本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及一種豬病毒性傳染病血清igg抗體多重elisa檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：病毒性傳染病已成為威脅我國(guó)生豬養(yǎng)殖健康發(fā)展的嚴(yán)重障礙，其爆發(fā)和流行給養(yǎng)豬業(yè)者造成了極大經(jīng)濟(jì)損失。目前，包括豬瘟病毒(csfv)、豬圓環(huán)病毒2型(pcv2)和豬偽狂犬病毒(prv)是養(yǎng)豬業(yè)重點(diǎn)防控的病毒性疫病。在生豬疾病的預(yù)防工作中，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)和評(píng)價(jià)疫苗免疫后血清中抗體水平和區(qū)分抗體來(lái)源是評(píng)價(jià)疫苗接種效果、保護(hù)豬群健康的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。豬病毒性傳染性疾病的血清抗體檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)、乳膠凝集試驗(yàn)、血凝試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)、單層酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)等。由于elisa方法操作簡(jiǎn)單、成本低廉、對(duì)試驗(yàn)條件要求低、敏感性和穩(wěn)定性好、可以評(píng)價(jià)抗體水平和種類、適合規(guī)?；瘷z測(cè)血清樣本且結(jié)果判定可標(biāo)準(zhǔn)化，因此，是目前應(yīng)用動(dòng)物疫病血清抗體水平監(jiān)控和評(píng)價(jià)體系中應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)手段。常用血清抗體檢測(cè)elisa方法基本原理是，利用預(yù)先包被在微孔板中來(lái)自待檢測(cè)疫病的抗原(重組抗原或滅活完整病原顆粒)結(jié)合血清樣本中的特異性igg抗體，加入抗igg的酶(化學(xué)發(fā)光物、熒光材料等)標(biāo)記的第二抗體同與抗原結(jié)合的igg抗體反應(yīng)，來(lái)檢測(cè)待檢測(cè)樣本中的抗體含量或者種類。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)模式和操作程序的差異，elisa方法可分為包括間接elisa、阻斷elisa和競(jìng)爭(zhēng)elisa。動(dòng)物疫病檢測(cè)領(lǐng)域常用的血清抗體elisa試劑盒是只適合單一病原產(chǎn)生的抗體檢測(cè)，尚未見到一種試劑盒可以同時(shí)檢測(cè)多種病原產(chǎn)生的血清抗體的產(chǎn)品。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種豬病毒性傳染病血清igg抗體多重elisa檢測(cè)試劑盒，以解決現(xiàn)有血清抗體elisa試劑盒是只適合單一病原產(chǎn)生的抗體檢測(cè)，無(wú)法同時(shí)檢測(cè)多種病原產(chǎn)生的血清抗體的問(wèn)題。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用豬病毒性傳染病血清igg抗體多重elisa檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法。本發(fā)明技術(shù)方案如下：一種豬病毒性傳染病血清igg抗體多重elisa檢測(cè)試劑盒，包括預(yù)包被spa蛋白的檢測(cè)板、血清樣品稀釋液、洗滌液、顯色液、終止液、四種病原的陰陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照血清、以及hrp分別標(biāo)記的csfv的e2抗原、pcv2的cap抗原、prv的gb和ge抗原。優(yōu)選地，所述預(yù)包被spa蛋白的檢測(cè)板所包被spa蛋白的包被量為2ng～28ng/孔，包被稀釋液為50mmol/l的ph值為9.6的碳酸鹽緩沖液。制備抗原包被板的目的是捕獲血清樣本中所有類型的igg抗體。不同的濃度直接影響到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。優(yōu)選地，所述預(yù)包被spa蛋白的檢測(cè)板中包被用碳酸鹽緩沖液每毫升的組成為1.59mgna2co3和2.93mgnahco3，去離子水充分溶解后保存于4℃溫度下。