本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術領域，具體涉及一種甲狀腺球蛋白酶聯(lián)免疫診斷試劑盒。
背景技術：
甲狀腺疾病在我國是常見病、多發(fā)病。甲狀腺球蛋白(TG)是甲狀腺特有的一種抗原，具有重要的臨床意義，在各種甲狀腺疾病患者血清中都會有不同程度地出現(xiàn)TG異常。臨床上通過測定TG的含量，有助于甲狀腺疾病的診斷。
TG是甲狀腺濾泡上皮分泌的660ku糖蛋白，每個TG約有2個甲狀腺素(T4)和0.5個三碘甲腺原氨酸(T3)分子，儲存在濾泡腔中。溶酶體水解TG表面T4、T3并使之釋放入血，同時少量的TG也釋放入血，部分TG經(jīng)甲狀腺淋巴管分泌入血。血循環(huán)中的TG被肝臟的巨噬細胞清除。血清TG的改變較多見于甲狀腺部位的惡性腫瘤，如TG在甲狀腺濾泡狀癌、甲狀腺乳頭狀癌和間變癌都可出現(xiàn)不同程度的升高；而甲狀腺髓樣癌血TG可正?；蚪档?。前者主要是因為甲狀腺的破壞以及腫瘤組織分泌一定量的TG，而致血中TG升高；后者的腫瘤組織來源于甲狀腺C細胞，而非甲狀腺上皮細胞，故其血清TG并不升高。甲狀腺功能亢進癥、甲狀腺瘤、亞急性甲狀腺炎以及慢性淋巴細胞性甲狀腺炎等甲狀腺疾病都可出現(xiàn)血中TG水平升高。從檢測的角度上來說，目前臨床上用于測定TG的方法主要有放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、化學發(fā)光免疫分析法等。
過去以放射免疫分析法為代表的甲狀腺球蛋白(TG)測定試劑盒受方法學的限制，其靈敏度和抗干擾能力嚴重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市場；化學發(fā)光免疫分析法的操作復雜，有效期短，不利于推廣應用；ELISA法作為定性和半定量的檢測方法，抗原、抗體的結合反應是在固相(ELISA板反應孔)表面進行的，其靈敏度、特異性均較好，且經(jīng)濟實惠，所以是應用得最廣、最多的方法。但是在酶聯(lián)免疫診斷試劑盒使用中，試劑盒的穩(wěn)定性是制約產(chǎn)品市場化的關鍵?，F(xiàn)在市場不同廠家生產(chǎn)的甲狀腺球蛋白酶聯(lián)免疫診斷試劑盒普遍存在著保存期短、穩(wěn)定性差等問題，極大限制了甲狀腺球蛋白酶聯(lián)免疫診斷試劑盒在臨床上推廣和應用。國外已有多項的有關穩(wěn)定劑的專利和產(chǎn)品問世，而國內(nèi)在診斷試盒穩(wěn)定劑方面尚在探索階段，穩(wěn)定劑研究成為我國酶聯(lián)免疫診斷試劑盒研發(fā)必須克服的技術瓶頸。目前，已有針對蔗糖、海藻糖、乳糖、明膠、甘油、山梨醇、谷氨酸鈉、聚乙二醇等穩(wěn)定劑的研究。
技術實現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有甲狀腺球蛋白酶聯(lián)免疫診斷試劑盒中普遍存在的保存期短、穩(wěn)定性差等問題，本發(fā)明提供了一種甲狀腺球蛋白酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，該試劑盒具有良好的穩(wěn)定性，在室溫條件下有效期為1年，在4℃條件下有效期可達3年，顯著提高了試劑盒的保存期。
本發(fā)明提供的甲狀腺球蛋白酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，由甲狀腺球蛋白多克隆抗體包被板、對照緩沖液、酶標記液、洗滌液、顯色液、底物液、甲狀腺球蛋白標準品和終止液組成；
