記物的生物樣品。在非遠(yuǎn)離腫瘤的生物樣品的例子中，可提及固態(tài)樣品諸如源自腫瘤，腫瘤活體組織檢查，淋巴結(jié)，患者腫瘤轉(zhuǎn)移的組織，以及從這些固態(tài)樣品中純化的細(xì)胞。在遠(yuǎn)離腫瘤的生物樣品的例子中，可提及生物液體諸如全血或其衍生物，例如血清或血漿，尿液，唾液和滲出液，骨髓和糞便，以及從這些液態(tài)樣品純化的細(xì)胞。血液或其衍生物，糞便，并且從這些液態(tài)樣品純化的細(xì)胞是優(yōu)選的。

本發(fā)明的方法可被改善，通過(guò)探測(cè)除防衛(wèi)素原-a6外，至少一個(gè)其它的腫瘤標(biāo)記物，其也恰當(dāng)?shù)赜山Y(jié)腸腫瘤的癌組織釋放。因此，合并至少兩個(gè)標(biāo)記物使得可以改善結(jié)腸直腸癌診斷測(cè)試的特異性和靈敏度。

因此，本發(fā)明的另一個(gè)主題也在于確定至少一個(gè)選自以下標(biāo)記物的其它腫瘤標(biāo)記物的存在：白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑、埃茲蛋白、?；被崴饷?、肝脂肪酸結(jié)合蛋白、腸脂肪酸結(jié)合蛋白、載脂蛋白(apolipoprotein)ai、載脂蛋白aii，i-絲束蛋白、β2-微球蛋白、蛋白酶體20s、半乳凝集素-3、l-乳酸脫氫酶鏈b、鈣網(wǎng)蛋白、再生性胰島衍生蛋白3α、腫瘤相關(guān)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白1、ii型角蛋白細(xì)胞骨架8、i型角蛋白細(xì)胞骨架18、i型角蛋白細(xì)胞骨架19、上皮鈣黏著蛋白、cea、絨毛蛋白、ca19-9、ca242、ca50、ca72-2、睪酮、timp-1、cripto-1、蛋白二硫化物異構(gòu)酶、內(nèi)凝集蛋白-1(intelectin-1)、細(xì)胞角蛋白20、翻譯控制性腫瘤蛋白、防衛(wèi)素(原)-a5、mif、丙酮酸激酶m2-pk、鈣粒蛋白c、cd24、ccsa-3(結(jié)腸癌特異抗原)、和ccsa-4，其甲基化譜(methylationprofile)具有特定變換的血液中dna片段的探測(cè)，例如axl4基因的甲基化dna(無(wú)芒樣同源框-4基因甲基化)或隔蛋白-9基因的甲基化dna，探測(cè)糞便dna片段的特定變化，諸如糞便dna的特殊突變或糞便dna甲基化譜的特定變化，探測(cè)糞便人血紅蛋白。

表述“除防衛(wèi)素原-a6外的腫瘤標(biāo)記物”適合于表示蛋白，信使rna或相應(yīng)基因的特殊修飾，諸如突變或甲基化。換言之，僅有防衛(wèi)素原-a6是單獨(dú)以其蛋白的形式被尋找，其可為完整的或以片段的形式。

白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑腫瘤標(biāo)記物(swissprotno.p30740，也被稱(chēng)為lei，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白b1，單核細(xì)胞/嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑，m/nei或ei)于1992年被測(cè)序。lei通過(guò)形成不能被sds作用分解的復(fù)合物特異地抑制具有彈性蛋白酶型或胰凝乳蛋白酶型特性的蛋白酶。因此lei抑制由嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的三種主要蛋白酶：白細(xì)胞彈性蛋白酶、蛋白酶-3和組織蛋白酶g。這些蛋白酶使免疫系統(tǒng)能夠通過(guò)蛋白酶解胞外或吞噬的底物來(lái)防御生物。然而，當(dāng)這些蛋白酶過(guò)量時(shí)，它們是造成炎癥反應(yīng)的原因。因此，lei可在調(diào)節(jié)和限制由細(xì)胞蛋白酶引起的炎癥反應(yīng)中起作用。申請(qǐng)人在這一部分令人吃驚地顯示，在專(zhuān)利申請(qǐng)wo2009/024691中，此蛋白的濃度相對(duì)于為健康患者確定的參考值增加了，使此蛋白成為取自患有結(jié)腸直腸癌患者生物樣品中的良好標(biāo)記物，所述樣品盡可能遠(yuǎn)離腫瘤。

埃茲蛋白標(biāo)記物(swissprotno.p15311，也被稱(chēng)為p81，細(xì)胞絨毛蛋白或絨毛蛋白-2)是在細(xì)胞膜和細(xì)胞的細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白絲間，尤其是在上皮細(xì)胞的微絨毛內(nèi)提供連接的蛋白。w.g.jiang和s.hiscox指出，白細(xì)胞介素il-2、il-8、il-10等，能抑制在人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系ht29中埃茲蛋白的表達(dá)。同樣的作者指出，在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系ht115和hrt18中，埃茲蛋白表達(dá)的抑制減少了細(xì)胞間的粘附，增加了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和侵入性行為。他們推斷，埃茲蛋白通過(guò)與細(xì)胞粘附分子e-鈣黏著蛋白和β-聯(lián)蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞/細(xì)胞和細(xì)胞/基質(zhì)的粘附。他們提出，埃茲蛋白可能在控制癌細(xì)胞侵入能力中具有重要作用。此外，t.xiao等人使用elisa測(cè)定來(lái)量化肺癌患者的血漿埃茲蛋白。然而，他們沒(méi)有觀察到任何相較于對(duì)照個(gè)體的差異。申請(qǐng)人在這一部分令人吃驚地顯示，在專(zhuān)利申請(qǐng)wo2009/019365中，此蛋白的濃度相對(duì)于為健康患者確定的參考值增加了，使此蛋白成為取自患有結(jié)腸直腸癌患者生物樣品中的良好標(biāo)記物，所述樣品盡可能遠(yuǎn)離腫瘤。

酰化氨基酸水解酶1標(biāo)記物(swissprotno.q03154，也被稱(chēng)為ec3.5.1.14，n-?；?l-氨基酸酰胺水解酶)是酰化氨基酸水解酶家族的一部分。它們是催化?；被崴馍芍舅岷桶被岬拿?。k.lorentz等人于1975年發(fā)展了用于氨基酰化酶酶活力的免疫化學(xué)測(cè)定，并被用來(lái)檢驗(yàn)不同的組織和血清。研究顯示在肝病理學(xué)狀況的情況中，氨基?；富钚缘脑黾?，但不在結(jié)腸癌的情況中。此外，酰化氨基水解酶1基因被鑒定在染色體3p21.1上。3p21.1區(qū)域在小細(xì)胞肺癌中被還原為純合性，在這種情況下，酰化氨基酸水解酶的表達(dá)被抑制或探測(cè)不到。類(lèi)似地，s.balabanov等人指出，在腎癌情況下，酰化氨基酸水解酶的表達(dá)被抑制。申請(qǐng)人在這一部分令人吃驚地顯示，在專(zhuān)利申請(qǐng)wo2009/019366中，此蛋白的濃度相對(duì)于為健康患者確定的參考值增加了，使此蛋白成為取自患有結(jié)腸直腸癌患者生物樣品中的良好標(biāo)記物，所述樣品盡可能遠(yuǎn)離腫瘤。

肝脂肪酸結(jié)合蛋白標(biāo)記物(swissprotno.p07148，也被稱(chēng)為l-fabp、fabp1、fabpl、z-蛋白或固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)屬于包含9個(gè)同工型的fabp家族。每個(gè)同工型依照其最先被檢測(cè)到的組織來(lái)命名。這些同工型具有共享的功能和相似的三維結(jié)構(gòu)，但它們的序列同源性不高。l-fabp于1985年被測(cè)序。它是胞漿中豐富的15kda的小蛋白，有結(jié)合自由脂肪酸和膽紅素的能力。一些近來(lái)的研究指出l-fabp蛋白表達(dá)的損傷能引起腫瘤生成過(guò)程。對(duì)前列腺癌而言，腫瘤組織活體檢查中l(wèi)-fabpmrna的表達(dá)水平比正常組織中高10倍。對(duì)結(jié)腸癌而言，幾個(gè)團(tuán)隊(duì)使用二維電泳技術(shù)鑒定出腫瘤組織中l(wèi)-fabp蛋白的表達(dá)相比正常結(jié)腸黏液中降低了。此結(jié)果也被免疫組織化學(xué)技術(shù)所證實(shí)。此外，在結(jié)腸直腸癌轉(zhuǎn)移到肝臟的患者中，l-fabp蛋白是預(yù)兆肝臟切除的標(biāo)記物。在專(zhuān)利申請(qǐng)wo00/33083中，提出此標(biāo)記物能在患有結(jié)腸癌的患者的生物液體中被檢測(cè)到。申請(qǐng)人在這一部分證實(shí)了在專(zhuān)利申請(qǐng)wo2009/019368中，此蛋白的濃度相對(duì)于為健康患者確定的參考值降低了，使此蛋白成為取自患有結(jié)腸直腸癌患者生物樣品中的良好標(biāo)記物，所述樣品遠(yuǎn)離腫瘤。

腸脂肪酸結(jié)合蛋白標(biāo)記物(swissprotno.p12104，也被稱(chēng)為i-fabp,fabp-2或fabpi)于1987年被測(cè)序。它是胞液中豐富的15kda的小蛋白，有結(jié)合自由脂肪酸和膽紅素的能力。i-fabp蛋白在小腸上皮細(xì)胞中被表達(dá)，構(gòu)成約2％的此類(lèi)細(xì)胞類(lèi)型的蛋白含量。在組織水平，十二指腸和空腸含有比結(jié)腸顯著高的i-fabp量(空腸：4.8μg/g，結(jié)腸：0.25μg/g)。i-fabp能在健康個(gè)體的血漿樣品中被檢測(cè)到。在另一方面，在某些病理狀況下，諸如腸道局部缺血、克羅恩病、原發(fā)性膽汁性肝硬化，可能在某些個(gè)體中顯出血漿i-fabp濃度的增加。對(duì)前列腺癌而言，已指出腫瘤組織活體檢查中的i-fabpmrna表達(dá)水平比正常組織中的高出7倍。使用氧化偶氮甲烷在大鼠中誘導(dǎo)結(jié)腸直腸腫瘤的模型中，當(dāng)動(dòng)物具有減少癌癥發(fā)生率的飲食時(shí)(大豆蛋白、乳清水解產(chǎn)物)，i-fabpmrna的表達(dá)水平減少了2.92到3.97倍。申請(qǐng)人證實(shí)，例如在專(zhuān)利申請(qǐng)wo2009/019366中，此蛋白的濃度相對(duì)于為健康患者確定的參考值增加了，使此蛋白成為取自患有結(jié)腸直腸癌患者生物樣品中的良好標(biāo)記物，所述樣品遠(yuǎn)離腫瘤。

載脂蛋白是由極性氨基酸組成的蛋白家族，通過(guò)形成被稱(chēng)為脂蛋白的親水大分子復(fù)合物在血液中運(yùn)輸脂類(lèi)。對(duì)每種人類(lèi)血漿載脂蛋白，有從基因多態(tài)性和/或從翻譯后修飾得到的同工型，其在血液中的存在能與某些病理狀況相聯(lián)系。載脂蛋白的血漿濃度不是低微的，在1mg/ml的等級(jí)。

載脂蛋白ai標(biāo)記物(ncbino.490098，也被稱(chēng)作apoa-i、apoai和apoa1)是有243個(gè)氨基酸的，28kda的蛋白。它基本由肝臟和腸合成。通過(guò)seldi-tof，此蛋白在患有結(jié)腸直腸癌的患者血清中相比健康個(gè)體顯示不夠豐富。然而，本文中明確提出通過(guò)合并apoai和其它蛋白標(biāo)記物來(lái)區(qū)分患有crc的患者和健康個(gè)體。此外，本文明確提出，由另一個(gè)團(tuán)隊(duì)通過(guò)免疫散射比濁法檢驗(yàn)apoai沒(méi)有證實(shí)此蛋白在crc患者血清中不夠豐富。hachem等人在他們的部分，檢驗(yàn)了結(jié)腸直腸癌轉(zhuǎn)移至肝癌的患者血清中的apoai。申請(qǐng)人在其部分令人吃驚地顯示通過(guò)免疫測(cè)定檢驗(yàn)使其有可能顯示在患有結(jié)腸直腸癌的患者中此蛋白濃度的降低，與engwgen等人提出的不同，他們僅通過(guò)應(yīng)用seldi-tof技術(shù)顯示了此降低。通過(guò)免疫測(cè)定檢驗(yàn)生物樣品中的apoai是診斷結(jié)腸直腸癌的良好方法，所述樣品遠(yuǎn)離腫瘤，就如zhang等人的團(tuán)隊(duì)使用的非比濁法的免疫測(cè)定檢驗(yàn)。

載脂蛋白aii標(biāo)記物(swissprotno.p02652，也被稱(chēng)為apoaii、apo-aii和apoa2)，是17380da，由兩條每條77個(gè)氨基酸的通過(guò)二硫鍵連接的多肽鏈組成的蛋白。和載脂蛋白ai相似，載脂蛋白aii基本由肝臟和腸合成。hachem等人除了apoai外，也檢驗(yàn)了結(jié)腸直腸癌轉(zhuǎn)移至肝癌的患者血清中的apoaii。然而，結(jié)果不顯著，不足以就尋找病理狀況下結(jié)論。申請(qǐng)人在這一部分令人吃驚地顯示，在專(zhuān)利申請(qǐng)wo2009/019370中，此蛋白的濃度相對(duì)于為健康患者確定的參考值降低了，這種在患有結(jié)腸直腸癌患者中此蛋白濃度的降低使其成為取自患有結(jié)腸直腸癌患者生物樣品中的良好標(biāo)記物，所述樣品遠(yuǎn)離腫瘤。

i-絲束蛋白標(biāo)記物(swissprotno.q14651，也被稱(chēng)為腸特異性絲束蛋白或絲束蛋白1)屬于人絲束蛋白家族，其已知有三個(gè)代表：i-絲束蛋白、l-絲束蛋白和t-絲束蛋白。一些作者稱(chēng)絲束蛋白為“微絲結(jié)合蛋白”，而其他作者為i-絲束蛋白保留微絲結(jié)合蛋白的名稱(chēng)。絲束蛋白是結(jié)合肌動(dòng)蛋白形成細(xì)胞骨架的蛋白。它們是70kda的蛋白，在真核進(jìn)化中相對(duì)保守。它們顯示出強(qiáng)的組織特異性，正常組織中一次只出現(xiàn)一個(gè)同工型。在專(zhuān)利us-a-5360715中，絲束蛋白關(guān)于癌癥的使用已被描述過(guò)，其提出了方法以確定細(xì)胞是否為造血的或瘤的，例如癌的。此方法要求檢驗(yàn)細(xì)胞水平的l-絲束蛋白和t-絲束蛋白，更具體地是檢驗(yàn)其mrna。然而盡管有這些特性，先前還不曾有過(guò)使用血清或糞便樣品來(lái)評(píng)估絲束蛋白的重要性與結(jié)腸直腸癌診斷的關(guān)系。此外，i-絲束蛋白從未被設(shè)想過(guò)作為潛在的癌癥標(biāo)記物。申請(qǐng)人在這一部分令人吃驚地顯示，在專(zhuān)利申請(qǐng)wo2009/024691中，此蛋白的濃度相對(duì)于為健康患者確定的參考值增加了，使此蛋白成為取自患有結(jié)腸直腸癌患者生物樣品中的良好標(biāo)記物，所述樣品盡可能遠(yuǎn)離腫瘤。