碳酸鹽緩沖液條件下，spa抗原可以穩(wěn)定吸附在酶標(biāo)板上。優(yōu)選地，所述預(yù)包被spa蛋白的檢測(cè)板中采用的封閉液組分為質(zhì)量濃度為1-5％海藻糖、質(zhì)量濃度0.5-2.0％明膠、體積濃度1-8％馬血清，1×pbst，ph7.3，200μl/孔。封閉液中的明膠、馬血清和海藻糖可以結(jié)合酶標(biāo)板中spa抗原未能吸附的剩余位置，使整個(gè)孔底部都被蛋白覆蓋。一是可以保持spa抗原的活性，二是阻斷待檢測(cè)樣品中存在的蛋白或者抗體與酶標(biāo)板中剩余位置發(fā)生結(jié)合，導(dǎo)致非特異性反應(yīng)的發(fā)生，并且添加的海藻糖具有耐熱的特征，可以大幅度延長(zhǎng)抗原包被板的保存期限。優(yōu)選地，所述洗滌液為體積濃度為0.5％的吐溫-20的0.1mol/l的ph值為7.2的磷酸鹽緩沖液，洗滌液的功能是洗去未結(jié)合的和非特異性結(jié)合的封閉液中的成份。去污洗滌液為質(zhì)量濃度1％edta加50mmol/l的ph值為7.2的磷酸鹽緩沖液，100μl/孔室溫作用1-15min。去污洗滌液目的是除去血清樣本中非特異性吸附的igm，避免產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。優(yōu)選地，所述預(yù)包被spa蛋白的檢測(cè)板中，標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清和待檢測(cè)血清樣本均以原倍濃度100μl/孔加入到對(duì)應(yīng)的孔中，室溫作用60min。優(yōu)選地，所述hrp標(biāo)記的csfv的e2抗原、pcv2的cap抗原、prv的gb和prv的ge抗原使用濃度分別為1∶4000、1∶4000，1∶4000、1∶2000，其對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為0.1μg/ml-15μg/ml，37℃孵育60min。hrp-標(biāo)記的檢測(cè)抗原可以與對(duì)應(yīng)的特異性igg抗體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目標(biāo)抗體的目的。優(yōu)選地，所述預(yù)包被spa蛋白的檢測(cè)板制備中，所用的tmb底物緩沖液組成為，底物溶液a：tmbdmso溶液，濃度為2-6mg/ml；底物溶液b：15-30g/l醋酸鈉，檸檬酸1-9g/l，30％雙氧水0.1-1ml，蒸餾水溶解至1l。tmb與hrp發(fā)生反應(yīng)，根據(jù)血清樣本中待檢測(cè)igg抗體含量的不同，呈現(xiàn)深淺不一藍(lán)色，可以利用450nm激發(fā)波長(zhǎng)，讀取反應(yīng)結(jié)果。優(yōu)選地，所述終止液為1.5mol/lh2so4。h2so4終止反應(yīng)，以便讀取吸光度值。一種用豬病毒性傳染病血清igg抗體多重elisa檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法，包括以下步驟：(1)加入血清樣本：將待檢測(cè)血清樣本、陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清均以原倍濃度100μl/孔加入對(duì)應(yīng)孔中，陰、陽(yáng)性對(duì)照血清做復(fù)孔；密封,室溫作用60min；(2)去除非特異性反應(yīng)：用質(zhì)量濃度為1％edta的去污洗滌液和50mmol/l的磷酸鹽緩沖液，以100μl/孔室溫作用5min，棄去孔內(nèi)液體，磷酸鹽緩沖液的ph值為7.2；(3)洗板：棄凈孔內(nèi)殘余epbs液體，用200-300μl/孔1×pbst洗滌液連續(xù)洗滌4次，最后一次棄凈孔內(nèi)液體，拍干；(4)加入hrp-標(biāo)記抗原：根據(jù)需要檢測(cè)病原的抗體，加入已滴定好hrp標(biāo)記抗原，100μl/孔，37℃作用1h，洗滌；(5)加入底物顯色：以100μl/孔的用量加入tmb底物緩沖液，室溫避光顯色15min，以100μl/孔的用量加入終止液；(6)結(jié)果判定：試驗(yàn)成立條件：計(jì)算陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照血清各孔的平均吸光度值(od450nm)，當(dāng)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清平均od450≥1.0，陰性標(biāo)準(zhǔn)血清od450≤0.20，判定為試驗(yàn)結(jié)果成立；判定：當(dāng)待測(cè)樣品od450/陰性標(biāo)準(zhǔn)血清od450≥2.10，判定該血清樣品為檢測(cè)病原的抗體陽(yáng)性；當(dāng)待測(cè)樣品od450/陰性標(biāo)準(zhǔn)血清od450＜2.10，判定該血清樣品為檢測(cè)的病原抗體陰性。