本發(fā)明涉及一種毒死蜱檢測酶聯(lián)免疫試劑盒，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
毒死蜱(chlorpyrifos)中文別名：氯吡硫磷；樂斯本；白蟻清；氯吡磷，高效、廣譜有機磷殺蟲劑--毒死蜱，對害蟲具有觸殺、胃毒和熏蒸作用，尤其對褐飛虱的防治有非常好的效果?，F(xiàn)有國標等相關檢測方法為氣相、液相或氣質連用等方法，該類方法儀器設備采購成本高，人員要求高、試劑耗材昂貴、檢測周期長。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種毒死蜱檢測酶聯(lián)免疫試劑盒，以便更好地實現(xiàn)檢測，提供檢測效率、準確率，改善其使用效果。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案如下。
一種毒死蜱檢測酶聯(lián)免疫試劑盒，包括酶標板、酶標記物工作液、毒死蜱特異性抗體濃縮液、洗滌工作液、復溶工作液和tmb顯色液，其中，所述酶標板的微孔條上預包被毒死蜱偶聯(lián)抗原，所述酶標記物工作液為酶標記抗抗體工作液；具體如下：
(1)洗滌工作液，濃縮洗滌液1：19體積比稀釋而成，ph值為7.1～7.5，含有0.8％～1.2％吐溫-20、0.01‰～0.03‰硫柳汞防腐劑、0.01～0.03mol/l的磷酸鹽緩沖液，百分比為重量體積百分比；
(2)復溶工作液，濃縮復溶液1：1體積比稀釋而成，ph值為7.2～7.7，含有8％～12％卵清蛋白、0.1～0.4mol/l的磷酸鹽緩沖液，百分比為重量體積百分比；
(3)tmb顯色液，包括tmb底物液a液和tmb底物液b液，a液為過氧化氫，b液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；
(4)終止液為0.5mol/l的鹽酸緩沖液；
(5)酶標板采用96孔酶標板，在酶標板制備過程中所用的包被緩沖液為ph值9.6、0.05mol/l的碳酸鹽緩沖液，所用封閉液為ph值9.1～9.5，含有3％～10％小牛血清、0.2％吐溫-20、0.1～0.3mol/l的碳酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比；
(6)毒死蜱特異性抗體的制備流程為：將這兩種抗原注入到小鼠進行免疫反應，最終得到兩種針對不同毒死蜱結構的抗體；
(7)酶標二抗工作液，本實施例酶標二抗采用羊抗鼠抗抗體，以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原，對無病原體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；
(8)毒死蜱標準溶液，濃度分別為0μg/l、5μg/l、15μg/l、45μg/l、135μg/l和405μg/l；其中標準品稀釋液為ph值7.4的0.02mol/l磷酸鹽緩沖液。
進一步地，酶標板的制備過程為，用包被緩沖液將包被原稀釋成0.1～0.2μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h或4℃過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封閉液37℃溫育1～2h，傾去孔內液體拍干，干燥后用鋁膜真空。
進一步地，毒死蜱免疫抗原制備方法為：將毒死蜱0.7g加熱下溶解于20ml無水甲醇中，加入0.16g鹽酸羥胺進行，加入1g氫氧化鉀作為催化劑，加熱80℃回流反應，薄層色譜監(jiān)測反應的進行，反應完成后，硅膠柱凈化、提純反應產物0.65g，將0.65g產物溶于無水四氫呋喃中，加入0.21g丁二酸酐，加入0.1gdmap(4-二甲氨基吡啶)作為催化劑，用薄層色譜監(jiān)測反應的進行；在該反應中，毒死蜱與丁二酸酐的摩爾比為1：1.2；稱取以上半抗原0.1g，分別溶解于3mln,n-二甲基甲酰胺溶液，分別加入nhs(n-羥基丁二酰亞胺)/edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)混合水溶液，活化4小時；活化后溶液分別加入到bsa(牛血清白蛋白)溶液中(含bsa220mg)，調ph8.5左右，室溫反應24小時，轉到透析袋中于pb(0.02mol/l磷酸鹽緩沖溶液中)溶液中透析3天，每天早晚換液。
該發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明毒死蜱檢測酶聯(lián)免疫試劑盒，是應用elisa技術研發(fā)的新一代藥物殘留檢測產品，與傳統(tǒng)儀器分析技術相比，具有檢測快速、簡便、準確，低成本以及檢測靈敏度高等特點，能最大限度地減少操作誤差和工作強度。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明的具體實施方式進行描述，以便更好的理解本發(fā)明。