β2-微球蛋白(swissprotno.p61769，也被稱(chēng)為β2-微球蛋白，β2m)是在大多數(shù)有核的人細(xì)胞表面的低分子量蛋白(11到12kda)。某些患有癌癥的患者的血清β2-微球蛋白水平增加，但此增加不是特異的，或與腫瘤本質(zhì)，病程或疾病嚴(yán)重程度相關(guān)的。其它疾病中也觀察到了顯著的增加，諸如紅斑狼瘡，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，舍格倫綜合征，淋巴系統(tǒng)的惡性疾病(多發(fā)性骨髓瘤，b細(xì)胞淋巴瘤)，某些病毒疾病(肝炎或艾滋病)和在血友病患者中。由于β2-微球蛋白通過(guò)腎小球被過(guò)濾，被近曲小管重吸收，它在血液中的濃度在腎臟病理狀況下可被修飾。因此在腎臟病理狀況下或作為獲得性免疫缺陷病毒感染的隨訪，檢驗(yàn)β2-微球蛋白通常對(duì)診斷有保留。然而，此標(biāo)記物被認(rèn)為是腫瘤標(biāo)記物，尤其是結(jié)腸癌的。

蛋白酶體20s標(biāo)記物(也被稱(chēng)為蛋白酶體)是蛋白酶體的中心結(jié)構(gòu)，其自身是負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)泛素化蛋白降解的分子復(fù)合物。蛋白酶體是700kda的分子復(fù)合物，由28個(gè)亞基組成，以4個(gè)7個(gè)亞基的環(huán)相關(guān)聯(lián)。在人中，已知有7個(gè)α基(α1,α2,α3,α4,α5,α6和α7)和10個(gè)β基(β1,β2,β3,β4,β5,β6,β7,β1i,β2i和β5i)。通過(guò)其催化特性的效能，蛋白酶體在細(xì)胞增殖，生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)和凋亡的機(jī)制中，也因此在癌化通路中起中心作用。用硼替佐米(萬(wàn)珂)抑制蛋白酶體是對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的認(rèn)可治療。對(duì)血癌或腫瘤的ii期或iii期治療試驗(yàn)在進(jìn)行中。lavabre-bertrand等人指出，血清水平的蛋白酶體在某些病理狀況下，尤其是在癌癥中(骨髓瘤，淋巴瘤和固態(tài)腫瘤)能升高。

半乳凝集素-3標(biāo)記物(swissprotno.p1793，也被稱(chēng)為gal-3,半乳糖特異性凝集素3，mac-2抗原,ige-結(jié)合蛋白，35kda凝集素,糖類(lèi)結(jié)合蛋白35，cbp35，層粘連蛋白結(jié)合蛋白，凝集素l-29，l-31，半乳糖苷結(jié)合蛋白或galbp)是能結(jié)合n-乙酰氨基乳糖型的β-半乳糖苷酶的凝集素。它是具有多重功能的蛋白，參與許多生物功能，包括腫瘤細(xì)胞的粘附，增殖，分化，血管再生成，凋亡和惡性癌癥的發(fā)展。不同研究顯示gal-3能與許多分子形成復(fù)合物：cea，ige，層粘連蛋白，粘蛋白，mac-2bp，lamp1，lamp2，纖連蛋白等。gal-3的血清測(cè)定被iurisci等人描述過(guò)。gal-3在覆蓋有mac-2-結(jié)合蛋白(gal-3-結(jié)合蛋白)的微板上被捕獲，隨后使用大鼠的抗gal-3抗體來(lái)顯示。此研究顯示在腸道癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，黑色素瘤和非何杰金淋巴瘤的情況下升高了的血清gal-3。

l-乳酸脫氫酶鏈b標(biāo)記物(swissprotno.p07195，也被稱(chēng)為ldh-b,ldh心單位或ldh-h)是能形成復(fù)合物以形成同源四聚體的蛋白。此蛋白也能與l-乳酸脫氫酶a鏈蛋白(swissprotno.p00338，也被稱(chēng)為ldh-a,ldh肌單位或ldh-m)以異源四聚體的形式形成復(fù)合物。在許多固態(tài)腫瘤的血液中，四聚體復(fù)合物，被稱(chēng)為ldh的血清水平和/或血清酶活力與腫瘤塊成比例增加。推薦它與人絨毛膜促性腺激素(β-hgc)和胎盤(pán)堿性磷酸酶結(jié)合使用，用于精囊癌的隨訪。ldh被認(rèn)為是預(yù)測(cè)淋巴癌，白血病和結(jié)腸癌的感興趣的標(biāo)記物。

鈣網(wǎng)蛋白標(biāo)記物(swissprotno.p27797，也被稱(chēng)crp55，calregulin,hacbp，erp60或grp60)是有多種功能的蛋白。它是能短暫地與幾乎內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所有單糖基化蛋白相互作用的凝集素。mccool等人因此指出鈣網(wǎng)蛋白參與結(jié)腸粘蛋白muc2的成熟化。使用組織，糞便或體液中鈣網(wǎng)蛋白的檢驗(yàn)用于診斷crc的方法在專(zhuān)利申請(qǐng)wo03/065003中被描述。

再生性胰島衍生蛋白3α標(biāo)記物(swissprotno.q06141，也被稱(chēng)為regiii-α，胰腺炎相關(guān)蛋白1或胰腺相關(guān)蛋白i(pap1))是在健康胰臟中微弱表達(dá)的蛋白。它在胰腺炎急性期和某些患有慢性胰腺炎的患者中過(guò)表達(dá)。在此情況下，它出現(xiàn)在胰液和血流中。motoo等人通過(guò)elisa測(cè)定指出，某些患有結(jié)腸癌，胃癌，肝癌或胰腺癌的患者血液中的pap1增加了，也在腎功能不全的情況下。為此，他們使用了由dynabio公司(lagaude,france)出售的elisa測(cè)定(pancepap)。

腫瘤相關(guān)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白1標(biāo)記物(swissprotno.p16422，也被稱(chēng)為主要胃腸腫瘤相關(guān)蛋白ga733-2,上皮細(xì)胞表面抗原，epcam，上皮糖蛋白,egp，腺癌相關(guān)抗原，ksa，ks1/4抗原，細(xì)胞表面糖蛋白trop-1或cd326抗原)于1979年通過(guò)其能被直接抗結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的抗體識(shí)別的能力被表征。如上所示，此蛋白有不同的名字，但最通常使用的是稱(chēng)它epcam。它是跨膜蛋白，在某些上皮細(xì)胞和許多癌癥中的細(xì)胞基底外側(cè)表面表達(dá)。早在1982年，herlyn等人指出在患有結(jié)腸直腸癌的患者中注射抗epcam單抗能抑制腫瘤的生長(zhǎng)。這些結(jié)果導(dǎo)致了基于被稱(chēng)為依決可單抗的抗epcam抗體的抗腫瘤治療的發(fā)展。此外，abe等人通過(guò)elisa測(cè)定指出，被稱(chēng)為mk-1的epcam的可溶形式在被研究的癌癥患者血流內(nèi)增加了10％。

細(xì)胞角蛋白是組成上皮細(xì)胞細(xì)胞骨架中間纖維的一部分蛋白。目前，超過(guò)20種人細(xì)胞角蛋白已被鑒定。細(xì)胞角蛋白8(swissprotno.p05787，也被稱(chēng)為細(xì)胞角蛋白-8，ck-8，角蛋白-8或k8)，18(swissprotno.p05783,也被稱(chēng)為細(xì)胞角蛋白-18，ck-18，角蛋白-18或k18)，19(swissprotno.p08727，也被稱(chēng)為細(xì)胞角蛋白-19，ck-19，角蛋白-19或k19)是上皮細(xì)胞中最豐富的，是癌癥病理狀況診斷的有用工具。此臨床重要性與上皮細(xì)胞凋亡或增殖期釋放的細(xì)胞角蛋白相聯(lián)系。在凋亡情況下，此以可溶性片段形式的釋放似乎是在胱天蛋白酶的蛋白水解作用下發(fā)生的。未降解的細(xì)胞角蛋白形式從未在血流中被描述過(guò)。臨床上最常使用的三種細(xì)胞角蛋白測(cè)定是組織多肽抗原(tpa)測(cè)定，組織多肽特異性抗原(tps)測(cè)定和cyfra21-1測(cè)定。tpa是測(cè)量細(xì)胞角蛋白8,18和19的廣譜測(cè)試。tps和cyfra21-1測(cè)定更特異些，特異地測(cè)量細(xì)胞角蛋白18和細(xì)胞角蛋白19的片段。這三種測(cè)定檢測(cè)以它們自身形式或以蛋白復(fù)合物形式存在的可溶性的細(xì)胞角蛋白片段。tpa，tps或cyfra-21-1已被用作結(jié)腸直腸癌，乳腺癌，肺癌，膀胱癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌和某些ent癌癥的治療隨訪。血液中可溶性細(xì)胞角蛋白片段的檢驗(yàn)事實(shí)上在復(fù)發(fā)的篩查或評(píng)估對(duì)使用療法(放射療法，化學(xué)療法，激素治療)的反應(yīng)上有臨床價(jià)值。常規(guī)檢驗(yàn)尤其使評(píng)估腫瘤塊的發(fā)展成為可能。關(guān)于腫瘤階段和轉(zhuǎn)移的形成，可溶性血液細(xì)胞角蛋白的量也有預(yù)測(cè)的一面。目前，最常用的細(xì)胞角蛋白血液測(cè)定是cyfra21-1。它被極度推薦用做患有非小細(xì)胞性肺癌患者的隨訪。存在不同商業(yè)可獲得的對(duì)tpa(absangtecmedicalco.，byk-roland，等)，tps(idlbiotechab，bekidiagnostics，等)和cyfra21-1(rochediagnostics，cisbio-international，fujirebiodiagnostics，等)的測(cè)定。此外，kim等人指出糞便細(xì)胞角蛋白19(dinonainc.)的檢驗(yàn)結(jié)合糞便潛血試驗(yàn)可對(duì)腸胃疾病的篩查有用。

上皮鈣黏著蛋白標(biāo)記物(swissprotno.p12830，也被稱(chēng)為上皮細(xì)胞鈣粘蛋白，桑椹(胚)粘著蛋白，鈣粘蛋白-1，cam120/80或cd324抗原)是一促成鈣依賴(lài)性細(xì)胞粘附的跨膜蛋白。它特異地在上皮細(xì)胞中表達(dá)，其參與維持它們的表型。上皮細(xì)胞鈣粘蛋白的胞質(zhì)域結(jié)合β-連環(huán)蛋白，其自身結(jié)合細(xì)胞骨架的肌動(dòng)蛋白纖維網(wǎng)。此上皮細(xì)胞鈣粘蛋白/β-連環(huán)蛋白的結(jié)合在穩(wěn)固上皮組織的細(xì)胞/細(xì)胞粘附中起必須作用。因此，上皮細(xì)胞鈣粘蛋白的缺失能減少細(xì)胞粘附，增加癌細(xì)胞的侵入能力。上皮細(xì)胞鈣粘蛋白或β-連環(huán)蛋白表達(dá)的減少通常與腫瘤的更大的侵略性和去分化相聯(lián)系，尤其在胃腸癌癥中。roca等人指出患有結(jié)腸直腸癌的患者中，比起有正常表達(dá)水平的患者，上皮細(xì)胞鈣粘蛋白低表達(dá)的有更不利的預(yù)測(cè)。早在1983年，damsky等人指出，可溶性形式的上皮細(xì)胞鈣粘蛋白可由mcf-7乳腺癌細(xì)胞系釋放。此可溶性形式等同于上皮細(xì)胞鈣粘蛋白胞外部分的切割。后來(lái)，katayma等人指出可溶性形式的上皮細(xì)胞鈣粘蛋白在癌癥情況下可被釋放到血流中，willmanns等人指出血液中上皮細(xì)胞鈣粘蛋白量的增加在結(jié)腸直腸癌中與腫瘤的時(shí)期相關(guān)。此外，商業(yè)試劑盒由takarabiochemicals公司(tokyo，japan)提出。

cea(癌胚抗原)的檢驗(yàn)用來(lái)診斷結(jié)腸直腸癌自1965年由gold和freedman提出，但對(duì)此標(biāo)記物的血液測(cè)定靈敏度差，對(duì)用來(lái)診斷結(jié)腸直腸癌處在相對(duì)落后的階段。血清cea的檢驗(yàn)因此特別被推薦用于評(píng)估肝癌轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)和治療隨訪。此外，它是結(jié)腸直腸癌的不很特異的標(biāo)記物，事實(shí)上，它在許多其它癌癥(肺，乳腺，等)中可增加。在另一方面，糞便cea的檢驗(yàn)似乎比血清cea或糞便潛血的檢驗(yàn)更靈敏更特異。然而，此檢驗(yàn)還未被常規(guī)地提出。

反應(yīng)性抗原決定簇1116-ns-19-9，更通常被稱(chēng)為ca19-9(糖抗原19.9)，被高分子量蛋白攜帶。血液中ca19-9的檢驗(yàn)比cea的檢驗(yàn)更特異。血液中ca19-9的水平在結(jié)腸直腸癌，胰腺癌和肝癌(膽管癌)的情況中，也在非癌性病理狀況下(膽管炎等)增加。它的使用結(jié)合cea在癌癥的診斷時(shí)期和病理狀況的隨訪被推薦。

j.holmgren等人指出，血清中ca50抗原的量在結(jié)腸直腸癌情況下增加。ca50抗原通過(guò)其被特異單克隆抗體識(shí)別的能力而被定義。

至于ca72標(biāo)記物，t.l.klug等人指出，血清中ca72抗原的量在結(jié)腸直腸癌情況下增加。ca72抗原通過(guò)其被特異單克隆抗體識(shí)別的能力而被定義。

類(lèi)似地，p.kuusela等人指出，血清中ca242抗原的量在結(jié)腸直腸癌情況下增加。ca242抗原通過(guò)其被特異單克隆抗體識(shí)別的能力而被定義。

人中用于結(jié)腸直腸癌診斷的睪酮檢驗(yàn)由m.holland等人提出。這些作者指出血液中睪酮水平在結(jié)腸直腸癌情況下下降。

至于timp-1，或基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1型標(biāo)記物，專(zhuān)利申請(qǐng)us2007/0020707尤其描述了通過(guò)檢驗(yàn)體液來(lái)檢驗(yàn)timp-1，用于結(jié)腸直腸癌的診斷。

f.model等人在2006年7月的國(guó)際胃腸癌大會(huì)期間指出，有可能探測(cè)患有結(jié)腸直腸癌患者血漿中隔蛋白-9基因的甲基化形式。

m.p.ebert等人指出alx4基因，或無(wú)芒樣同源框-4基因比起對(duì)照血清，在患有結(jié)腸直腸癌患者的血清中更經(jīng)常性地甲基化(p<0.0001)。使用41.4pg/ml的閥值，他們獲得了83.3％的靈敏度和70％的特異性。

絨毛蛋白作為結(jié)腸直腸癌的血液標(biāo)記物在專(zhuān)利申請(qǐng)fr2581456中被描述。

c.bianco等人指出，結(jié)腸直腸癌情況下血清中cripto-1的量增加。

通過(guò)巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(mif)誘導(dǎo)腸腫瘤發(fā)生被wilson等人描述。近來(lái)，lee等人也指出，mif是結(jié)腸直腸癌早期診斷的潛在血液標(biāo)記物。

蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶標(biāo)記物(swissprotno.p07237，也被稱(chēng)為ec5.3.4.1，pdi，脯氨酰4-羥化酶亞基β，細(xì)胞甲狀腺激素結(jié)合蛋白或p55)是多功能的蛋白，其催化分子內(nèi)二硫鍵的形成，打破和重排。在細(xì)胞表面，它作為還原酶切割連接細(xì)胞的蛋白的二硫鍵。在這些細(xì)胞中，它是可溶性分子，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，形成和重排新合成蛋白的二硫鍵。它含2個(gè)硫還氧蛋白催化結(jié)構(gòu)域，有特征性的cxxc模體。在高濃度，pdi以伴侶蛋白行使功能，其抑制錯(cuò)誤折疊蛋白的聚集。在低濃度，它有對(duì)抗性作用，促使聚集。pdi也形成不同酶的結(jié)構(gòu)亞基，諸如催化原膠原前α鏈脯氨酸殘基羥基化的脯氨酰羥化酶。在專(zhuān)利申請(qǐng)ep1724586中，pdi被描述為某些癌癥的診斷標(biāo)記物，諸如結(jié)腸癌。

用于結(jié)腸直腸癌診斷的內(nèi)凝集蛋白-1(swissprotno.q8wwa0，也被稱(chēng)為腸乳鐵蛋白受體，呋喃半乳糖結(jié)合凝集素，內(nèi)皮凝集素hl-1或網(wǎng)膜素)檢驗(yàn)在專(zhuān)利申請(qǐng)us2003/0082533中被描述。

使用翻譯控制性腫瘤蛋白(swissprotno.p13693，也被稱(chēng)為tctp，p23，組胺釋放因子，hrf或fortilin)和防衛(wèi)素原-a5(swissprotno.q01523)作為結(jié)腸直腸癌中的標(biāo)記物分別在專(zhuān)利申請(qǐng)us2003/0172388和us2006/0179496中被描述。術(shù)語(yǔ)“防衛(wèi)素(原)((pro)defensin)”適用于表示前體，即切割前的防衛(wèi)素原，多肽，即防衛(wèi)素原切割后的n-端部分和成熟的蛋白，即防衛(wèi)素，對(duì)應(yīng)于切割后的c-端部分。

m2-pk是丙酮酸激酶的異構(gòu)酶，以二聚體或四聚體形式存在。二聚體形式在腫瘤細(xì)胞中是主導(dǎo)的，為此，被稱(chēng)為腫瘤m2-pk。許多研究使用通過(guò)elisa檢驗(yàn)糞便m2-pk作為結(jié)腸直腸癌的標(biāo)記物，例如hardt等人。

使用鈣粒蛋白c或s100a12蛋白作為結(jié)腸直腸癌的標(biāo)記物在專(zhuān)利申請(qǐng)wo2007/134779中被描述。

sagiv等人指出在結(jié)腸直腸癌情況下cd24表達(dá)的增加。

結(jié)腸癌特異抗體(ccsa)-3和-4蛋白是血清標(biāo)記物，leman等人將其與結(jié)腸直腸癌相關(guān)聯(lián)。

最后，檢驗(yàn)人糞便血紅蛋白在實(shí)踐中已知，能如先前描述那樣實(shí)施。

除防衛(wèi)素原-a6外的腫瘤標(biāo)記物濃度，取決于所考慮的標(biāo)記物，在使用本發(fā)明方法的生物樣品中，相對(duì)于為健康患者確定的參考值增加或減少。

優(yōu)選地，除防衛(wèi)素原-a6外的腫瘤標(biāo)記物選自白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑、埃茲蛋白、酰化氨基酸水解酶1、肝脂肪酸結(jié)合蛋白、腸脂肪酸結(jié)合蛋白、載脂蛋白ai、載脂蛋白aii、i-絲束蛋白、蛋白二硫化物異構(gòu)酶、內(nèi)凝集蛋白-1、細(xì)胞角蛋白20、翻譯控制性腫瘤蛋白、防衛(wèi)素(原)-a5、半乳凝集素-3、β2-微球蛋白、cea、ca19-9、timp-1、m2-pk和mif。

更優(yōu)選地，除防衛(wèi)素原-a6外的腫瘤標(biāo)記物選自標(biāo)記物l-fabp、β2-微球蛋白、半乳凝集素-3、cea、ca19-9、timp-1、mif和i-絲束蛋白。

依照特定的實(shí)施方案，本發(fā)明的方法包括探測(cè)以下標(biāo)記物或由探測(cè)以下標(biāo)記物組成：

-防衛(wèi)素原-a6和l-fabp，

-防衛(wèi)素原-a6、ca19-9和cea，

-防衛(wèi)素原-a6、β2-微球蛋白和cea，

-防衛(wèi)素原-a6、β2-微球蛋白、ca19-9和cea，

-防衛(wèi)素原-a6、β2-微球蛋白、l-fabp和cea，

-防衛(wèi)素原-a6、l-fabp、ca19-9和cea，

-防衛(wèi)素原-a6、β2-微球蛋白、ca19-9和cea，

-防衛(wèi)素原-a6、β2-微球蛋白、ca19-9、l-fabp和cea，

-防衛(wèi)素原-a6、β2-微球蛋白、ca19-9、半乳凝集素-3、l-fabp，mif和cea，

-防衛(wèi)素原-a6、β2-微球蛋白、ca19-9、半乳凝集素-3、l-fabp、mif、i-絲束蛋白和cea。

當(dāng)然，本發(fā)明的方法也包括檢測(cè)任何其它本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的結(jié)腸直腸癌標(biāo)記物。

如先前所指出的，感興趣的腫瘤標(biāo)記物以蛋白形式、或以信使rna形式、或相對(duì)應(yīng)dna的修飾(突變或甲基化修飾)而被檢測(cè)，可理解防衛(wèi)素原-a6僅以蛋白的形式被檢測(cè)，其可以是全蛋白或蛋白片段形式。

確定生物樣品中感興趣的蛋白腫瘤標(biāo)記物的存在，能通過(guò)被本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何方法，確定樣品中蛋白的存在，諸如生化測(cè)試，包括免疫測(cè)定或質(zhì)譜。

生化測(cè)試可是本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍所知的任何測(cè)試，涉及分子相互作用，例如，所述腫瘤標(biāo)記物和一個(gè)或多個(gè)與所述腫瘤標(biāo)記物特異或非特異的結(jié)合配偶體間的反應(yīng)。

優(yōu)選地，生化測(cè)試是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的免疫測(cè)定，涉及作為抗原的腫瘤標(biāo)記物和一個(gè)或多個(gè)特異結(jié)合配偶體，即直接抗此抗原的抗體間的免疫反應(yīng)。

本發(fā)明的方法中尋找的腫瘤標(biāo)記物特異或非特異的結(jié)合配偶體是任何有能力與此或其它標(biāo)記物結(jié)合的配偶體。當(dāng)它們有能力以高特異性與這些標(biāo)記物結(jié)合，或甚至是100％的特異性則將它們稱(chēng)為特異的。當(dāng)它們結(jié)合這些標(biāo)記物的特異性低且它們因此有能力結(jié)合其它配體，諸如蛋白，則將它們稱(chēng)為非特異的。作為舉例，可提及抗體，抗體結(jié)合段，受體和任何其它有能力結(jié)合此標(biāo)記物的分子。

抗體結(jié)合配偶體是，例如，多克隆抗體或單克隆抗體。

依照特定實(shí)施方案，本發(fā)明的方法使用防衛(wèi)素原-a6的特異結(jié)合配偶體，序列seqidno.2。優(yōu)選地，防衛(wèi)素原-a6的特異結(jié)合配偶體是單克隆抗體，能識(shí)別包括在序列seqidno.2中的任何線(xiàn)性或構(gòu)象表位。

優(yōu)選地，單克隆抗體特異地識(shí)別線(xiàn)性表位，至少是序列dp(seqidno.4)，優(yōu)選地至少是序列eddpld(seqidno.6)，至多是序列seqidno.2，或其特異地識(shí)別選自下列表位中的構(gòu)象表位：

-至少是序列x1x2x3x4x5x6x7x8r(seqidno.7)的表位，其中x1是v或l，x2是t或l，x3是p、s或c，x4是p或s，x5是w或t，x6是a、q、m、c或e，x7是i、e或d，以及x8是f、y、s或l，并且最多是序列seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11或seqidno.12的表位，如附圖4中所示，

-至少是序列x1x2x3x4x5x6hx7(seqidno.13)的表位，其中x1是s或t，x2是c或不存在，x3是t、l或e，x4是h或r，x5是i、f或e，x6是g或v，以及x7是c或n，并且最多是序列seqidno.14、seqidno.15或seqidno.16的表位，如附圖4中所示，

-至少是序列x1hpx2x3x4x5x6x7(seqidno.17)的表位，其中x1是p或w，x2是w或e，x3是s、a、q或w，x4是m、l、r或p，x5是h、f、w或g，x6是v或a，以及x7是i或v，并且最多是序列seqidno.18、seqidno.19、seqidno.20或seqidno.21的表位，如附圖4中所示，

-至少是序列x1hx2x3x4x5(seqidno.22)的表位，其中x1是y或n，x2是e、d或q，x3是t、n、r、m或k，x4是w、h或f，以及x5是p或g，并且最多是序列seqidno.23、seqidno.24、seqidno.25、seqidno.26、seqidno.27、seqidno.28或seqidno.29的表位，如附圖4中所示。

特異地識(shí)別防衛(wèi)素原-a6前肽部分的單克隆抗體是新穎的，構(gòu)成本發(fā)明的另一個(gè)主題。

依照實(shí)施方案，本發(fā)明的單克隆抗體特異地識(shí)別至少是序列seqidno.4的表位，優(yōu)選至少是序列seqidno.6(表位1)，并且最多是序列seqidno.2的表位。

依照另一實(shí)施方案，本發(fā)明的抗防衛(wèi)素原-a6單克隆抗體特異地識(shí)別選自以下表位的表位：

-至少是序列seqidno.7的表位，其中x1是v或l，x2是t或l，x3是p、s或c，x4是p或s，x5是w或t，x6是a、q、m、c或e，x7是i、e或d，以及x8是f、y、s或l，并且最多是序列seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11或seqidno.12的表位(表位2)，

-至少是序列seqidno.13的表位，其中x1是s或t，x2是c或不存在，x3是t、l或e，x4是h或r，x5是i、f或e，x6是g或v，以及x7是c或n，并且最多是序列seqidno.14、seqidno.15或seqidno.16的表位(表位3)，

-至少是序列seqidno.17的表位，其中x1是p或w，x2是w或e，x3是s、a、q或w，x4是m、l、r或p，x5是h、f、w或g，x6是v或a，以及x7是i或v，并且最多是序列seqidno.18、seqidno.19、seqidno.20或seqidno.21的表位(表位4)，

-至少是序列seqidno.22的表位，其中x1是y或n，x2是e、d或q，x3是t、n、r、m或k，x4是w、h或f，以及x5是p或g，并且最多是序列seqidno.23、seqidno.24、seqidno.25、seqidno.26、seqidno.27、seqidno.28或seqidno.29的表位(表位5)。

依照另一實(shí)施方案，本發(fā)明的方法使用對(duì)表位1特異的單克隆抗體，和對(duì)表位2、3、4、或5特異的單克隆抗體。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法使用對(duì)表位1特異的單克隆抗體和對(duì)表位2或4特異的單克隆抗體。更優(yōu)選地，本發(fā)明的方法使用對(duì)表位1特異的單克隆抗體和對(duì)表位2特異的單克隆抗體。

術(shù)語(yǔ)“表位”適合于表示肽段具有至少由序列seqidno.s1到29定義的序列，至多有10,8,6或4個(gè)額外的氨基酸以均一的或非均一的方式分布于所考慮序列的兩邊中的一邊，或僅在一邊，也可是其類(lèi)似物，同源物和結(jié)構(gòu)等價(jià)物。

通常，術(shù)語(yǔ)“類(lèi)似物”指的是肽，其具有序列和相對(duì)于天然分子有一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、取代(通常本質(zhì)上說(shuō)是保守的)和/或缺失的天然多肽結(jié)構(gòu)，只要修飾不破壞抗原反應(yīng)性。

尤其優(yōu)選的類(lèi)似物包括本質(zhì)上保守的取代，例如，在氨基酸家族中發(fā)生的取代。具體地，氨基酸通常被分成4族，即(1)酸性氨基酸，諸如天門(mén)冬氨酸和谷氨酸，(2)堿性氨基酸，諸如賴(lài)氨酸，精氨酸和組氨酸，(3)非極性氨基酸，諸如丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸和色氨酸，(4)不帶電荷的極性氨基酸，諸如甘氨酸，門(mén)冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸有時(shí)被劃分為芳香族氨基酸。例如，能合理地預(yù)測(cè)單獨(dú)的用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸，用谷氨酸替代天門(mén)冬氨酸，或用絲氨酸替代蘇氨酸或用一個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸替代另一氨基酸的類(lèi)似保守替代，在生物活性上不會(huì)有很大影響。本領(lǐng)域的技術(shù)人員參考領(lǐng)域中熟知的hopp/woods和kyte-doolite劃分方法容易地決定能經(jīng)受改變的感興趣的肽分子區(qū)域。

術(shù)語(yǔ)“同源性”適合于表示兩個(gè)肽分子間的同一性百分比。兩個(gè)氨基酸序列相互本質(zhì)上同源，當(dāng)序列顯示出至少60％，優(yōu)選地至少75％，更優(yōu)選地至少80-85％，更優(yōu)選地至少90％，更優(yōu)選地至少95-98％或在定義的肽分子長(zhǎng)度中更多的序列同一性。

術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)等價(jià)物”適合于表示包含在感興趣的蛋白內(nèi)的任何線(xiàn)性或非線(xiàn)性的肽序列，具有和感興趣的構(gòu)象表位相同的三維結(jié)構(gòu)，諸如序列seqidno.s7到29的表位，同時(shí)保留抗原反應(yīng)性。這樣的“結(jié)構(gòu)等價(jià)物”可通過(guò)本領(lǐng)的技術(shù)人員從感興趣的構(gòu)象表位中容易地獲得，通過(guò)使用生物信息系統(tǒng)，諸如sumo或superimposé系統(tǒng)，使找到蛋白中的三維結(jié)構(gòu)或亞結(jié)構(gòu)類(lèi)似性成為可能。

多克隆抗體能通過(guò)使用關(guān)注的腫瘤標(biāo)記物免疫動(dòng)物獲得，接著以純化的形式回收要求的抗體，通過(guò)采集所述動(dòng)物的血清，將所述抗體從其它血清成分中分離，尤其是通過(guò)柱子的親和層析，其連接有被抗體特異識(shí)別的抗原，尤其是所述標(biāo)記物。

單克隆抗體能通過(guò)雜交瘤技術(shù)獲得，其一般原則在下文中被總結(jié)。

首先，動(dòng)物，通常是小鼠，被感興趣的腫瘤標(biāo)記物免疫，所述動(dòng)物的b淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生抗此抗原的抗體。這些抗體產(chǎn)生淋巴細(xì)胞被與永生具有分裂能力的骨髓瘤細(xì)胞(例子中是鼠源的)融合以產(chǎn)生雜交瘤。使用因此獲得的細(xì)胞的異質(zhì)混合，選擇有能力產(chǎn)生特定抗體的無(wú)限分裂的細(xì)胞就此完成。每一個(gè)雜交瘤以克隆的形式分裂，每一個(gè)導(dǎo)致單克隆抗體的產(chǎn)生，其就所述腫瘤標(biāo)記物的識(shí)別特性可被測(cè)試，例如，通過(guò)elisa，單向或雙向蛋白印跡，免疫熒光，或生物感應(yīng)器的方式。因此選擇的單克隆抗體尤其依照上面描述的親合層析技術(shù)被后繼純化。

單克隆抗體也可是通過(guò)基因工程獲得的重組抗體，通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。