金黃色葡萄球菌蛋白a(staphylococcalproteina,spa)是細(xì)胞壁抗原的主要成分，從n端到c依次有s、e、d、a、b、c、x五個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，分子量與42kd左右，氨基酸組成中無(wú)半胱氨酸，所以沒有二硫鍵結(jié)構(gòu)，等電點(diǎn)5.1，屬于一種酸性蛋白質(zhì)，天然結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，加熱、福爾馬林處理、4mol/l尿素、6mol/l鹽酸胍、鹽酸(ph2.5)和硫氰鹽酸等極端條件均不影響其活性。spa與不同種類igg結(jié)合的親和性存在差異，結(jié)合能力由強(qiáng)到弱依次是豬、狗、兔、人、猴、小鼠、大鼠、綿羊，結(jié)合的igg亞型是igg1、igg2和igg4(吸附率90％～98％)，不與igg3結(jié)合，可以同血清中少量的igm(吸附率2％～30％)、iga(吸附率1.5％～20％)、igge及b細(xì)胞抗原受體結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)是fabric段的vh功能區(qū)。每個(gè)spa分子具有雙價(jià)的結(jié)合能力，可以同時(shí)結(jié)合2個(gè)igg分子。spa具有與人和多種哺乳動(dòng)物血清igg分子fc段非特異性結(jié)合的特性，并且不會(huì)影響到igg分子fab片段與抗原的特異性結(jié)合能力，這種特殊的免疫學(xué)性質(zhì)，使其成為免疫學(xué)研究方面獨(dú)一無(wú)二的有用工具，在病原學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明采用的是雙抗原夾心的反應(yīng)模式，利用金黃色葡萄球菌蛋白a(staphylococcalproteina，spa)結(jié)合待檢測(cè)豬血清樣品中所有igg分子，用辣根過(guò)氧化物酶(hrp)標(biāo)記的重組抗原與spa結(jié)合的igg分子反應(yīng)，建立了可同時(shí)檢測(cè)待測(cè)樣品中的抗csfv的e2蛋白抗體、抗pcv2的cap蛋白抗體和抗prv的gb和ge蛋白抗體的多重elisa方法，制備的hrp-e2酶標(biāo)記抗原屬于具有復(fù)合功能的e2抗原，既能與豬瘟病毒抗血清結(jié)合，同時(shí)還可以與tmb底物發(fā)生反應(yīng)，直接指示檢測(cè)的結(jié)果。實(shí)現(xiàn)了一次elisa反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)四種疫病抗體(檢測(cè)豬瘟病毒(csfv)、豬圓環(huán)病毒2型(pcv2)和豬偽狂犬病毒感染(prv)或免疫豬的血清igg抗體)的目的，其敏感性和特異性與現(xiàn)有單一病原抗體檢測(cè)試劑盒相當(dāng)，但顯著提升了檢測(cè)效率，為上述四種疾病疫苗免疫及臨床感染豬的血清抗體檢測(cè)提供了一種有效、快捷的檢測(cè)試劑。本發(fā)明將多種檢測(cè)抗體集中在一個(gè)elisa反應(yīng)中進(jìn)行，可以顯著提高檢測(cè)效率、節(jié)約檢測(cè)時(shí)間和降低檢測(cè)成本。本發(fā)明提供的多重elisa檢測(cè)方法是一種具有良好的敏感性、特異性、準(zhǔn)確性、時(shí)效性、穩(wěn)定性，可通過(guò)一次實(shí)驗(yàn)同時(shí)完成三種豬病的四種血清igg抗體檢測(cè)的簡(jiǎn)易、快速方法，適用于規(guī)?；R床血清樣品的檢測(cè)工作。附圖說(shuō)明圖1是一種豬病毒性傳染病血清igg抗體多重elisa檢測(cè)試劑盒的實(shí)驗(yàn)流程圖；圖2是一種豬病毒性傳染病血清igg抗體多重elisa檢測(cè)方法的原理圖。具體實(shí)施方式下面對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。說(shuō)明：1×濃度的緩沖溶液是指在配制溶液的時(shí)候，為了方便儲(chǔ)存及減少工作量，一般會(huì)配制10倍(10x)至1000倍(1000x)工作濃度的濃溶液作為貯存。