其中，所述甲狀腺球蛋白多克隆抗體包被板的制備過程為：將包被用的甲狀腺球蛋白多克隆抗體用0.05mol/L pH9.0的碳酸鹽緩沖液液稀釋后，按0.1mL/孔包被到微孔板內(nèi)，在4～8℃吸附24～26小時后，用0.05mol/L pH9.0的磷酸鹽緩沖液洗板，再用封閉液在4～8℃封閉18～20小時，棄除多余的封閉液，經(jīng)真空干燥處理后制得甲狀腺球蛋白多克隆抗體包被板；
所述酶標記液為含0.5mg/L的辣根過氧化物酶標記的甲狀腺球蛋白單克隆抗體、0.1～0.6mg/L的聚乙二醇-200和1～3mg/L的殼聚糖的15mmol/L pH8.0磷酸鹽緩沖液。
進一步的，所述對照緩沖液為15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
進一步的，所述洗滌液為含0.5g/L的吐溫-20的15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
進一步的，所述顯色液為四甲基聯(lián)苯胺的甲醇溶液，濃度為0.1mg/mL。
進一步的，所述終止液為3mol/L H2SO4溶液。
進一步的，所述底物液為pH7.4磷酸-檸檬酸緩沖液配制的3％過氧化氫溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氫鈉。
進一步的，所述封閉液為含3～5g/L的蔗糖、0.5～2g/L的鼠李糖脂和1.5g/L的蛋清白蛋白的20mmol/L pH9.0的磷酸鹽緩沖液。
進一步的，所述甲狀腺球蛋白標準品為取相應量的甲狀腺球蛋白溶解于含有3g/L雞卵清白蛋白的20mmol/L pH9.0的磷酸鹽緩沖液，甲狀腺球蛋白標準品的濃度依次為1.0μg/L、2.5μg/L、5.0μg/L、10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L和200μg/L。
本發(fā)明甲狀腺球蛋白酶聯(lián)免疫診斷試劑盒的檢測原理：
本試劑盒在微孔板內(nèi)包被甲狀腺球蛋白多克隆抗體，若待測樣本中有甲狀腺球蛋白即可與之結合，再與酶標記的甲狀腺球蛋白單克隆抗體反應，形成“抗原-抗體-酶復合物”，酶催化顯色劑顯色，根據(jù)顯色程度可判斷甲狀腺球蛋白的有無，并且測定甲狀腺球蛋白的含量。另外，本發(fā)明試劑盒在包被抗原的過程中使用了含有蔗糖和鼠李糖脂的封閉液，在酶標記液中添加了聚乙二醇-200和殼聚糖。蔗糖和鼠李糖脂的組合，以及聚乙二醇-200和殼聚糖的組合作為穩(wěn)定劑，對包被抗原、酶標抗體起到了很好的保護作用，使包被抗原、酶標抗體的親和力、免疫活性、靈敏度等不降低，從而顯著提高本發(fā)明試劑盒的保存期。
因此，與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于：
本發(fā)明甲狀腺球蛋白酶聯(lián)免疫診斷試劑盒的靈敏度高、特異性強、準確度高，且具有良好的穩(wěn)定性，在室溫條件下有效期為1年，在4℃條件下有效期可達3年，顯著提高了試劑盒的保存期，有利于甲狀腺球蛋白酶聯(lián)免疫診斷試劑盒在臨床上的推廣和應用。
具體實施方式
下面將進一步的詳細說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發(fā)明要求保護的技術方案的舉例說明，并非對這些技術方案的任何限制。本發(fā)明的保護范圍以所附權利要求書記載的內(nèi)容為準。
在本發(fā)明中，甲狀腺球蛋白、甲狀腺球蛋白多克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的甲狀腺球蛋白單克隆抗體均可通過商業(yè)渠道獲得。鼠李糖脂(米黃色粉末、45～60％、pH5～6)購自大慶沃太斯化工有限公司。殼聚糖(有效物質(zhì)含量99％)購自西安南斯生物科技有限公司。