抗防衛(wèi)素-a6分子的例子已知，尤其可在alphadiagnosticinternationalinc.的產(chǎn)品目錄中獲得。兔抗防衛(wèi)素-a6多克隆抗體，cat.no.hdefa61-a。至今沒(méi)有直接抗防衛(wèi)素原-a6的單克隆抗體。

抗白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑抗體的例子已知，尤其可在abcam的產(chǎn)品目錄中獲得，兔抗lei多克隆抗體，cat.no.ab47731?？筶ei單克隆抗體，克隆ela-1，在yasumatsu等人的文章中被描述。

抗埃茲蛋白抗體的例子已知，尤其可在abcam的產(chǎn)品目錄中獲得，抗埃茲蛋白單克隆抗體，克隆3c12，cat.no.ab4069和兔抗埃茲蛋白多克隆抗體，cat.no.ab47418。

抗?；被崴饷?抗體的例子已知，尤其可在abnova的產(chǎn)品目錄中獲得，抗?；被崴饷?單克隆抗體，克隆4f1-b7，cat.no.h00000095-m01，和abcam產(chǎn)品目錄中，雞抗?；被崴饷?多克隆抗體，cat.no.ab26173。

抗肝脂肪酸結(jié)合蛋白抗體的例子已知，尤其可在abcam的產(chǎn)品目錄中獲得，抗l-fabp單克隆抗體，克隆6b6，cat.no.ab10059，和兔抗l-fabp多克隆抗體，cat.no.ab7807。

抗腸脂肪酸結(jié)合蛋白抗體的例子已知，尤其可在r&dsystems的產(chǎn)品目錄中獲得，抗i-fabp單克隆抗體，克隆323701，cat.no.mab3078和abcam產(chǎn)品目錄中，兔抗i-fabp多克隆抗體，cat.no.ab7805。

抗載脂蛋白ai抗體的例子已知，尤其可在biodesignmeridianlifesciences的產(chǎn)品目錄中獲得，抗apoai單克隆抗體，克隆4a90，cat.no.h45402m和羊抗apoai多克隆抗體，cat.no.k45252p。

抗載脂蛋白aii抗體的例子已知，尤其可在usbiological的產(chǎn)品目錄中獲得，抗apoaii單克隆抗體，克隆1402，cat.no.a2299-31c和biodesignmeridianlifesciences產(chǎn)品目錄中，羊抗apoaii多克隆抗體，cat.no.k74001p。

抗i-絲束蛋白多克隆抗體的例子已知，尤其可在santacruzbiotechnology的產(chǎn)品目錄中獲得。兔多克隆抗體h-300(cat.no.sc-28531)與i-絲束蛋白，l-絲束蛋白和t-絲束蛋白反應(yīng)。本申請(qǐng)已發(fā)展了直接抗i-絲束蛋白的單克隆抗體。

抗β2-微球蛋白，抗cea，抗ca19-9和抗睪酮抗體的的例子已知，尤其在本申請(qǐng)的測(cè)定試劑盒，即β2-微球蛋白，cea，ca19-9^tm和睪酮中被使用。

抗蛋白酶體20s抗體的例子已知，尤其可在affinityresearchproducts的產(chǎn)品目錄中獲得。

抗半乳凝集素-3，抗l-乳酸脫氫酶鏈b，抗鈣網(wǎng)蛋白，抗腫瘤相關(guān)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白1，抗ii型角蛋白細(xì)胞骨架8，抗i型角蛋白細(xì)胞骨架18，抗i型角蛋白細(xì)胞骨架19，抗上皮鈣黏著蛋白，抗絨毛蛋白和抗timp-1抗體的例子已知，尤其可在abcam的產(chǎn)品目錄中獲得。

抗再生性胰島衍生蛋白3α抗體的例子已知，尤其在dynabio檢測(cè)試劑盒(lagaude，france)中被使用。

抗ca242，抗ca50和抗ca72-4抗體的例子已知，尤其可在fujirebio的產(chǎn)品目錄中獲得。

抗內(nèi)凝集蛋白-1抗體的例子已知，尤其可在alexisbiochemicals的產(chǎn)品目錄中獲得，抗內(nèi)凝集蛋白-1單克隆抗體，克隆saly-1，cat.no.alx-804-850-c100和兔抗內(nèi)凝集蛋白-1多克隆抗體，cat.no.alx-210-941。

抗細(xì)胞角蛋白20抗體的例子已知，尤其可在abcam的產(chǎn)品目錄中獲得，抗細(xì)胞角蛋白20單克隆抗體，克隆ks20.8，cat.no.ab962和兔抗細(xì)胞角蛋白20多克隆抗體，cat.no.ab36756。

抗tctp抗體的例子已知，尤其可在abnova的產(chǎn)品目錄中獲得，抗tctp單克隆抗體，克隆3c7，cat.no.157h00007178-m01和抗tctp多克隆抗體，cat.no.157h00007178-a01。

抗防衛(wèi)素a5抗體的例子已知，尤其可在santacruzbiotechnology的產(chǎn)品目錄中獲得，抗防衛(wèi)素a5單克隆抗體，克隆8c8，cat.no.sc-53997，和在alphadiagnosticinternationalinc.的產(chǎn)品目錄中，兔抗防衛(wèi)素a5多克隆抗體，cat.no.hdefa51-a。

本發(fā)明方法尋找的腫瘤標(biāo)記物特異或非特異的結(jié)合配偶體可被用作捕獲試劑，檢測(cè)試劑或捕獲和檢測(cè)試劑。

依照實(shí)施方案，防衛(wèi)素原-a6特異的結(jié)合配偶體被用來(lái)捕獲防衛(wèi)素原-a6，使其有可能改進(jìn)本發(fā)明診斷方法的特異性。

優(yōu)選地，特異識(shí)別表位1的單克隆抗體在捕獲中被使用，和/或特異識(shí)別表位2,3,4或5，優(yōu)選2的表位的單克隆抗體在檢測(cè)中被使用。

免疫反應(yīng)的可視化，例如腫瘤標(biāo)記物/結(jié)合配偶體，可通過(guò)諸如直接或間接的方法的任何檢測(cè)方法來(lái)完成。

在直接檢測(cè)的情況下，例如，不涉及標(biāo)記，免疫反應(yīng)，通過(guò)例如表面等離子共振或攜帶導(dǎo)電多聚物電極的循環(huán)伏安法被觀察。

間接檢測(cè)通過(guò)對(duì)顯示試劑結(jié)合配偶體或?qū)Ω信d趣的腫瘤標(biāo)記物本身的標(biāo)記方法來(lái)完成。在后者情況下，這被描述成競(jìng)爭(zhēng)方法。

術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”適合于表示連接有能力直接或間接生成可被檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記試劑。這些標(biāo)記試劑的非限制清單包含：

·產(chǎn)生可被檢測(cè)的信號(hào)的酶，例如通過(guò)比色法，熒光或發(fā)光，諸如辣根過(guò)氧化物酶，堿性磷酸酶，β-半乳糖苷酶或葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，

·發(fā)色團(tuán)諸如熒光的或發(fā)光的化合物或染料，

·放射性分子諸如³²p，³⁵s或¹²⁵i，和

·熒光分子諸如alexa或藻青蛋白。

間接檢測(cè)系統(tǒng)也可被使用，諸如，有能力與抗配體反應(yīng)的配體。配體/抗配體對(duì)被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，在此情況系，例如以下對(duì)：生物素/鏈霉親和素，半抗原/抗體，抗原/抗體，肽/抗體，糖/凝集素，多核苷酸/多核苷酸互補(bǔ)序列。在此情況下，是配體攜帶結(jié)合配偶體?？古潴w可通過(guò)先前段落中所述的標(biāo)記試劑的方法被直接檢測(cè)，或自身通過(guò)配體/抗配體的方法被檢測(cè)。

這些間接檢測(cè)系統(tǒng)在某些條件下可導(dǎo)致信號(hào)的放大。此信號(hào)放大技術(shù)被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，可參考先前的專(zhuān)利申請(qǐng)fr98/10084或wo-a-95/08000應(yīng)用，或chevalier等人的文章。

取決于所使用的標(biāo)記類(lèi)型，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)加入試劑是標(biāo)記能被可視化。

經(jīng)由上述定義的免疫測(cè)定例子，可提及的是“夾心”方法，諸如elisa，irma和ria，“競(jìng)爭(zhēng)”方法和直接免疫檢測(cè)方法諸如免疫組織化學(xué)，免疫細(xì)胞化學(xué)，蛋白印跡和斑點(diǎn)印跡。

當(dāng)防衛(wèi)素原-a6特異結(jié)合配偶體在“夾心”測(cè)定捕獲中被使用，例如對(duì)表位1特異的抗體，檢測(cè)中除了用作捕獲的結(jié)合配偶體外，會(huì)使用對(duì)防衛(wèi)素原-a6成熟部分(氨基酸66到100)特異的結(jié)合配偶體，或識(shí)別防衛(wèi)素原-a6前肽部分的表位(氨基酸20-65)的結(jié)合配偶體。

質(zhì)譜分析也能在本發(fā)明方法尋找的腫瘤標(biāo)記物的生物液體中被使用，光譜測(cè)定法的原理被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所普遍知道，被例如patterson所描述。

為這么做，將經(jīng)過(guò)或未經(jīng)處理過(guò)的生物樣品，在質(zhì)譜儀中進(jìn)行分析，獲得的光譜與本發(fā)明方法中尋找的腫瘤標(biāo)記物相比較。樣品預(yù)處理的例子在于讓其通過(guò)包含一個(gè)本發(fā)明方法中尋找的腫瘤標(biāo)記物的結(jié)合配偶體的免疫捕獲支持物，例如直接抗本發(fā)明方法中尋找的腫瘤標(biāo)記物的抗體。另一個(gè)樣品預(yù)處理的例子可為生物樣品的初步分級(jí)分離，以分離樣品中的蛋白。在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)中，例如樣品中的主要蛋白可首先被排除。

生物樣品中感興趣的腫瘤標(biāo)記物的“mrna”存在的確定可通過(guò)確定樣品中存在mrna的任何方法來(lái)完成，即mrna的直接檢測(cè)，或mrna的間接檢測(cè)，或本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的確定樣品中rna存在的任何其它方法。

術(shù)語(yǔ)“mrna的直接檢測(cè)”適合于表示生物樣品中mrna自身的顯示。

生物樣品中mrna的直接檢測(cè)可通過(guò)本領(lǐng)域中的技術(shù)人員所知的任何方法來(lái)完成，例如，通過(guò)和mrna的特異結(jié)合配偶體的雜交，其適合通過(guò)pcr或nasba技術(shù)擴(kuò)增后。

術(shù)語(yǔ)“雜交”適用于表示在合適的條件下，兩個(gè)核酸片段以穩(wěn)定和特異的氫鍵相互結(jié)合形成雙鏈復(fù)合物。這些氫鍵在互補(bǔ)的堿基腺嘌呤(a)和胸腺嘧啶(t)(或尿嘧啶(u))間(被稱(chēng)為a-t鍵)，或在互補(bǔ)的堿基鳥(niǎo)嘌呤(g)和胞嘧啶(c)間(被稱(chēng)為g-c鍵)形成。雜交的兩個(gè)核酸片段可是完整的(參考互補(bǔ)的核苷酸片段或序列)，例如此雜交期間獲得的雙鏈復(fù)合物僅包含a-t鍵和c-g鍵。此雜交可是部分的(參考足夠的互補(bǔ)的核苷酸片段或序列)，例如獲得的雙鏈復(fù)合物包含a-t鍵和c-g鍵，使其有可能形成雙鏈復(fù)合物，但也包含不連接互補(bǔ)堿基的堿基。兩個(gè)核酸片段間的雜交取決于被使用的操作條件，尤其是嚴(yán)格性。嚴(yán)格性尤其被定義為兩個(gè)核酸片段的堿基成分的功能，也通過(guò)兩個(gè)核酸片段間的錯(cuò)配率定義。嚴(yán)格性也能取決于反應(yīng)參數(shù)，諸如雜交液中存在的離子種類(lèi)和濃度，變性劑的本性和濃度和/或雜交溫度。所有這些數(shù)據(jù)都被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，合適的條件能被確定。通常，取決于希望雜交的核酸片段的長(zhǎng)度，雜交溫度在大約20和70℃間，尤其在35和65℃間，在一大約濃度為0.5到1m的鹽溶液中。對(duì)mrna特異或非特異的結(jié)合配偶體是任何有能力結(jié)合此mrna的配偶體。經(jīng)由例子，可提及的是核酸探針，擴(kuò)增引物，和任何其它有能力結(jié)合此mrna的分子。

術(shù)語(yǔ)“雜交探針”適合于表示包含從5到100個(gè)核單位，尤其是從10到35個(gè)核單位的核酸片段，在指定條件下具有雜交特異性，以與有重要特異性的感興趣的目標(biāo)基因形成雜交復(fù)合物。雜交探針可包含標(biāo)記以使其能被檢測(cè)。

出于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增引物”適合于表示包含從5到100個(gè)核單位，優(yōu)選地從15到30個(gè)核單位的核酸片段，能起始酶聚合作用，諸如，尤其是酶擴(kuò)增反應(yīng)。術(shù)語(yǔ)“酶擴(kuò)增反應(yīng)”適合于表示通過(guò)至少一種酶的作用產(chǎn)生核酸片段的多拷貝的過(guò)程。這樣的擴(kuò)增反應(yīng)被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，可尤其提及以下技術(shù)：

-pcr(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，在專(zhuān)利us4683195，us4683202和us4800159中被描述，

-nasba(依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增)，專(zhuān)利申請(qǐng)wo91/02818，和

-tma(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增)，專(zhuān)利us5399491。

術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)”適合于表示物理方法或使用諸如greeni或溴化乙錠插入染料的化學(xué)方法，或使用標(biāo)記的檢測(cè)方法。存在許多檢測(cè)核酸的檢測(cè)方法。

出于本發(fā)明的目的，雜交探針可是“檢測(cè)”探針。在此情況下，“檢測(cè)”探針通過(guò)如上所定義的標(biāo)記方法被標(biāo)記。此標(biāo)記存在的功效，使其能檢測(cè)給定檢測(cè)探針和被檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄物間雜交反應(yīng)的存在。

檢測(cè)探針尤其可是“分子信標(biāo)”檢測(cè)探針。這些“分子信標(biāo)”在雜交期間成為熒光的。它們有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，含有熒光團(tuán)和猝滅基團(tuán)。特異環(huán)結(jié)構(gòu)與其互補(bǔ)核酸序列的結(jié)合導(dǎo)致莖的伸展和在合適波長(zhǎng)激發(fā)的熒光信號(hào)的發(fā)射。

雜交探針也可是“捕獲探針”。在這種情況下，“捕獲探針”被固定或能在固體支持物上通過(guò)任何合適的方法被固定，例如，直接地或間接地，例如通過(guò)共價(jià)或吸附。合適的固體支持物被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，經(jīng)由例子，可提及合成材料或天然材料，膠乳，磁性顆粒，金屬衍生物，膠，等。固體支持物可是微量滴定板的形式，膜，如在申請(qǐng)wo-a-94/12670中所描述的，或顆粒。也有可能在支持物上固定幾個(gè)不同的捕獲探針，每一捕獲探針特異針對(duì)一目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物。尤其，有可能使用固定有大量探針的生物芯片作為支持物。

探針在支持物上的固定也被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，可提及通過(guò)直接轉(zhuǎn)移，微沉積，原位合成和光刻法的探針寄存。

生物樣品中dna修飾或編碼感興趣的腫瘤標(biāo)記物的基因異?？赏ㄟ^(guò)任何確定樣品中dna改變的方法來(lái)顯示，即突變的直接檢測(cè)，或感興趣基因座甲基化特征改變的顯示，或任何其它確定樣品中dna改變的方法，被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知。