在使用的時(shí)候取少量?jī)?chǔ)存液再稀釋至工作濃度(就是所謂的1x)?！恫牧虾头椒ā?.1抗原、標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)性血清、試劑和spa已知csfv、pcv2、和prv(ge基因缺失疫苗株)陽(yáng)性血清和陰性血清，e.coli表達(dá)的重組抗原包括，csfve2抗原(gst標(biāo)簽)、pcv2cap抗原(his標(biāo)簽)、prvge和gb抗原(his標(biāo)簽)，均為現(xiàn)有產(chǎn)品。辣根過(guò)氧化酶(hrp)、spa購(gòu)自sigma公司；瓊脂糖4b、鎳柱為gehealthcare產(chǎn)品；超濾層析柱(10kd)購(gòu)自millipore；其它相關(guān)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2抗原制備和純化1.2.1csfve2重組抗原制備依據(jù)現(xiàn)有方法進(jìn)行可溶性重組csfve2抗原制備和純化。1.2.2pcv2cap重組抗原制備依據(jù)現(xiàn)有方法進(jìn)行可溶性重組pcv2cap抗原制備和純化。1.2.3prvge和gb重組抗原制備1.2.3.1prvge基因的克隆、表達(dá)和純化。(1)ge基因克隆和重組表達(dá)載體的構(gòu)建：參考現(xiàn)有g(shù)enbank：af207700毒株基因序列合成一對(duì)擴(kuò)增ge基因表達(dá)引物，用于表達(dá)ge蛋白。引物序列，ge109：actggatccatggaggtcccgagtc；ge858：tcactcgaggtggtagatgcaggg，限制性酶切位點(diǎn)分別為bamhi和xhol，擴(kuò)增片段大小為780bp。pcr擴(kuò)增、酶切回收后的目的片段亞克隆到pgex-6p-1原核表達(dá)上，轉(zhuǎn)化dh5a感受態(tài)細(xì)胞，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為6p-e，轉(zhuǎn)化bl-21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行重組蛋白表達(dá)。(2)ge的表達(dá)、純化和蛋白功能鑒定：挑取5個(gè)單克隆菌落分別于5mllb液體培養(yǎng)基試管中，220r/min，37℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng)；分別從5個(gè)管中吸取50μl菌液于新的lb液體培養(yǎng)基試管中，220r/min2～3h至od600≈0.5～0.6，在其中的4個(gè)管中加入iptg的終濃度1.0mol/l,剩余1管作為陰性對(duì)照，37℃200r/min振蕩培養(yǎng)4～6h。sds-page鑒定重組e2蛋白：取1ml重組菌到ep管中，10000r/min離心1min，棄掉上清，加入100μltrisph6.8，100℃煮5min，10000r/min離心15min。配制15％的sds-page蛋白質(zhì)電泳凝膠，每個(gè)樣品加10μl上清，加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker5μl，80v濃縮膠，120v分離膠，膠塊考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后觀察到了ge蛋白成功表達(dá)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)(westernblotting，wb)結(jié)果表明，重組e2蛋白可以被豬偽狂犬ge陽(yáng)性血清識(shí)別，具有良好的反應(yīng)原性。然后利用瓊脂糖4b樹脂純化ge蛋白作為elisa抗體檢測(cè)的包被抗原。1.2.3.2prvgb基因的克隆、表達(dá)、純化和反應(yīng)原性的鑒定：參考現(xiàn)有pcv2基因組序列(genbank：kj526439)合成一對(duì)擴(kuò)增gb基因表達(dá)引物，用于表達(dá)gb蛋白。引物序列，gb1627：actggatccatggcgcacgtgaacgacat；gb2214：gtcaagcttcgagcgcgtgcagctggtt，分別引入限制性酶切位點(diǎn)bamhi和hindiii，擴(kuò)增580bp大小的gb基因。