另外，下列實施例中未注明具體實驗條件和操作的方法，均按照本領域常規(guī)方法進行。
實施例1、本發(fā)明甲狀腺球蛋白酶聯(lián)免疫診斷試劑盒
本實施例試劑盒由甲狀腺球蛋白多克隆抗體包被板、對照緩沖液、酶標記液、洗滌液、顯色液、底物液、甲狀腺球蛋白標準品和終止液組成；
其中，所述甲狀腺球蛋白多克隆抗體包被板的制備過程為：將包被用的甲狀腺球蛋白多克隆抗體用0.05mol/L pH9.0的碳酸鹽緩沖液液稀釋后，按0.1mL/孔包被到微孔板內(nèi)，在4℃吸附24小時后，用0.05mol/L pH9.0的磷酸鹽緩沖液洗板，再用封閉液在4℃封閉18小時，棄除多余的封閉液，經(jīng)真空干燥處理后制得甲狀腺球蛋白多克隆抗體包被板；
所述酶標記液為含0.5mg/L的辣根過氧化物酶標記的甲狀腺球蛋白單克隆抗體、0.1mg/L的聚乙二醇-200和1mg/L的殼聚糖的15mmol/L pH8.0磷酸鹽緩沖液。
所述對照緩沖液為15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
所述洗滌液為含0.5g/L的吐溫-20的15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
所述顯色液為四甲基聯(lián)苯胺的甲醇溶液，濃度為0.1mg/mL。
所述終止液為3mol/L H2SO4溶液。
所述底物液為pH7.4磷酸-檸檬酸緩沖液配制的3％過氧化氫溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氫鈉。
所述封閉液為含3g/L的蔗糖、0.5g/L的鼠李糖脂和1.5g/L的蛋清白蛋白的20mmol/L pH9.0的磷酸鹽緩沖液。
所述甲狀腺球蛋白標準品為取相應量的甲狀腺球蛋白溶解于含有3g/L雞卵清白蛋白的20mmol/L pH9.0的磷酸鹽緩沖液，甲狀腺球蛋白標準品的濃度依次為1.0μg/L、2.5μg/L、5.0μg/L、10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L和200μg/L。
實施例2、本發(fā)明甲狀腺球蛋白酶聯(lián)免疫診斷試劑盒
本實施例試劑盒由甲狀腺球蛋白多克隆抗體包被板、對照緩沖液、酶標記液、洗滌液、顯色液、底物液、甲狀腺球蛋白標準品和終止液組成；
其中，所述甲狀腺球蛋白多克隆抗體包被板的制備過程為：將包被用的甲狀腺球蛋白多克隆抗體用0.05mol/L pH9.0的碳酸鹽緩沖液液稀釋后，按0.1mL/孔包被到微孔板內(nèi)，在8℃吸附26小時后，用0.05mol/L pH9.0的磷酸鹽緩沖液洗板，再用封閉液在8℃封閉20小時，棄除多余的封閉液，經(jīng)真空干燥處理后制得甲狀腺球蛋白多克隆抗體包被板；
所述酶標記液為含0.5mg/L的辣根過氧化物酶標記的甲狀腺球蛋白單克隆抗體、0.6mg/L的聚乙二醇-200和3mg/L的殼聚糖的15mmol/L pH8.0磷酸鹽緩沖液。
所述對照緩沖液為15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
所述洗滌液為含0.5g/L的吐溫-20的15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
所述顯色液為四甲基聯(lián)苯胺的甲醇溶液，濃度為0.1mg/mL。
所述終止液為3mol/L H2SO4溶液。
所述底物液為pH7.4磷酸-檸檬酸緩沖液配制的3％過氧化氫溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氫鈉。