突變可包括一個(gè)核苷酸點(diǎn)期待另一個(gè)，一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失和一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入。突變可位于感興趣的腫瘤標(biāo)記物基因的編碼區(qū)，或在5’和3’非編碼區(qū)，諸如轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)域或轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域。

顯示突變的策略基于分子生物學(xué)技術(shù)，包含dna提取，通過(guò)pcr或另一擴(kuò)增技術(shù)的擴(kuò)增，雜交和/或測(cè)序的步驟。在結(jié)腸直腸癌的情況下，以下方法被成功地用于糞便dna中突變的檢測(cè)：通過(guò)沉淀的dna濃縮，在磁珠上使用捕獲寡核苷酸富集目標(biāo)，感興趣基因的pcr擴(kuò)增，固相測(cè)序鑒定點(diǎn)突變。相對(duì)于期望的參考片段和突變片段間的不同大小來(lái)鑒定缺失。imperiale等人描述了位于k-ras，apc和p53基因中的一組21個(gè)突變，其使檢測(cè)16/31的侵入性癌癥成為可能。

其它使用的dna標(biāo)記物有bat-26缺失，其是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的標(biāo)記物，被稱(chēng)為長(zhǎng)dna(l-dna)的高可擴(kuò)增性dna，其不是特異的標(biāo)記物，但其似乎反應(yīng)結(jié)腸腔中剝落的腫瘤細(xì)胞的紊亂凋亡。這些標(biāo)記物無(wú)論在它們的靈敏度或它們的特異性上都不令人滿(mǎn)意。

如先前所指出的，dna的改變也可對(duì)應(yīng)于感興趣的腫瘤標(biāo)記物相應(yīng)基因的甲基化特征的修飾。甲基化特征的修飾可對(duì)應(yīng)于低甲基化(甲基化數(shù)量的降低)或超甲基化(甲基化數(shù)量的增加)。改變的單位可位于感興趣的腫瘤標(biāo)記物基因的編碼區(qū)，或在5’和3’非編碼區(qū)，諸如轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)域或轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域。

dna甲基化的分析可使用基于定性和/或定量pcr完成，諸如msp(甲基化特異pcr)，亞硫酸氫鹽測(cè)序，使用甲基化敏感的限制性酶與pcr偶聯(lián)，cobra(結(jié)合亞硫酸氫鹽的限制性分析)和ms-snupe(甲基化敏感的單核苷酸引物延伸)。所有這些技術(shù)在方法學(xué)文章中被詳細(xì)地比較性地綜述了。

在文獻(xiàn)中，幾個(gè)超甲基化的基因在結(jié)腸直腸癌情況下被報(bào)導(dǎo)了。經(jīng)由例子，可提及alx4(無(wú)芒樣同源框-4)基因，tpef/hhp1(含有上皮生長(zhǎng)因子和濾泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白)基因的啟動(dòng)區(qū)域或隔蛋白-9基因。

本發(fā)明的方法中當(dāng)有至少兩個(gè)標(biāo)記物被檢測(cè)時(shí)，它們可被分開(kāi)顯示，例如通過(guò)不同的免疫測(cè)定確定，或同時(shí)在多元測(cè)定中確定。

本發(fā)明的方法中當(dāng)兩個(gè)本質(zhì)不同的標(biāo)記物被檢測(cè)時(shí)，例如蛋白標(biāo)記物和mrna標(biāo)記物，從上述這些被描述的檢測(cè)方法中選擇兩個(gè)不同的檢測(cè)方法可被使用。它們也可被同時(shí)檢測(cè)，在同樣的檢測(cè)介質(zhì)和同樣的反應(yīng)條件下，如在專(zhuān)利申請(qǐng)wo03/104490中描述的。此專(zhuān)利申請(qǐng)中描述的檢測(cè)方法的步驟，其在于同時(shí)檢測(cè)樣品中的雜交和免疫反應(yīng)，樣品可含有由至少一個(gè)核苷酸和至少一個(gè)其它不同性質(zhì)的配體的目標(biāo)分析物，其在于：

(i)在事先覆蓋所述目標(biāo)分析物捕獲配偶體的捕獲表面點(diǎn)上已在反應(yīng)緩沖液中稀釋的已知量的樣品，所述捕獲配偶體包含至少一個(gè)核酸探針和至少一個(gè)抗配體，

(ii)在15℃和60℃的溫度間反應(yīng)，和

(iii)可視化因此獲得的雜交和免疫反應(yīng)。

生物樣品可需要特別處理，因?yàn)樗珊斜景l(fā)明方法尋找的腫瘤標(biāo)記物，同樣地，或它可含有循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，其含有本發(fā)明方法尋找的標(biāo)記物和/或循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，其有能力分泌本發(fā)明方法尋找的標(biāo)記物。

因此，依照本發(fā)明的一實(shí)施方案，生物樣品被預(yù)處理以分離所述液體中含有的循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。

表述“分離循環(huán)的腫瘤細(xì)胞”適合于表示獲得循環(huán)的腫瘤細(xì)胞中富集的細(xì)胞組分。

處理生物樣品以分離循環(huán)的腫瘤細(xì)胞能通過(guò)流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分選，通過(guò)ficoll的富集，通過(guò)覆蓋有特異抗體的磁珠的富集，或通過(guò)任何其它本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的特異富集方法來(lái)完成。

在血液作為生物樣品的情況下，循環(huán)的腫瘤細(xì)胞可通過(guò)ficoll的細(xì)胞分離技術(shù)結(jié)合使用偶聯(lián)于磁珠的抗cd45抗體(dynalbiotechasa,norway)，排除血細(xì)胞的方法被分離。

本發(fā)明方法中尋找的腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)能通過(guò)直接使用從生物樣品中分離的循環(huán)的腫瘤細(xì)胞來(lái)完成，例如用本抗發(fā)明方法中尋找的腫瘤標(biāo)記物的抗體，通過(guò)細(xì)胞離心涂片器在涂片上點(diǎn)上循環(huán)的腫瘤細(xì)胞后，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記這些細(xì)胞。本發(fā)明方法中尋找的腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)也可通過(guò)使用流式細(xì)胞儀的方法直接得到的循環(huán)的腫瘤細(xì)胞中來(lái)完成，如métézeau等人描述的。

在這些條件下，所述的循環(huán)細(xì)胞能在使其能屏蔽本發(fā)明方法中尋找的腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物的條件下被處理。這樣的處理被mathieu等人描述。

本發(fā)明方法中尋找的腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物的檢測(cè)隨后在使細(xì)胞膜可滲透，以允許對(duì)本發(fā)明方法中尋找的標(biāo)記物特異的結(jié)合配偶體的進(jìn)入后來(lái)完成。

本發(fā)明方法中使用的腫瘤標(biāo)記物的直接檢測(cè)，基于循環(huán)細(xì)胞，也可通過(guò)elispot的方法來(lái)完成，例如，通過(guò)申請(qǐng)歸檔的專(zhuān)利申請(qǐng)wo03/076942中描述的方法。此方法是檢測(cè)和/或量化生物樣品中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法，其有能力在體外釋放或分泌一種或多種腫瘤標(biāo)記物，包含：

(i)在連接有至少一種對(duì)所述腫瘤標(biāo)記物特異的結(jié)合配偶體的培養(yǎng)表面底部點(diǎn)上一定量的所述細(xì)胞，

(ii)在一定條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，使它們能釋放或分泌所述腫瘤標(biāo)記物，其在培養(yǎng)表面的底部被免疫捕獲，

(iii)通過(guò)清洗移除細(xì)胞，

(iv)加入至少一種對(duì)所述腫瘤標(biāo)記物標(biāo)記的特異結(jié)合物，和

(v)可視化如此獲得的標(biāo)記。

在腫瘤細(xì)胞中直接檢測(cè)本發(fā)明方法中使用的腫瘤標(biāo)記物也可在所述細(xì)胞培養(yǎng)液中完成，在對(duì)它們?cè)谑蛊淠芊置诒景l(fā)明方法中使用的腫瘤標(biāo)記物的條件下培養(yǎng)之后。

釋放或表達(dá)腫瘤標(biāo)記物的培養(yǎng)條件是常規(guī)條件，如37℃，含5％co2的濕潤(rùn)環(huán)境。

當(dāng)生物樣品為固態(tài)樣品時(shí)，腫瘤標(biāo)記物的存在也可在體內(nèi)，在腫瘤原位被顯示。

為了在體內(nèi)顯示腫瘤標(biāo)記物的存在，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的成像方法可被使用。對(duì)此，所述腫瘤標(biāo)記物的結(jié)合配偶體可被與成像示蹤物偶聯(lián)。

術(shù)語(yǔ)“結(jié)合配偶體與成像示蹤物偶聯(lián)”適合于表示有能力被本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何成像方法檢測(cè)的示蹤物的連接，并直接或間接地產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。因此，示蹤物可是放射性示蹤物，諸如锝-99。在此情況下，患有原始癌癥或轉(zhuǎn)移的器官會(huì)結(jié)合腫瘤標(biāo)記物和其示蹤物。器官發(fā)出的放射能被特殊的相機(jī)拍攝，例如伽馬相機(jī)。儀器收集放射性物質(zhì)產(chǎn)生的閃爍粒從而使器官可能可視化。

在本發(fā)明的另一方法中，示蹤物可包含正電子發(fā)射放射性的物質(zhì)(氟18)。圖像隨后可通過(guò)正電子發(fā)射斷層照相系統(tǒng)獲得。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選方法中，腫瘤標(biāo)記物的配偶體可被與納米顆粒偶聯(lián)。經(jīng)由例子，它們可是超級(jí)磁性納米顆粒，例如在直接細(xì)胞標(biāo)記和通過(guò)核磁共振成像體內(nèi)檢測(cè)的陰離子磁性納米顆粒。它們也可是納米金顆粒。

依靠本發(fā)明的方法，使體內(nèi)腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)成為可能，有可能可視化體內(nèi)結(jié)合有腫瘤標(biāo)記物結(jié)合配偶體的區(qū)域，癌癥產(chǎn)生腫瘤標(biāo)記物，尤其是結(jié)腸直腸癌，和它們的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和涉及的淋巴結(jié)位置。

本發(fā)明的方法能被用于與結(jié)腸直腸癌相關(guān)的早期診斷、篩查、治療隨訪、預(yù)后和復(fù)發(fā)診斷，由于僅僅只有癌細(xì)胞分泌防衛(wèi)素原-a6，此生產(chǎn)取決于癌癥的等級(jí)，其構(gòu)成本發(fā)明的另一主題。

通過(guò)非限制性說(shuō)明的方法給出的下列例子，本發(fā)明會(huì)被更清楚地理解，也通過(guò)附加的附圖1到6，其中：

-附圖1表現(xiàn)的是9個(gè)抗防衛(wèi)素原-a6的單克隆抗體通過(guò)蛋白印跡技術(shù)的比較。圖片顯示相應(yīng)于防衛(wèi)素原-a6肽(seqidno.1，7ng/孔)(附圖1a)和分泌在轉(zhuǎn)染的293t培養(yǎng)細(xì)胞上清中的防衛(wèi)素原-a6蛋白(附圖1b)的條帶量的信號(hào)(強(qiáng)度*mm²)。條帶量的準(zhǔn)確值在表中指出(附圖1c)；

-附圖2表現(xiàn)的是9個(gè)抗防衛(wèi)素原-a6的單克隆抗體通過(guò)點(diǎn)印跡技術(shù)的比較。圖片顯示防衛(wèi)素原-a6肽(seqidno.1)(附圖2a)和防衛(wèi)素原-a6肽(seqidno.3)(附圖2b)相應(yīng)于兩個(gè)點(diǎn)平均量的信號(hào)(強(qiáng)度*mm²)。條帶量的準(zhǔn)確值在表中指出(附圖2c)。此表中給出的比例*100是依照公式：防衛(wèi)素原-a6前肽信號(hào)/防衛(wèi)素原肽信號(hào)*100計(jì)算的；

-附圖3是涉及通過(guò)間接的elisa技術(shù)分析防衛(wèi)素原-a6前肽識(shí)別的圖片。以吸光度單位給出的elisa信號(hào)的準(zhǔn)確值在圖片邊上的表中被指出；

-附圖4總結(jié)了被每個(gè)抗防衛(wèi)素原-a6抗體1h8c9，11b2d2，11e8c9和13e7f3識(shí)別的序列。通過(guò)噬菌體文庫(kù)和結(jié)合被研究的抗體顯示的每個(gè)基序的氨基酸序列以“免疫反應(yīng)基序”框給出。對(duì)每個(gè)抗體，這些免疫反應(yīng)基序被比對(duì)，以確定用粗體顯示的共有序列；

-附圖5表示的是使用1h8c9檢測(cè)抗體，對(duì)5個(gè)直接抗表位1的抗防衛(wèi)素原-a6單克隆抗體使用夾心elisa的反應(yīng)性分析。使用的抗原是轉(zhuǎn)染的293t培養(yǎng)細(xì)胞含有分泌的防衛(wèi)素原-a6的上清。此上清被稀釋到1/100或1/200。以rfv表示的elisa的準(zhǔn)確值在圖片邊上的表中被指出；

-附圖6是涉及通過(guò)elisa檢驗(yàn)防衛(wèi)素原-a6的圖片，以pg/ml，在患有結(jié)腸直腸腺癌患者的血清中(crc+)，在健康個(gè)體(crc-)，在患有消化炎癥疾病的患者(idd)和患有結(jié)腸直腸腺瘤的患者；

-附圖7表示在mcx小柱上通過(guò)固相萃取分級(jí)分離優(yōu)化的防衛(wèi)素原-a6肽eplqaeddplqak(seqidno.30)。圖片表示對(duì)應(yīng)于肽727/556轉(zhuǎn)換的峰面積對(duì)于在mcx小柱上實(shí)行分離分級(jí)的緩沖液ph值的函數(shù)。附圖7a：溶于水的防衛(wèi)素原-a6；附圖7b：溶于健康個(gè)體人血清的防衛(wèi)素原-a6。

實(shí)施例1：編碼腫瘤標(biāo)記物基因的克隆和重組蛋白的表達(dá)

對(duì)于腫瘤標(biāo)記物?；被崴饷?，lei，l-fabp，埃茲蛋白，i-絲束蛋白，gal-3，絨毛蛋白，i-fabp和鈣網(wǎng)蛋白，cdna的擴(kuò)增和克隆，表達(dá)載體的構(gòu)建和重組蛋白的表達(dá)和純化在專(zhuān)利申請(qǐng)wo2009/024691中被詳細(xì)描述。

1.通過(guò)轉(zhuǎn)染在人細(xì)胞中表達(dá)防衛(wèi)素原-a6蛋白

含有防衛(wèi)素原-a6基因cdna的表達(dá)載體(pcmv6-xl5defa6)被購(gòu)自origene公司(cat.no.sc303095)。被引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，此載體使在cmv啟動(dòng)子的控制下表達(dá)防衛(wèi)素原-a6蛋白成為可能。

hek293t人胚腎細(xì)胞被維持在含有10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液中，37℃含5％co2。細(xì)胞增殖至50％和70％間時(shí)使用以下兩種轉(zhuǎn)染試劑之一轉(zhuǎn)染pcmv6-xl5defa6表達(dá)質(zhì)粒：invitrogen出售的lipofectamineltx(catno.15338-100)或euromedex出售的transitlt-1(catno.mir2300)。在兩種情況下，依照試劑的生產(chǎn)商提供的程序完成轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)然后，細(xì)胞被孵育48小時(shí)以允許防衛(wèi)素原-a6蛋白的生產(chǎn)。接著，培養(yǎng)液上清被收獲，離心，隨后過(guò)濾以除去細(xì)胞碎片。分泌到培養(yǎng)液上清中的防衛(wèi)素原蛋白經(jīng)歷了所有對(duì)其折疊所必需的翻譯后修飾；它是天然的。正是此上清在抗防衛(wèi)素原-a6單克隆抗體的篩查和這些抗體的表征中被用作防衛(wèi)素原-a6蛋白的來(lái)源。