pcr擴(kuò)增、酶切回收后的目的片段亞克隆到pet-28a原核表達(dá)上，轉(zhuǎn)化dh5a感受態(tài)細(xì)胞，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為28a-b，轉(zhuǎn)化bl-21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行重組蛋白表達(dá)。gb重組蛋白的表達(dá)過(guò)程參考“”1.2.3.1”部分，獲得的重組蛋白用鎳親和層析填料進(jìn)行純化，通過(guò)4b樹脂純化ge蛋白，wb實(shí)驗(yàn)表明重組gb蛋白能夠被豬過(guò)b抗體陽(yáng)性血清識(shí)別，可以作為elisa抗體檢測(cè)的包被抗原。1.3spa包被的酶標(biāo)板制備包被用碳酸鹽緩沖液每毫升的組成為1.59mgna2co3和2.93mgnahco3，去離子水充分溶解后保存于4℃溫度下。用50mmol/l碳酸鹽緩沖液(ph9.6)稀釋spa蛋白，100μl/孔包被96孔酶標(biāo)板，spa包被量為4ng/孔，密封，置于室溫作用16～20小時(shí)過(guò)夜。棄凈孔內(nèi)液體，用洗滌液1×pbst(洗滌液為體積濃度為0.5％的吐溫-20的0.1mol/l的ph值為7.2的磷酸鹽緩沖液)200-300μl/孔連續(xù)洗滌4次，最后一次棄凈孔內(nèi)液體。加入200μl/孔的封閉液(質(zhì)量濃度5％海藻糖、質(zhì)量濃度2％的明膠、體積濃度2.5％的馬血清、1×pbst，ph7.3)室溫作用30min；使用洗滌液1×pbst(洗滌液為體積濃度為0.5％的吐溫-20的0.1mol/l的ph值為7.2的磷酸鹽緩沖液)洗滌。將四種疫病的標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性和待檢測(cè)血清樣品100μl/孔加入到檢測(cè)孔中，室溫孵育60min。用去污洗滌液epbs(質(zhì)量濃度1％edta,，50mmol/l的磷酸鹽緩沖液，ph7.2)100μl/孔室溫作用5min，移除非特異性結(jié)合的igm抗體，棄去孔內(nèi)液體，用1×pbst(0.05％tween-20,50mmol/l的磷酸鹽緩沖液，ph7.2)200-300μl/孔連續(xù)洗滌4次，最后一次棄凈孔內(nèi)液體。根據(jù)需要檢測(cè)抗體的種類，相應(yīng)孔中加入對(duì)應(yīng)的hrp-抗原，100μl/孔，37℃孵育60min，洗滌同上。加入tmb底物緩沖液(底物溶液a：tmbdmso溶液，濃度為2mg/ml；底物溶液b：27.2g/l醋酸鈉，檸檬酸3.2g/l，30％雙氧水0.6ml，蒸餾水溶解至1l，底物溶液a和b均避光保存，使用時(shí)等量混勻即可。)，100μl/孔，室溫孵育30min，加入100μl/孔1.5mol的h2so4終止液，od450nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值，計(jì)算結(jié)果。1.4辣根過(guò)氧化物酶(hrp)標(biāo)記重組抗原：采用現(xiàn)有改良過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行hrp-抗原標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，利用瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)鑒定hrp標(biāo)記抗原的活性鑒定。酶標(biāo)記率＝od403/od280，酶中正鐵血紅素輔基的吸光度(od403)與抗原蛋白中的色氨酸、酪氨酸的吸光度(od280)之比表示hrp在抗原-酶中所占的比例，其中結(jié)合率(％)﹥30為最好，﹥9～10為好，﹥7一般。標(biāo)記的hrp-抗原分成200μl/管，加入終濃度33％的無(wú)菌甘油保存于-20℃，直到滴定工作濃度實(shí)驗(yàn)。1.5滴定hrp標(biāo)記抗原的工作濃度1.5.1滴定hrp標(biāo)記的csfve2抗原(hrp-e2)的最佳工作濃度分別將3份已知csfv血清抗體陰性和3份已知csf抗體v血清陽(yáng)性以原倍濃度100μl/孔加入到“1.3”制備的已經(jīng)封閉的spa抗原包被板的孔中中，每份血清做雙孔檢測(cè)，37℃孵育45min，棄凈孔內(nèi)液體，用200-300μl/孔1×pbst連續(xù)洗滌4次，最后一次棄凈孔內(nèi)液體，拍干。將酶標(biāo)記的hrp-e2抗原以1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶8000，1∶16000稀釋，100μl/孔加入相應(yīng)孔中，每個(gè)稀釋度重復(fù)一次，37℃作用60min，洗滌，加入tmb底物緩沖液100μl/孔，室溫避光顯色15min，加入100μl/孔終止液(2mh2so4)。