實施例
一種毒死蜱檢測酶聯(lián)免疫試劑盒，包括酶標板、酶標記物工作液、毒死蜱特異性抗體濃縮液、洗滌工作液、復溶工作液和tmb顯色液，其中，所述酶標板的微孔條上預包被毒死蜱偶聯(lián)抗原，所述酶標記物工作液為酶標記抗抗體工作液；具體如下：
(1)洗滌工作液，濃縮洗滌液1：19體積比稀釋而成，ph值為7.1～7.5，含有0.8％～1.2％吐溫-20、0.01‰～0.03‰硫柳汞防腐劑、0.01～0.03mol/l的磷酸鹽緩沖液，百分比為重量體積百分比；
(2)復溶工作液，濃縮復溶液1：1體積比稀釋而成，ph值為7.2～7.7，含有8％～12％卵清蛋白、0.1～0.4mol/l的磷酸鹽緩沖液，百分比為重量體積百分比；
(3)tmb顯色液，包括tmb底物液a液和tmb底物液b液，a液為過氧化氫，b液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；
(4)終止液為0.5mol/l的鹽酸緩沖液；
(5)酶標板采用96孔酶標板，在酶標板制備過程中所用的包被緩沖液為ph值9.6、0.05mol/l的碳酸鹽緩沖液，所用封閉液為ph值9.1～9.5，含有3％～10％小牛血清、0.2％吐溫-20、0.1～0.3mol/l的碳酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比；酶標板的制備過程為，用包被緩沖液將包被原稀釋成0.1～0.2μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h或4℃過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封閉液37℃溫育1～2h，傾去孔內液體拍干，干燥后用鋁膜真空；
毒死蜱免疫抗原制備方法為：將毒死蜱0.7g加熱下溶解于20ml無水甲醇中，加入0.16g鹽酸羥胺進行，加入1g氫氧化鉀作為催化劑，加熱80℃回流反應，薄層色譜監(jiān)測反應的進行，反應完成后，硅膠柱凈化、提純反應產物0.65g，將0.65g產物溶于無水四氫呋喃中，加入0.21g丁二酸酐，加入0.1gdmap(4-二甲氨基吡啶)作為催化劑，用薄層色譜監(jiān)測反應的進行。在該反應中，毒死蜱與丁二酸酐的摩爾比為1：1.2。
稱取以上半抗原0.1g，分別溶解于3mln,n-二甲基甲酰胺溶液，分別加入nhs(n-羥基丁二酰亞胺)/edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)混合水溶液，活化4小時；活化后溶液分別加入到bsa(牛血清白蛋白)溶液中(含bsa220mg)，調ph8.5左右，室溫反應24小時，轉到透析袋中于pb(0.02mol/l磷酸鹽緩沖溶液中)溶液中透析3天，每天早晚換液。得到的兩種抗原。同上方法可以兩種不同的包被原，實驗證明兩種方法所得到的抗體均能特異性識別、檢測小分子農藥毒死蜱。
(6)毒死蜱特異性抗體的制備流程為：將這兩種抗原注入到小鼠進行免疫反應，最終得到兩種針對不同毒死蜱結構的抗體。
(7)酶標二抗工作液，本實施例酶標二抗采用羊抗鼠抗抗體，以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原，對無病原體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。本實施例為酶標記的鼠抗抗體，本實施例的標記酶為辣根過氧化物酶，標記酶酶標記的羊抗鼠抗抗體是采用戊二醛法將標記酶與抗抗體進行偶聯(lián)得到；
酶標二抗通過稀釋，酶標二抗得到工作液，稀釋處理同現(xiàn)有技術；
(8)毒死蜱標準溶液，濃度分別為0μg/l、5μg/l、15μg/l、45μg/l、135μg/l和405μg/l。
其中標準品稀釋液為ph值7.4的0.02mol/l磷酸鹽緩沖液。
針對上述樣品進行以下檢測：
(1)檢測限測試：
表1產品檢測限測定
(2)精密度測試：
表2蔬菜樣本精密度測定(添加1μg/g)
(3)準確率測試
表3蔬菜樣本準確度測定(添加1μg/g)
(4)特異性測試(交叉反應率)：
交叉反應率試驗：選擇其他類農藥藥物測定交叉反應率，通過各種藥物的標準曲線分別得到其50％抑制濃度(即ic50)，交叉反應率(％)＝(毒死蜱ic50/其他類農藥ic50)×100％，結果見表4。
表4交叉反應率測定
(5)產品穩(wěn)定性測試：
試劑盒保存性試驗：試劑盒保存條件為2～8℃，經過12個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標準)、50％抑制濃度、毒死蜱添加實際測定值均在正常范圍之內。結果見表5
表5試劑產品穩(wěn)定性保存記錄表
以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明的保護范圍。