2.肽的化學(xué)合成

對(duì)應(yīng)于防衛(wèi)素原-a6蛋白不同部分的三個(gè)肽依照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的程序通過(guò)化學(xué)合成獲得(neomps)。序列在seqidno.1中指出的肽對(duì)應(yīng)于防衛(wèi)素原-a6的整個(gè)序列，不含在多肽鏈遷移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)期間被切割的信號(hào)肽。此肽被稱(chēng)為防衛(wèi)素原-a6肽或防衛(wèi)素原-a6前體。序列在seqidno.2中指出的肽對(duì)應(yīng)于防衛(wèi)素原-a6前體的整個(gè)前肽部分。此肽被稱(chēng)為防衛(wèi)素原-a6前肽或防衛(wèi)素原-a6前肽部分。序列在seqidno.3中指出的肽幾乎對(duì)應(yīng)于防衛(wèi)素原-a6前體的整個(gè)前肽部分。n-末端的4個(gè)氨基酸沒(méi)有包括在序列中。此肽比起序列為seqidno.2的肽更易大量生產(chǎn)，當(dāng)4個(gè)氨基酸的存在非必需時(shí)被用作替代。

seqidno.1:

eplqaeddplqakayeadaqeqrgandqdfavsfaedassslralgstraftchcrrscysteysygtctvmginhrfccl

seqidno.2:

eplqaeddplqakayeadaqeqrgandqdfavsfaedassslralgs

seqidno.3:

aeddplqakayeadaqeqrgandqdfavsfaedassslralgs

實(shí)施例2：直接抗腫瘤標(biāo)記物的單克隆抗體的生產(chǎn)

1.動(dòng)物模型

免疫試驗(yàn)在首次免疫時(shí)年齡為6到8周的雌性balb/c(h-2^d)小鼠中完成。

2.免疫原和免疫

為了增加在小鼠中獲得的免疫反應(yīng)并能夠產(chǎn)生單克隆抗體，腫瘤標(biāo)記物以重組蛋白或依照實(shí)施例1中描述的過(guò)程生產(chǎn)合成肽的方式被生產(chǎn)。ldh蛋白從scipac公司獲得(cat.no.103-133)。當(dāng)合成肽被用作免疫原時(shí)，它們與攜帶蛋白偶聯(lián)，諸如牛血清白蛋白(bsa)或klh(鑰孔血藍(lán)蛋白)。這些蛋白被與freund佐劑(sigma)體積混合，以油包水乳劑的形式被制備，其已知具有良好的免疫原能力。三只小鼠被用每種腫瘤標(biāo)記物免疫。小鼠在0,2,4周連續(xù)接受三次10μg劑量的免疫原。所有注射均為皮下的。首次注射給以完整的freund佐劑混合物，接下來(lái)的兩次給予不完整的freund佐劑混合物。首次注射后在d50和d70間，體液反應(yīng)使用靜脈注射100μg重組蛋白被再次刺激。對(duì)于防衛(wèi)素原-a6，兩個(gè)不同系列的免疫被完成。第一組小鼠接受偶聯(lián)于bsa和klh的(依照注射交替)防衛(wèi)素原-a6肽(seqidno.1)。第二組小鼠接受偶聯(lián)于bsa和klh的(依照注射交替)防衛(wèi)素原-a6肽(seqidno.2)?？狗佬l(wèi)素原-a6抗體從分屬于兩組的動(dòng)物中獲得。

3.體液反應(yīng)出現(xiàn)的監(jiān)控

為了監(jiān)測(cè)抗體的出現(xiàn)，血液樣品定期地從小鼠中被采集?？鼓[瘤標(biāo)記物抗體的存在使用elisa被測(cè)試。感興趣的蛋白被用作捕獲(1μg/孔)；飽和后，測(cè)試血清的不同稀釋系列被與抗體反應(yīng)(37℃孵育1小時(shí))。血清中特異抗體的存在使用affinipure的偶聯(lián)于堿性磷酸酶的羊抗小鼠igg抗體(h+l，jacksonimmunoresearch，catno.115-055-146)來(lái)顯示，其結(jié)合被尋找的抗體(0.1μg/孔)。

4.單克隆抗體的生產(chǎn)

末次注射三天后，對(duì)每一種腫瘤標(biāo)記物，處死一只被免疫的小鼠；血液和脾被移除。從脾獲得的脾細(xì)胞與sp2/0-ag14骨髓瘤細(xì)胞一起培養(yǎng)以使它們?nèi)诤铣蔀橛郎?，依?imgfile="bda0001233775070000301.gif"wi="166"he="52"img-content="drawing"img-format="gif"orientation="portrait"inline="no"/>和milstein描述的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃。在孵育12-14天后，獲得的雜交瘤的上清被篩選以確定抗腫瘤標(biāo)記物抗體的存在，使用此實(shí)施例第三點(diǎn)中描述的elisa測(cè)定。當(dāng)連接有bsa或klh的合成肽被用作免疫原時(shí)，直接抗bsa和klh的克隆通過(guò)完成用游離的bsa或kl用作捕捉的elisa篩選被去除。陽(yáng)性的雜交瘤克隆依照有限稀釋技術(shù)被二次亞克隆，其被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。

5.通過(guò)免疫印跡表征單克隆抗體

直接抗?；被崴饷?，lei，埃茲蛋白，i-絲束蛋白，gal-3,鈣網(wǎng)蛋白和ldh腫瘤標(biāo)記物的單克隆抗體在專(zhuān)利申請(qǐng)wo2009/024691中被描述。

1h8c9，11b2d2，13e7f3，11e8c9，6e1b4，10c2g3，12f3f2，12f8e4和12h4e1單克隆抗體直接抗防衛(wèi)素原-a6通過(guò)完成此實(shí)施例第1到第4點(diǎn)中描述的技術(shù)被獲得。

5.1方法學(xué)

轉(zhuǎn)染的293t細(xì)胞系培養(yǎng)提取物通過(guò)直接用600μl含0.5％tritonx-100和蛋白酶抑制劑的pbs裂解，隨后依照nupagenovex膠樣品制備實(shí)驗(yàn)計(jì)劃(invitrogen)來(lái)制備。為獲得組織提取物，患者clsp105的腫瘤和粘膜活組織使用解剖刀被分離，隨后受到10輪提取，在medimachine系統(tǒng)(bectondickinson)中使用50μmmedicon，在含有2.5mmedta和蛋白酶抑制劑(rochecomplete^tm藥片)的1mlpbs緩沖液中。10ml的這些細(xì)胞上清被集中，補(bǔ)足到25ml，隨后600g離心15分鐘。上清對(duì)應(yīng)于依照nupagenovex膠樣品制備實(shí)驗(yàn)計(jì)劃處理的組織提取物。減縮的樣品被使用，終總蛋白濃度為0.4mg/ml。在nupagenovexbis-tris4-12％膠上，上樣量為每孔20μl，使用mes電泳緩沖液。遷移后(200v，1小時(shí))，轉(zhuǎn)到pvdf膜上(400ma，45分鐘)，轉(zhuǎn)膜質(zhì)量通過(guò)酰胺黑染色檢驗(yàn)。

膜用tnt(15mmtris，0.14mnacl，0.5％tween20，ph8)溶液配的5％的脫脂奶(régilait)在室溫飽和1小時(shí)。飽和后，膜與不同被稀釋到10μg/ml測(cè)試抗體在飽和溶液中孵育1小時(shí)。用tnt漂洗后，膜與1：5000稀釋的抗小鼠偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶(catno.115-035-062，jacksonimmunoresearch)在飽和溶液中室溫孵育1小時(shí)。漂洗后，顯影通過(guò)substratesupersignalwestduraextended試劑盒(catno.34076，pierce)依照使用推薦信息完成。附圖1中展示的實(shí)驗(yàn)曝光時(shí)間為2分鐘，表1中展示的實(shí)驗(yàn)曝光時(shí)間為100秒。

膜上的化學(xué)發(fā)光信號(hào)使用biorad的versadoc5000成象系統(tǒng)被測(cè)量。基于蛋白印跡的影像，對(duì)應(yīng)于不同腫瘤標(biāo)記物的帶體積使用quantityonesoftware(bio-rad)被評(píng)估。體積對(duì)應(yīng)于化學(xué)發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度乘以帶的表面積。

5.2結(jié)果

附圖1和表1中再現(xiàn)的蛋白印跡結(jié)果給出了帶體積對(duì)應(yīng)于用于蛋白印跡分析的感興趣的腫瘤標(biāo)記物，作為被測(cè)試的不同樣品的函數(shù)。含有分泌的防衛(wèi)素原-a6和防衛(wèi)素原-a6肽(7ng每孔)的轉(zhuǎn)染有pcmx-xl5-防衛(wèi)素原-a6質(zhì)粒的293t細(xì)胞培養(yǎng)液上清被使用，來(lái)評(píng)估9個(gè)抗防衛(wèi)素原-a6抗體蛋白印跡的反應(yīng)性(附圖1)。所有抗體識(shí)別防衛(wèi)素原-a6肽。所有抗體，除了單克隆11e8c9，識(shí)別在被使用的實(shí)驗(yàn)條件下分泌到培養(yǎng)液上清中的防衛(wèi)素原-a6。然而獲得的信號(hào)強(qiáng)度非常不同。顯示并非所有抗體具有同樣的反應(yīng)性。表1中展示的結(jié)果顯示，被測(cè)試的腫瘤標(biāo)記物在從患者獲得的腫瘤組織中很好地表達(dá)。防衛(wèi)素原-a6不被caco-2或ht-29結(jié)腸細(xì)胞系表達(dá)；因此，這些裂解液未被包括在分析中。

樣品中使用抗體獲得的信號(hào)強(qiáng)度能被與其它使用同一抗體的樣品獲得的信號(hào)相比較。所使用的技術(shù)使可能確認(rèn)組織中(非遠(yuǎn)離樣品)標(biāo)記物的存在或缺失，以及與標(biāo)記物有關(guān)的抗體的特異性。此技術(shù)在此實(shí)施例中未被使用在遠(yuǎn)離的樣品中，因?yàn)樗荒芫瓦h(yuǎn)離的樣品中的腫瘤標(biāo)記物的存在或缺失得出結(jié)論，也不能確定所述腫瘤標(biāo)記物的濃度在所述樣品中是否增加或降低。另外，使用的實(shí)驗(yàn)方案使其不能就一種抗體的反應(yīng)性和另一種比較。

表1

6.通過(guò)點(diǎn)印記分析單克隆抗體識(shí)別防衛(wèi)素原-a6前肽

6.1方法學(xué)

點(diǎn)印跡分析使用防衛(wèi)素原-a6肽(seqidno.1，濃度0.1mg/ml)和防衛(wèi)素原-a6前肽(seqidno.3，濃度2.38mg/ml)完成。每種樣品滴被雙份點(diǎn)樣在硝酸纖維素膜上(transblottransfermedium，bio-rad)，隨后在敞開(kāi)空氣中被干燥。

免疫顯影實(shí)驗(yàn)計(jì)劃與在此實(shí)施例5.1段落中描述的一致。此實(shí)驗(yàn)的曝光時(shí)間是1分鐘。

6.2結(jié)果

所有被測(cè)試的抗體在點(diǎn)印跡中識(shí)別防衛(wèi)素原-a6肽(seqidno.1)(附圖2)。此技術(shù)中最具反應(yīng)性的抗體是10c2g3克隆。6e1b4，12f3f2，12f8e4和12h4e1抗體形成同質(zhì)組，反應(yīng)性小于10c2g3，但比1h8c9，11b2d2，13e7f3和11e8c9組大些，其更為不同質(zhì)。另外，蛋白印跡和點(diǎn)印跡的反應(yīng)性不總相一致：在點(diǎn)印跡中，6e1b4，12f3f2，12f8e4和12h4e1抗體具有相似的反應(yīng)性，而在蛋白印跡中獲得的信號(hào)強(qiáng)度是不同的(附圖1和2)。蛋白印跡是在變性條件下完成的，而對(duì)于點(diǎn)印跡，肽未被變性直接點(diǎn)樣。

僅6e1b4，10c2g3，12f3f2，12f8e4和12h4e1抗體在點(diǎn)印跡中識(shí)別防衛(wèi)素原-a6前肽(seqidno.3)。1h8c9，11b2d2，13e7f3和11e8c9抗體未顯示任何與防衛(wèi)素原-a6前肽(seqidno.3)的顯著反應(yīng)性，表明它們的表位位于防衛(wèi)素原-a6前體的成熟的防衛(wèi)素-a6部分。因此，在與防衛(wèi)素原-a6前肽(seqidno.3)反應(yīng)的5個(gè)抗體中，其最小表位含有在此序列中，6e1b4，10c2g3，12f3f2和12f8e4抗體都展示出相同的反應(yīng)性特性：對(duì)所有這些抗體，獲得的信號(hào)比率(防衛(wèi)素原-a6前肽/防衛(wèi)素-a6肽*100，附圖2)在29和31之間。12h4e1克隆與這些其它的抗防衛(wèi)素原-a6前肽抗體不同，因?yàn)榇吮嚷适?。它識(shí)別前肽相比其它4個(gè)抗體要不好些。

7.通過(guò)間接elisa分析單克隆抗體識(shí)別防衛(wèi)素原-a6前肽

7.1方法學(xué)

96孔板(為nunc，maxisorp型)使用pbs稀釋至2μg每孔的防衛(wèi)素原-a6前肽(seqidno.3)覆蓋，室溫過(guò)夜。板子用pbs-0.05％tween20(pbs-t)配的10％的牛奶于37℃飽和1小時(shí)。在pbs-t中完成3次清洗，稀釋在含有1％bsa的pbs-t中的生物素標(biāo)記的測(cè)試抗體以0.2μg/孔被放置到板上，孵育于37℃，1小時(shí)。pbs-t洗三次后，偶聯(lián)有辣根過(guò)氧化物酶的鏈霉親和素(jacksonimmunoresearchcat.no.016-030-084，在含有1％bsa的pbs-t中稀釋1/20000，100μl/孔)被加入。37℃孵育1小時(shí)和三次pbs-t清洗后，加入opteia底物(bd)，100μl/孔。20分鐘后，當(dāng)顯色產(chǎn)生后，用5n硫酸的終止反應(yīng)，測(cè)量450nm的吸收。展示的結(jié)果是兩次測(cè)量的平均值，平均背景噪聲(0.02光密度單位)未被扣除。

7.2結(jié)果

間接elisa測(cè)定的結(jié)果在附圖3中被展示。在使用的實(shí)驗(yàn)條件下，僅4個(gè)抗體，6e1b4，10c2g3，12f3f2和12f8e4結(jié)合吸附到固相上的防衛(wèi)素原-a6前肽。其它5個(gè)抗體，包括12h4e1，不以此形式結(jié)合前肽。此實(shí)驗(yàn)證實(shí)了點(diǎn)印跡的結(jié)果(附圖2)，并確證了即便12h4e1單克隆抗體識(shí)別防衛(wèi)素原-a6前肽，它的反應(yīng)性相比其它4個(gè)單克隆6e1b4，10c2g3，12f3f2和12f8e4要小很多。

8.使用光點(diǎn)掃描和噬菌體顯示肽文庫(kù)篩選技術(shù)表征被單克隆抗體識(shí)別的表位

8.1方法學(xué)