在波長(zhǎng)od450nm處檢測(cè)吸光度值，計(jì)算陽(yáng)性血清與陰性血清的吸光度比值，選擇陽(yáng)性血清od值(pos)1.0～1.6，陰性血清od值(neg)＜0.2的hrp-e2的稀釋濃度為最佳稀釋度。1.5.2滴定hrp標(biāo)記的pcv2-cap(hrp-cap)ppv-vp2(hrp-vp2)、prv-ge(hrp-ge)和gb(hrp-gb)的工作濃度具體實(shí)驗(yàn)操作步驟和結(jié)果判定方法均同“1.5.1”所述。1.6hrp-e2，hrp-cap，hrp-gb和hrp-ge最佳工作濃度的確定根據(jù)酶標(biāo)記抗原滴定實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，hrp-e2，hrp-cap，hrp-gb和hrp-ge在豬血清igg抗體多重elisa檢測(cè)試劑盒中的工作濃度如表1所示：表1酶標(biāo)記抗原滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果抗原h(huán)rp-e2hrp-caphrp-gbhrp-ge*pos/od4501.351.431.261.39*neg/od4500.150.120.150.18pos/neg911.928.47.72最佳工作濃度1∶40001∶40001∶40001∶2000備注：*pos/od450與*neg/od450份別是3份csfv陽(yáng)性血清和3份陰性血清od450在各自對(duì)應(yīng)酶標(biāo)記抗原濃度下的平均od450值。1.7豬病毒性傳染病血清igg抗體多重elisa檢測(cè)方法的建立1.7.1spa抗原包被：用50mmol/l碳酸鹽緩沖液(ph9.6)稀釋spa蛋白至被量為4ng/孔，100μl/孔包被96孔酶標(biāo)板，置于4℃過(guò)夜，棄去液體，洗滌，拍干，封閉，洗滌，拍干。1.7.2檢測(cè)血清樣本：用血清稀釋液對(duì)陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清以原倍濃度100μl/孔，陰、陽(yáng)性對(duì)照血清做復(fù)孔；將待檢血清樣品以原倍濃度100μl/孔加入對(duì)應(yīng)孔中，密封,室溫作用60min。1.7.3用去污洗滌液epbs(質(zhì)量濃度1％edta，50mmol/l的磷酸鹽緩沖液(ph7.2)100μl/孔室溫作用5min，移除非特異性結(jié)合的igm抗體，棄去孔內(nèi)液體，1.7.4洗板。棄凈孔內(nèi)殘余epbs液體，用200-300μl/孔1×pbst洗滌液連續(xù)洗滌4次，最后一次棄凈孔內(nèi)液體，拍干。1.7.5加入hrp-標(biāo)記抗原根據(jù)需要檢測(cè)病原的抗體，加入已滴定好hrp標(biāo)記抗原，100μl/孔，37℃作用60min，洗滌。(例如：檢測(cè)csfv抗體，對(duì)應(yīng)孔中加入hrp-e2抗原即可。若要同時(shí)檢測(cè)4種蛋白的抗體，對(duì)應(yīng)的孔中加入hrp標(biāo)記的對(duì)應(yīng)抗原即可實(shí)現(xiàn)。)1.7.6加入底物顯色100μl/孔加入tmb底物緩沖液，室溫避光顯色15min，100μl/孔加入終止液。1.7.7結(jié)果判定(1)試驗(yàn)成立條件：計(jì)算陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照血清各孔的平均吸光度值(od450nm)，當(dāng)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清平均od450≥1.0，陰性標(biāo)準(zhǔn)血清od450≤0.20，判定為試驗(yàn)結(jié)果成立。(2)結(jié)果判定當(dāng)待測(cè)樣品od450/陰性標(biāo)準(zhǔn)血清od450≥2.10，判定該血清樣品為檢測(cè)病原的抗體陽(yáng)性；當(dāng)待測(cè)樣品od450/陰性標(biāo)準(zhǔn)血清od450＜2.10，判定該血清樣品為檢測(cè)的病原抗體陰性。1.8特異性檢測(cè)用豬病毒性傳染病血清igg抗體多重elisa檢測(cè)方法豬臨床常見的病毒性傳染病陽(yáng)性血清進(jìn)行交叉檢測(cè)，研究該檢測(cè)方法的特異性。本elisa中包被的是spa抗原，其可以與豬血清樣品中的igg抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。