依照f(shuō)rank和改良的光點(diǎn)掃描技術(shù)，使同時(shí)合成結(jié)合于纖維素膜的大量肽成為可能。這些肽再現(xiàn)了以8到12個(gè)氨基酸肽形式的目標(biāo)抗原序列，重疊1到4個(gè)殘基。這些肽隨后被與在印跡類(lèi)型比色試驗(yàn)中研究的抗體接觸，有免疫反應(yīng)性的肽的鑒定使其可能推測(cè)抗體表位的最小序列和將其精確定位在抗原上。

合成在纖維素膜上完成，其均勻地?cái)y帶有長(zhǎng)度為8到10個(gè)單位的聚乙二醇(peg)臂，在鏈的末端具有自由nh2功能。其從肽的c-末端向n-末端發(fā)生。氨基酸的氨基功能使用fmoc(9-氟甲氧羰基)基來(lái)檢測(cè)，它們的側(cè)鏈，在合成期間能進(jìn)行反應(yīng)，也被三苯甲基，叔丁基或叔丁乙醚基保護(hù)。氨基酸母液以0.33m的濃度在含有0.5mhobt(羥基苯并三唑)的mnp(n-甲基吡咯烷酮)中制備。氨基酸使用asp222自動(dòng)控制裝置加樣(abimed，langenfeld，germany)，通過(guò)autospotxl軟件來(lái)控制。此自動(dòng)控制裝置的使用使同時(shí)完成4張96孔膜成為可能。例如384個(gè)肽。

對(duì)一個(gè)氨基酸偶聯(lián)循環(huán)，自動(dòng)控制裝置在膜上點(diǎn)0.7μl即時(shí)活化的氨基酸溶液(一個(gè)體積的nmp稀釋的1.1m的二異丙基碳二亞胺溶液用于三個(gè)體積的氨基酸儲(chǔ)備溶液)。此點(diǎn)樣被重復(fù)第二次，隨后，膜用dmf(二甲基甲酰胺)漂洗。沒(méi)有反應(yīng)的nh2基團(tuán)隨后被乙酰化，在含有10％乙酸酐溶液的dmf中通過(guò)4到6次10分鐘的孵育，以防止異常的或截?cái)嗟碾牡某霈F(xiàn)。在dmf中三次2分鐘的清洗后，保護(hù)氨基酸氨基功能的fmoc基團(tuán)通過(guò)含有20％哌啶溶液的dmf被剪切。在dmf中清洗四次后，樣品點(diǎn)使用含1％溴酚藍(lán)溶液的dmf染色，隨后膜在甲醇中被三次漂洗，在后繼的偶聯(lián)循環(huán)前在敞開(kāi)空間中被干燥。

對(duì)每個(gè)新的氨基酸的添加此實(shí)驗(yàn)計(jì)劃被重復(fù)。在偶聯(lián)最后的氨基酸后，肽被乙?；允鼓芷帘嗡凶杂傻膎h2基團(tuán)，從而防止另一個(gè)氨基酸的添加。所有氨基酸的側(cè)鏈隨后通過(guò)把膜在三氟乙酸/二氯甲烷/三異乙基硅烷(5:5:0.3)中孵育1小時(shí)被去保護(hù)。膜隨后在敞開(kāi)空氣中被干燥并貯存于–20℃直至免疫顯影，之前在二氯甲烷中被漂洗四次，dmf中三次，甲醇中三次。

為使用單克隆抗體來(lái)免疫顯影樣品點(diǎn)，膜首先在甲醇中被漂洗，隨后在tbs(50mmtris-hcl，ph8.0，140mmnacl，3mmkcl)中被清洗，在被于飽和溶液中(用tbs-0.05％tween20(tbs-t)和含有5％蔗糖的酪蛋白10x濃縮溶液(蛋白印跡封閉試劑，roche)稀釋)室溫過(guò)夜孵育前。在tbs-t中洗一次10分鐘后，膜與用飽和溶液稀釋到20μg/ml的單克隆抗體在37℃孵育1小時(shí)30分鐘。膜隨后再tbs-t中被洗三次，再與堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗小鼠偶聯(lián)物孵育(jacksonimmunoresearch)，在飽和溶液中稀釋到1/2000。在兩次10分鐘于tbs-t中清洗，隨后兩次于cbs(10mm檸檬酸,ph7，140mmnacl，3mmkcl)中清洗后，即時(shí)準(zhǔn)備的顯影劑(600μm5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，720μm溴化噻唑藍(lán)四唑和5mmmgcl2在cbs中)與膜在暗處接觸30到45分鐘。免疫反應(yīng)性的肽出現(xiàn)藍(lán)紫色。雙蒸水中漂洗三次后，膜被掃描隨后保存于水中直至再生。

再生使其可能移除結(jié)合于肽的抗體和偶聯(lián)物，從而使其可能完成與另一個(gè)抗體相關(guān)的進(jìn)一步的免疫反應(yīng)性測(cè)試。膜歷經(jīng)一系列的清洗，每次10分鐘：一次在雙蒸水中，六次在dmf中，三次在再生緩沖液a中(8m尿素，35mmsds(十二烷基硫酸鈉)，0.1％β-巰基乙醇)，三次在再生緩沖液b中(雙蒸水/乙醇/醋酸4:5:1)，兩次在甲醇中。膜隨后于貯存前在敞開(kāi)空氣中被干燥。

通過(guò)噬菌體展示肽庫(kù)篩選對(duì)表位的表征，使用newenglandbiolabs的商業(yè)phd12噬菌體展示肽庫(kù)試劑盒(cat.no.e#8110s)完成，依照試劑盒提供的指示，日期為2007年11月，版本為2.7的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃。

8.2結(jié)果

表2再現(xiàn)了被五個(gè)抗防衛(wèi)素原-a6前肽抗體識(shí)別的表位，其表位通過(guò)光點(diǎn)掃描技術(shù)被分析。所有這些抗體識(shí)別防衛(wèi)素原-a6前體的相同區(qū)域，坐落于依照從起始甲硫氨酸(表位1)編號(hào)的氨基酸25和30之間。在另一方面，被不同單克隆識(shí)別的確切序列是不一致的。因此，10c2g3克隆識(shí)別兩個(gè)氨基酸(dp)的最小序列，而12h4e1和6e1b4克隆需要有六個(gè)氨基酸(eddplq)的最小序列來(lái)結(jié)合。附圖2和3中展示的結(jié)果顯示10c2g3克隆使其可能在識(shí)別防衛(wèi)素原-a6肽的點(diǎn)印跡和間接elisa中獲得最高的信號(hào)。令人吃驚的是，12h4e1克隆與其它直接抗防衛(wèi)素原-a6的抗體不同(附圖2和3)，雖然識(shí)別的最小序列與6e1b4抗體一致。12h4e1抗體在總前體蛋白(seqidno.1)的情況下比起在防衛(wèi)素原-a6前肽(seqidno.3)的情況下更好地識(shí)別eddplq序列(seqidno.6)

表2

^a防衛(wèi)素原-a6結(jié)合被測(cè)試抗體區(qū)域的氨基酸序列。圓括號(hào)間的數(shù)字相應(yīng)于防衛(wèi)素原-a6氨基酸序列上的表位位置，編號(hào)始于起始甲硫氨酸。

被1h8c9，11b2c2，13e7f3和11e8c9抗體識(shí)別的表位不能通過(guò)光點(diǎn)掃描技術(shù)被確定，其指出它們不是線(xiàn)性的。噬菌體展示肽庫(kù)篩選使其可能選擇分別與1h8c9，11b2c2，11e8c9和13e7f3抗體反應(yīng)的5,3,7和4模擬位。這些模擬位的序列在附圖4中給出。對(duì)每一個(gè)抗體，被識(shí)別的或免疫反應(yīng)性模擬位的序列被比對(duì)，以確定一致序列，其在附圖4中以粗體指出，其代表了被抗體識(shí)別的最小序列。在防衛(wèi)素原-a6的一級(jí)結(jié)構(gòu)(或肽序列)中不能發(fā)現(xiàn)即便一個(gè)這樣的一致序列。因此，這些一致序列對(duì)應(yīng)于分散在蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的殘基，其在它們的三維結(jié)構(gòu)上享有近似，以形成構(gòu)象表位。

9.通過(guò)夾心elisa檢測(cè)防衛(wèi)素原-a6

9.1方法學(xué)

防衛(wèi)素原-a6通過(guò)例如elisa自動(dòng)系統(tǒng)(biomérieux)的夾心免疫測(cè)定的使用被檢測(cè)。此類(lèi)測(cè)試也能在微板上以自動(dòng)或手動(dòng)的方式完成。要這樣做，elisa測(cè)定使用hbsagultra試劑盒(biomérieux，cat.no.30315)的試劑來(lái)構(gòu)建。試劑如在相應(yīng)的產(chǎn)品信息(ref.11728d–fr–2005/05)中描述的被使用，外加以下修飾：

1.錐體使用九個(gè)用于測(cè)試的捕獲抗體來(lái)敏化，濃度為10μg/ml。

2.hbsagultra柱的第二孔中的內(nèi)含物被300μl用于測(cè)試的偶聯(lián)于生物素，在hbsagultra試劑盒的第二孔的緩沖液中(無(wú)羊血清)稀釋到1μg/ml的揭示抗體(1h8c9和11e8c9)替換。

3.轉(zhuǎn)染有pcmx-xl5-防衛(wèi)素原-a6質(zhì)粒，含有分泌的防衛(wèi)素原-a6的293t的培養(yǎng)液上清被直接單純的或用pbs稀釋后加入到hbsagultra柱的第二孔中(50μl)。

4.elisa反應(yīng)使用自動(dòng)系統(tǒng)和hbsagultra實(shí)驗(yàn)計(jì)劃完成，其孵育樣品和捕獲及揭示抗體采用100個(gè)循環(huán)。

5.結(jié)果以粗值的形式獲得。信號(hào)以rfv，相對(duì)熒光值。

9.2結(jié)果

表2再現(xiàn)了轉(zhuǎn)染有pcmx-xl5-防衛(wèi)素原-a6質(zhì)粒和含有天然防衛(wèi)素原-a6蛋白的293t培養(yǎng)液上清中以1/2稀釋的不同抗體組合的反應(yīng)性。

表3^a

^avidas夾心免疫測(cè)定中的信號(hào)，以rfv(相對(duì)熒光單位)。

*：?jiǎn)渭兩锨鍣z驗(yàn)信號(hào)。其它的上清被稀釋到1/2。

表2展示的結(jié)果顯示其可能使用基于不同表位組合的夾心elisa來(lái)探測(cè)防衛(wèi)素原-a6：例如，表位no.5和4，表位no.1和4，或優(yōu)選地表位2和任何其它被鑒定的表位(1,3,4,5)的組合。更優(yōu)選地，表位2被用于檢測(cè)。在另一方面，表位no.2和4或no.3和4的組合使其不能檢測(cè)防衛(wèi)素原-a6。

用于捕獲的，直接抗表位1的抗體反應(yīng)性的更精細(xì)的分析，結(jié)合1h8c9克隆，在附圖5中被展示。12h4e1克隆是最佳的捕獲抗體，處于第二位置的是10c2g3和12f3f2克隆。最低信號(hào)被從6e1b4和12f8e4抗體獲得。此結(jié)果很令人吃驚，因?yàn)?e1b4和12h4e1克隆識(shí)別相同的最小序列。

實(shí)施例3：腫瘤標(biāo)記物的血清測(cè)定

1.患者和樣品

血液樣品從分布于法國(guó)的八個(gè)臨床中心網(wǎng)被收集，在兩個(gè)huriet-law實(shí)驗(yàn)計(jì)劃的情況下。

為了獲得血清，血液樣品被采集到干燥的試管中。為了獲得血漿，血液樣品被采集到edta試管中。凝固后，試管于1000g離心10分鐘，血清被移除，分裝并貯存于–80℃。樣品被完成地記錄下患者的臨床史。

2.防衛(wèi)素原-a6腫瘤標(biāo)記物的血清測(cè)定

防衛(wèi)素原-a6前體蛋白使用實(shí)施例2中詳細(xì)描述的抗體和使用自動(dòng)系統(tǒng)(biomérieux)的elisa測(cè)定被檢驗(yàn)。要這樣做，elisa測(cè)定使用hbsagultra試劑盒(biomérieux，cat.no.30315)的試劑來(lái)構(gòu)建。試劑如在相應(yīng)的產(chǎn)品信息(ref.11728d–fr–2005/05)中描述的被使用，外加以下修飾：

1.錐體使用捕獲抗體12h4e1來(lái)敏化，濃度為5μg/ml。

2.hbsagultra柱的第二孔中的內(nèi)含物被300μl用于測(cè)試的偶聯(lián)于生物素，在hbsagultra試劑盒的第二孔的緩沖液中(無(wú)羊血清)稀釋到1μg/ml的揭示抗體1h8c9替換。

3.血清或血漿樣品(50μl)直接在hbsagultra柱的第二孔中被稀釋。

4.elisa反應(yīng)使用自動(dòng)系統(tǒng)和hbsagultra實(shí)驗(yàn)計(jì)劃完成，其孵育樣品和捕獲及揭示抗體采用100個(gè)循環(huán)。

5.結(jié)果以粗值的形式在扣除背景噪聲后(反應(yīng)前先讀底物)獲得。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)通過(guò)檢驗(yàn)一系列合成的防衛(wèi)素原-a6肽(seqidno.1)的濃度建立。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)通過(guò)沿x-軸報(bào)導(dǎo)腫瘤標(biāo)記物的濃度和沿y-軸通過(guò)(rfv或相對(duì)熒光值)讀信號(hào)來(lái)作圖。在被檢驗(yàn)的體液中(血液，血清，血漿)存在的腫瘤標(biāo)記物的濃度通過(guò)報(bào)導(dǎo)由讀值的對(duì)應(yīng)于rfv信號(hào)的濃度來(lái)計(jì)算。

患者中血清防衛(wèi)素原-a6測(cè)定的結(jié)果通過(guò)在vidas自動(dòng)系統(tǒng)中的elisa，在表4中給出。防衛(wèi)素原-a6的血清濃度在患有結(jié)腸直腸腺癌的患者(crc+)中，在0和10pg/ml之間，在正常個(gè)體(crc-)中，在0到2pg/ml之間，其要求極其敏感的elisa測(cè)定，以能把發(fā)明落實(shí)到生物液體或遠(yuǎn)程的樣品中。使其能可能如此低極限檢測(cè)的唯一防衛(wèi)素原-a6elisa測(cè)定基于識(shí)別表位1和4的抗體的組合。優(yōu)選通過(guò)表位1來(lái)捕獲防衛(wèi)素原-a6。給出最靈敏測(cè)定的組合在此被使用的是12h4e1抗體用來(lái)捕獲，1h8c9抗體用來(lái)檢測(cè)。

表4

^a：idd＝炎性腸疾病(克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎)

crc+＝患有結(jié)腸直腸癌的患者(腺癌)

crc-＝健康個(gè)體

^b：tnm：組織入侵時(shí)期(t)，淋巴結(jié)入侵(n)和遠(yuǎn)程入侵(轉(zhuǎn)移，m)

被分析的患者獲得的劑量在附圖6中被報(bào)導(dǎo)。可注意，在此附圖和表4中，2,2,10和2位分別患有i，ii，iii或iv期結(jié)腸直腸癌的患者，他們血清中防衛(wèi)素原-a6的量顯示清晰的增加，絕對(duì)高于健康個(gè)體組中觀察到的最高值(1.88pg/ml)。在腺瘤組中，沒(méi)有觀察到超過(guò)此值，而在idd組中有2例。

實(shí)施例4：合并使用腫瘤標(biāo)記物的血清測(cè)定

申請(qǐng)人在實(shí)施例3中指出，防衛(wèi)素原-a6前體蛋白的異常升高量可在某些患有結(jié)腸直腸癌的患者血流中觀察到。此外，申請(qǐng)人在專(zhuān)利申請(qǐng)wo2009/024691，wo2009019365，wo2009019368，wo2009019369，wo2009019366，wo2009019370和wo2009019367中指出其它腫瘤標(biāo)記物量的異常升高或減少，諸如lei，埃茲蛋白，氨基?；?1，l-fabp，apoa1，apoa2，i-絲束蛋白，β2-微球蛋白，cea，ca19-9，睪酮，半乳凝集素-3，ldh-b，蛋白酶體20s，上皮鈣黏著蛋白或再生性胰島衍生蛋白3α，或被稱(chēng)為胰腺炎相關(guān)蛋白(pap1)，也可在患有結(jié)腸直腸癌的患者血流中觀察到。檢驗(yàn)這些腫瘤標(biāo)記物的方法在上述提及的專(zhuān)利申請(qǐng)中被描述。檢測(cè)mif的方法使用來(lái)自r&dsystems的人mifquantikineelisa試劑盒(catno.dmf00)，依照生產(chǎn)商的使用說(shuō)明完成。

令人吃驚地，同一患者血液中兩個(gè)給定標(biāo)記物量的增加或減少未被系統(tǒng)地觀察到。因此，幾個(gè)腫瘤標(biāo)記物的組合使其可能增加被鑒定為患有結(jié)腸直腸癌患者的數(shù)量。因此，患者a可在一個(gè)或多個(gè)腫瘤標(biāo)記物(x組)展現(xiàn)出增加或減少，可能在患者b中，x組的所述標(biāo)記物是正常的；同樣在此患者b中，一個(gè)或多個(gè)其它腫瘤標(biāo)記物(y組)可能升高或降低，可能在患者a中y組的所述標(biāo)記物是正常的。

因此通過(guò)申請(qǐng)人檢驗(yàn)的不同的腫瘤標(biāo)記物可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的不同數(shù)學(xué)算法被組合。通過(guò)說(shuō)明的方式，此實(shí)施例不用在本質(zhì)上被詳盡說(shuō)明，以下方法被完成：

1.對(duì)每一個(gè)腫瘤標(biāo)記物設(shè)置閥值。

2.在結(jié)腸直腸癌情況下，當(dāng)血液中的腫瘤標(biāo)記物的量增加時(shí)，對(duì)一給定的患者獲得的血液中的量被除以其閥值。在結(jié)腸直腸癌情況下，當(dāng)血液中的腫瘤標(biāo)記物的量減少時(shí)，對(duì)一給定的患者獲得的血液中的量被倒置，隨后乘以其閥值。

3.當(dāng)“血液中的量除以閥值”的比值大于1時(shí)，比值被乘以系數(shù)，例如10。對(duì)于所研究的患者，對(duì)于被考慮的腫瘤標(biāo)記物，因此獲得的值被命名為“分?jǐn)?shù)”。

4.不同腫瘤標(biāo)記物獲得的分?jǐn)?shù)被相加，其被對(duì)每一個(gè)標(biāo)記物特定的因子加權(quán)。在以下實(shí)施例的情況下，所有的權(quán)重因子被設(shè)為1。

5.分?jǐn)?shù)的和除以相加的分?jǐn)?shù)的總數(shù)，因此獲得的值被命名為“總分?jǐn)?shù)”。

6.當(dāng)所述患者的總分?jǐn)?shù)相對(duì)于閥值的分?jǐn)?shù)增加時(shí)，患者被診斷為患有結(jié)腸直腸癌。

包含防衛(wèi)素原-a6的選擇的2,3,4,5,7和8個(gè)標(biāo)記物的總分?jǐn)?shù)在表5中給出。

因此防衛(wèi)素原-a6和cea腫瘤標(biāo)記物的組合因此使其可能獲得，對(duì)78位同一組的患者，41位患有結(jié)腸直腸腺癌的患者的增加的總分?jǐn)?shù)“2^a”，而單獨(dú)檢測(cè)防衛(wèi)素原-a6和cea僅分別在17和28位患者中顯示增加。

因此防衛(wèi)素原-a6和ca19-9腫瘤標(biāo)記物的組合因此使其可能獲得，對(duì)78位同一組的患者，28位患有結(jié)腸直腸腺癌的患者的增加的總分?jǐn)?shù)“2^b”，而單獨(dú)檢測(cè)防衛(wèi)素原-a6和ca19-9僅分別在17和15位患者中顯示增加。

因此防衛(wèi)素原-a6和β2-微球蛋白腫瘤標(biāo)記物的組合因此使其可能獲得，對(duì)78位同一組的患者，49位患有結(jié)腸直腸腺癌的患者的增加的總分?jǐn)?shù)“2^c”，而單獨(dú)檢測(cè)防衛(wèi)素原-a6和β2-微球蛋白僅分別在17和43位患者中顯示增加。

因此防衛(wèi)素原-a6和l-fabp腫瘤標(biāo)記物的組合因此使其可能獲得，對(duì)78位同一組的患者，41位患有結(jié)腸直腸腺癌的患者的增加的總分?jǐn)?shù)“2^d”，而單獨(dú)檢測(cè)防衛(wèi)素原-a6和l-fabp僅分別在17和35位患者中顯示增加。

因此防衛(wèi)素原-a6，ca19-9和cea腫瘤標(biāo)記物的組合因此使其可能獲得，對(duì)78位同一組的患者，46位患有結(jié)腸直腸腺癌的患者的增加的總分?jǐn)?shù)“3^e”，而單獨(dú)檢測(cè)防衛(wèi)素原-a6，ca19-9和cea僅分別在17,15和28位患者中顯示增加。

因此防衛(wèi)素原-a6，β2-微球蛋白和cea腫瘤標(biāo)記物的組合因此使其可能獲得，對(duì)78位同一組的患者，60位患有結(jié)腸直腸腺癌的患者的增加的總分?jǐn)?shù)“3^f”，而單獨(dú)檢測(cè)防衛(wèi)素原-a6，β2-微球蛋白和cea僅分別在17,43和28位患者中顯示增加。

因此防衛(wèi)素原-a6，β2-微球蛋白，ca19-9和cea腫瘤標(biāo)記物的組合因此使其可能獲得，對(duì)78位同一組的患者，63位患有結(jié)腸直腸腺癌的患者的增加的總分?jǐn)?shù)“4^g”，而單獨(dú)檢測(cè)防衛(wèi)素原-a6，β2-微球蛋白，ca19-9和cea僅分別在17，43，15和28位患者中顯示增加。

因此防衛(wèi)素原-a6，β2-微球蛋白，l-fabp和cea腫瘤標(biāo)記物的組合因此使其可能獲得，對(duì)78位同一組的患者，69位患有結(jié)腸直腸腺癌的患者的增加的總分?jǐn)?shù)“4^h”，而單獨(dú)檢測(cè)防衛(wèi)素原-a6，β2-微球蛋白，l-fabp和cea僅分別在17，43，35和28位患者中顯示增加。

因此防衛(wèi)素原-a6，ca19-9，l-fabp和cea腫瘤標(biāo)記物的組合因此使其可能獲得，對(duì)78位同一組的患者，59位患有結(jié)腸直腸腺癌的患者的增加的總分?jǐn)?shù)“4ⁱ”，而單獨(dú)檢測(cè)防衛(wèi)素原-a6，ca19-9，l-fabp和cea僅分別在17，15，35和28位患者中顯示增加。

因此防衛(wèi)素原-a6，β2-微球蛋白，ca19-9，l-fabp和cea腫瘤標(biāo)記物的組合因此使其可能獲得，對(duì)78位同一組的患者，71位患有結(jié)腸直腸腺癌的患者的增加的總分?jǐn)?shù)“5^j”，而單獨(dú)檢測(cè)防衛(wèi)素原-a6，β2-微球蛋白，ca19-9，l-fabp和cea僅分別在17，43，15，35和28位患者中顯示增加。

因此防衛(wèi)素原-a6，β2-微球蛋白，ca19-9，半乳凝集素-3，l-fabp，mif和cea腫瘤標(biāo)記物的組合因此使其可能獲得，對(duì)78位同一組的患者，74位患有結(jié)腸直腸腺癌的患者的增加的總分?jǐn)?shù)“7^k”，而單獨(dú)檢測(cè)防衛(wèi)素原-a6，β2-微球蛋白，ca19-9，半乳凝集素-3，l-fabp，mif和cea僅分別在17，43，15，13，35，23和28位患者中顯示增加。

因此防衛(wèi)素原-a6，β2-微球蛋白，ca19-9，半乳凝集素-3，l-fabp，mif，i-絲束蛋白和cea腫瘤標(biāo)記物的組合因此使其可能獲得，對(duì)78位同一組的患者，75位患有結(jié)腸直腸腺癌的患者的增加的總分?jǐn)?shù)“8^l”，而單獨(dú)檢測(cè)防衛(wèi)素原-a6，β2-微球蛋白，ca19-9，半乳凝集素-3，l-fabp，mif，i-絲束蛋白和cea僅分別在17，43，15，13，35，23，3和28位患者中顯示增加。

表5

分?jǐn)?shù)2^a：cea和防衛(wèi)素原-a6的組合

分?jǐn)?shù)2^b：ca19-9和防衛(wèi)素原-a6的組合

分?jǐn)?shù)2^c：β2-微球蛋白和防衛(wèi)素原-a6的組合

分?jǐn)?shù)2^d：l-fabp和防衛(wèi)素原-a6的組合

分?jǐn)?shù)3^e：cea，ca19-9和防衛(wèi)素原-a6的組合

分?jǐn)?shù)3^f：cea，β2-微球蛋白和防衛(wèi)素原-a6的組合

分?jǐn)?shù)4^g：cea，β2-微球蛋白，ca19-9和防衛(wèi)素原-a6的組合

分?jǐn)?shù)4^h：cea，β2-微球蛋白，l-fabp和防衛(wèi)素原-a6的組合

分?jǐn)?shù)4ⁱ：cea，ca19-9，l-fabp和防衛(wèi)素原-a6的組合

分?jǐn)?shù)5^j：cea，β2-微球蛋白，ca19-9，l-fabp和防衛(wèi)素原-a6的組合

分?jǐn)?shù)7^k：cea，β2-微球蛋白，ca19-9，半乳凝集素-3，防衛(wèi)素原-a6，l-fabp和mif的組合

分?jǐn)?shù)8^l：cea，β2-微球蛋白，ca19-9，防衛(wèi)素原-a6，半乳凝集素-3，l-fabp，mif和i-絲束蛋白的組合

crc+＝患有結(jié)腸直腸癌(腺癌)的患者，crc-＝健康個(gè)體

實(shí)施例5：通過(guò)lc-mrm-ms技術(shù)檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物

1.方法學(xué)

為能把檢測(cè)極限降低到幾ng/ml，改進(jìn)的mrm-ms方法被使用。此方法的相繼步驟是：1)大量蛋白的免疫耗竭，2)胰酶消化，3)肽的spe(固相萃取)分離，4)偶聯(lián)于mrm-ms的液相層析(lc)。

設(shè)置通過(guò)加入防衛(wèi)素原-a6合成肽(seqidno.1)穿透樣品完成。

免疫耗竭.血清中大量蛋白的耗竭使用vivascience的商業(yè)vivapureanti-has試劑盒完成?？蛇x擇地，calbiochem的proteoextractalbumin/igg試劑盒和bio-rad的aurum^tmserumproteinminikit被使用。也可能在實(shí)驗(yàn)室中生產(chǎn)特殊的樹(shù)脂，通過(guò)依照生產(chǎn)商的使用說(shuō)明，偶聯(lián)直接抗被耗竭蛋白的單克隆抗體到cnbr-活化的瓊脂糖4b樹(shù)脂(amershambioscience)上。

酶消化.被耗竭的血清樣品在含有30mm二硫蘇糖醇，用10mmtris，ph8緩沖的6m尿素溶液中40℃變性40分鐘，隨后室溫，避光，用50mm的碘乙酰胺烷基化40分鐘。它們?cè)谒斜幌♂?倍，隨后使用1/30的酶/底物比率(promega)37℃過(guò)夜完成胰酶消化。消化通過(guò)加入終濃度0.5％的甲酸終止。被消化的樣品使用oasishlb3cc反相柱(60mg)(waters)通過(guò)固相萃取(spe)去鹽。柱用1ml0.1％的甲酸清洗，隨后的洗脫用含0.1％甲酸的甲醇/水混合物(80/20v/v)完成。洗脫物在真空中被干燥。

spe分離.干燥的樣品在1ml醋酸緩沖液中，被上到醋酸緩沖液和甲醇預(yù)平衡的oasismcx(混合陽(yáng)離子交換)60mg混合柱(疏水和陽(yáng)離子交換)(waters)上。柱使用1ml醋酸緩沖液和1ml甲醇清洗。感興趣的肽(表6)用甲醇/醋酸緩沖液混合物(50/50v/v)洗脫。醋酸緩沖液的ph依照感興趣的肽的等電點(diǎn)被選擇。洗脫物在真空中被干燥，溶解于200μl含有0.1％甲酸的乙腈/水(3/97v/v)溶液中。50μl的液體被注射入偶聯(lián)于ms-ms系統(tǒng)的lc。

液相層析和質(zhì)譜.lc-ms分析在有雙泵和進(jìn)樣器的hp1100系列高壓層析系統(tǒng)(hplc)上完成，其偶聯(lián)與質(zhì)譜儀，sciexapi2000三重四極或?yàn)楦玫仂`敏度，sciexapi4000qtrap(雜交三重四極離子阱式質(zhì)譜)(mdssciex)。lc分離在c18symmetry柱上(waters)完成，洗脫流速為300μl/分鐘(洗脫液a＝含0.1％甲酸的水，洗脫液b＝含0.1％甲酸的乙腈，線(xiàn)性梯度在25分鐘內(nèi)從5％的b到50％的b，隨后3分鐘內(nèi)從50％的b到100％的b)。ms分析在應(yīng)用針電壓，5500v電壓的正向離子化模式下完成，使能在源處離子化。儀器檢定和數(shù)據(jù)采集使用analyst1.4.1軟件完成。霧化氣體(空氣)和簾氣(氮?dú)?流分別為30和20psi。turbov^tm離子源被調(diào)整到400℃，輔助氮?dú)饬鳛?0psi。每一個(gè)肽的mrm躍遷記錄在表6中再現(xiàn)。解離電壓(ce)，去簇電壓(dp)和碰撞池出口電壓(cxp)對(duì)每一個(gè)選擇的mrm躍遷被優(yōu)化。

2.結(jié)果

序列seqidno.1的理論mrm躍遷表使用midas(mrm-發(fā)起的探測(cè)和測(cè)序)軟件生成。此表包含所有的在800到3000da質(zhì)量范圍內(nèi)，理論胰蛋白酶肽段的二重帶電或三重帶電母離子，和所有y或b型的可能離子片段。對(duì)每一個(gè)蛋白，每一個(gè)可能的躍遷被測(cè)試以確定最靈敏和最特異的躍遷。此選擇的結(jié)果在表6中再現(xiàn)。肽eplqaeddplqak(seqidno.30)727/556躍遷的spe步驟的優(yōu)化例子在附圖7中給出。mcx層析分離在不同的ph完成，對(duì)剩余試驗(yàn)的ph選擇是使其能獲得最高峰面積的ph。

此外，使用aqua型的重肽(sigma)或者重重組蛋白可用作測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，使能以絕對(duì)方式定量在復(fù)合生物培養(yǎng)基中感興趣的腫瘤標(biāo)記物。

表6

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序列表

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