因此，特異性檢測(cè)的目的是鑒別hrp標(biāo)記的對(duì)應(yīng)抗原是否能會(huì)與其它常見豬感染的病毒產(chǎn)生的igg抗體發(fā)生非特異性結(jié)合(即交叉反應(yīng))，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所以，在進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)時(shí)，選擇的血清樣品應(yīng)不含有進(jìn)行特異性研究的、hrp標(biāo)記抗原的抗體即可。檢測(cè)方法，按照“1.7”中所描述的操作程序進(jìn)行，特異性研究結(jié)果如表2所示。表2多重血清抗體elisa檢測(cè)試劑盒的特異性實(shí)驗(yàn)negb表示檢測(cè)結(jié)果陰性，posa表示檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性1.9多重elisa抗體檢測(cè)方法的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)制備3批spa抗原包被酶標(biāo)板，每種病毒抗原選擇5份抗體陽(yáng)性豬血清樣品和5份陰性豬血清樣品進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，計(jì)算變異系數(shù)，驗(yàn)證elisa檢測(cè)方法的可重復(fù)性。結(jié)果表明，3個(gè)不同批次spa抗原包被酶標(biāo)板檢測(cè)5份陰陽(yáng)性血清，批內(nèi)變異系數(shù)<3.1％，批間變異系數(shù)<2.5％，證明本方法具有良好的重復(fù)性。1.10臨床樣品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)對(duì)50份采集自甘肅某豬場(chǎng)的豬血清樣品用于本發(fā)明所涉及方法的比對(duì)實(shí)驗(yàn)。采集外周血時(shí)，已經(jīng)接種豬瘟兔化弱毒疫苗(細(xì)胞源)后的21天，但從未接種pcv2疫苗、prv疫苗和ppv疫苗。按照以“1.7”所述的操作方法和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。通過(guò)與市售的商品化試劑盒進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，比較本發(fā)明所涉及試劑盒與商品化試劑盒的陽(yáng)性檢出率。1.10.1豬病毒性傳染病血清igg抗體多重elisa檢測(cè)方法-豬瘟病毒血清抗體檢測(cè)選擇在我國(guó)使用較為普遍的idexx生產(chǎn)的csfv血清抗體阻斷elisa試劑盒(idexxcsfvabkit)作為參考方法。csfv血清抗體檢測(cè)商品化試劑盒與本發(fā)明中所涉及的igg血清抗體多重elisa檢測(cè)方法比較結(jié)果見表3。從比較結(jié)果可以看出，hrp-e2豬瘟抗體檢測(cè)方法陽(yáng)性檢出率為82％(41/50),陰性檢測(cè)率為18％(9/50)；進(jìn)口idexxcsfvabkit檢測(cè)試劑盒陽(yáng)性檢測(cè)率為68％(34/50),陰性檢測(cè)率為32％(16/50)。二種方法的陽(yáng)性符合率為68.29％，陰性符合率為33.33％，總體符合率達(dá)到62％。由于本發(fā)明所使用的檢測(cè)豬瘟病毒抗體的e2抗原來(lái)自csfv弱毒疫苗，與田間使用弱毒疫苗后的血清樣本的反應(yīng)性要好于進(jìn)口的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明研發(fā)的多重elisa中，hrp-e2csfv抗體檢測(cè)試劑盒陽(yáng)性檢出率比進(jìn)口的高出14％，這個(gè)結(jié)果符合我國(guó)豬瘟抗體的臨床規(guī)律。近些年，我國(guó)始終采取豬瘟疫苗強(qiáng)制免疫政策，疫苗接種覆蓋率幾乎達(dá)到100％，所以群體豬瘟病毒抗體的陽(yáng)性率始終保持在80％以上。表3豬瘟抗體檢測(cè)臨床血清樣品檢測(cè)結(jié)果1.10.2豬病毒性傳染病血清igg抗體多重elisa檢測(cè)方法-pcv2血清抗體檢測(cè)本發(fā)明涉及的pcv2血清抗體檢測(cè)方法(hrp-cap)與間接免疫熒光(if)實(shí)驗(yàn)相比較。if實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程摘要：6孔板中的pk-15細(xì)胞長(zhǎng)至75％時(shí)，將實(shí)驗(yàn)室分離的pcv2毒株接種，孵育1h，棄去病毒液，無(wú)菌pbs洗滌三次；加入mem細(xì)胞維持液培養(yǎng)48h(5％co2，37℃)，棄去培養(yǎng)液；加入4％的多聚甲醛固定15min，棄去液體，無(wú)菌pbs洗滌三次；加入0.1％的tritonx-100透化10min，棄去多余液體，無(wú)菌pbs洗滌三次；將標(biāo)準(zhǔn)pcv2陽(yáng)性血清、陰性血清和待檢測(cè)血清樣品做1:50稀釋，1.5ml/孔，4℃孵育過(guò)夜，吸出血清，1×pbst(ph7.2)洗滌4次；加入fitc標(biāo)記的兔抗豬igg單克隆抗體，37℃孵育5h，棄去液體，1×pbst(ph7.2)洗滌4次，倒置熒光顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。igg血清抗體多重elisa檢測(cè)方法中pcv2血清抗體比較結(jié)果見如表4所示。從比較結(jié)果可以看出，hrp-cap抗體檢測(cè)方法陽(yáng)性檢出率為86％(43/50),陰性檢測(cè)率為14％(7/50)。if實(shí)驗(yàn)中，pcv2血清抗體的陽(yáng)性檢測(cè)率為76％(38/50),陰性檢測(cè)率為24％(12/50)。二種方法的陽(yáng)性符合率為81.39％，陰性符合率為57.14％，總體符合率達(dá)到78％。本發(fā)明研發(fā)的多重elisa中，hrp-cappcv2抗體檢測(cè)試劑盒陽(yáng)性檢出率比if實(shí)驗(yàn)高出10％。兩種方法的比較結(jié)果說(shuō)明，elisa方法比if實(shí)驗(yàn)敏感性高，并且操作過(guò)程、耗費(fèi)時(shí)間和實(shí)驗(yàn)費(fèi)用要遠(yuǎn)低于if實(shí)驗(yàn)，因此，elisa方法是臨床上檢測(cè)pcv2血清抗體的最常用的方法。表4：pcv2檢測(cè)臨床血清樣品檢測(cè)結(jié)果雖然該豬場(chǎng)從未接種過(guò)pcv2疫苗，但50份血清中pcv2抗體陽(yáng)性率可達(dá)到81.39％，說(shuō)明該豬場(chǎng)pcv2持續(xù)性感染情況比較普遍，但整個(gè)豬群未觀察到疑似pcv2感染導(dǎo)致的臨床癥狀，仔豬成活率一直平穩(wěn)。根據(jù)大量流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pcv2持續(xù)性感染現(xiàn)象幾乎已遍及我國(guó)乃至全世界的所有豬場(chǎng)，尚無(wú)有效方法評(píng)估pcv2持續(xù)性感染對(duì)豬群造成的損失程度，也缺乏有效手段凈化pcv2豬群。預(yù)防pcv2感染是世界養(yǎng)豬業(yè)面臨的一大難題。1.10.3豬病毒性傳染病血清igg抗體多重elisa檢測(cè)方法---豬偽狂犬病毒hrp-ge和hrp-gb血清抗體檢測(cè)prv-ge和gb血清抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢科前生物制品有限公司，方法為間接elisa(ielisa：ielisa-ge,ielisa-gb)。三種試劑盒的比較結(jié)果如表5所示。50份血清樣品來(lái)自從未免疫prv疫苗的豬群，該豬場(chǎng)從未發(fā)生過(guò)偽狂犬疫情。在本實(shí)驗(yàn)中抗偽狂犬e蛋白的抗體為陽(yáng)性的3頭豬，均表現(xiàn)為健康，未觀察到任何臨床癥狀。依據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明采自ge和gb抗體的陽(yáng)性豬曾感染過(guò)偽狂犬病毒，目前已經(jīng)康復(fù)。本發(fā)明所涉及的hrp-ge和hrp-gb血清抗體檢測(cè)方法與商品化的ielisa-ge和ielisa-gb總符合率達(dá)到92％，說(shuō)明本方法與商品化具有相似的敏感性和特異性。表5：prvge和gb檢測(cè)臨床血清樣品檢測(cè)結(jié)果在本實(shí)驗(yàn)中抗prvge蛋白的抗體為陽(yáng)性的3頭豬，均表現(xiàn)為健康，未觀察到任何臨床癥狀。依據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明采自ge和gb抗體的陽(yáng)性豬曾感染過(guò)偽狂犬病毒，目前已經(jīng)康復(fù)。本發(fā)明所涉及的hrp-ge和hrp-gb血清抗體檢測(cè)方法與商品化的ielisa-ge和ielisa-gb總符合率達(dá)到92％，說(shuō)明本方法與商品化具有相似的敏感性和特異性。當(dāng)前第1頁(yè)12