所述封閉液為含5g/L的蔗糖、2g/L的鼠李糖脂和1.5g/L的蛋清白蛋白的20mmol/L pH9.0的磷酸鹽緩沖液。
所述甲狀腺球蛋白標準品為取相應量的甲狀腺球蛋白溶解于含有3g/L雞卵清白蛋白的20mmol/L pH9.0的磷酸鹽緩沖液，甲狀腺球蛋白標準品的濃度依次為1.0μg/L、2.5μg/L、5.0μg/L、10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L和200μg/L。
實施例3、本發(fā)明甲狀腺球蛋白酶聯(lián)免疫診斷試劑盒
本實施例試劑盒由甲狀腺球蛋白多克隆抗體包被板、對照緩沖液、酶標記液、洗滌液、顯色液、底物液、甲狀腺球蛋白標準品和終止液組成；
其中，所述甲狀腺球蛋白多克隆抗體包被板的制備過程為：將包被用的甲狀腺球蛋白多克隆抗體用0.05mol/L pH9.0的碳酸鹽緩沖液液稀釋后，按0.1mL/孔包被到微孔板內(nèi)，在6℃吸附24小時后，用0.05mol/L pH9.0的磷酸鹽緩沖液洗板，再用封閉液在6℃封閉18小時，棄除多余的封閉液，經(jīng)真空干燥處理后制得甲狀腺球蛋白多克隆抗體包被板；
所述酶標記液為含0.5mg/L的辣根過氧化物酶標記的甲狀腺球蛋白單克隆抗體、0.4mg/L的聚乙二醇-200和2mg/L的殼聚糖的15mmol/L pH8.0磷酸鹽緩沖液。
所述對照緩沖液為15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
所述洗滌液為含0.5g/L的吐溫-20的15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
所述顯色液為四甲基聯(lián)苯胺的甲醇溶液，濃度為0.1mg/mL。
所述終止液為3mol/L H2SO4溶液。
所述底物液為pH7.4磷酸-檸檬酸緩沖液配制的3％過氧化氫溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氫鈉。
所述封閉液為含4g/L的蔗糖、1g/L的鼠李糖脂和1.5g/L的蛋清白蛋白的20mmol/L pH9.0的磷酸鹽緩沖液。
所述甲狀腺球蛋白標準品為取相應量的甲狀腺球蛋白溶解于含有3g/L雞卵清白蛋白的20mmol/L pH9.0的磷酸鹽緩沖液，甲狀腺球蛋白標準品的濃度依次為1.0μg/L、2.5μg/L、5.0μg/L、10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L和200μg/L。
對比例1
與實施例3相比，本對比例的區(qū)別僅在于：所述封閉液中不添加鼠李糖脂，蔗糖含量由4g/L改為5g/L。
對比例2
與實施例3相比，本對比例的區(qū)別僅在于：所述封閉液中不添加蔗糖，鼠李糖脂含量由1g/L改為5g/L。
對比例3
與實施例3相比，本對比例的區(qū)別僅在于：所述酶標記液中不添加殼聚糖，聚乙二醇-200含量由0.4mg/L改為2.4mg/L。
對比例4
與實施例3相比，本對比例的區(qū)別僅在于：所述酶標記液中殼聚糖的含量由2mg/L改為4mg/L。
試驗例、本發(fā)明甲狀腺球蛋白酶聯(lián)免疫診斷試劑盒的檢測：
1.檢測方法的操作過程：
(1)試劑準備：將試劑盒平衡至室溫；
(2)加樣：將所需數(shù)量的甲狀腺球蛋白多克隆抗體包被板條固定于板架上，按序加入50μl待測血清樣本或甲狀腺球蛋白標準品；每次實驗設空白對照(對照緩沖液)；震蕩混勻，封板，37℃溫育50分鐘，用洗滌液洗板5次，拍干。
(3)加酶：每孔加入酶標記液100μl，震蕩混勻，封板，37℃溫育50分鐘，用洗滌液洗板5次，拍干。
(4)顯色讀值：每孔加入底物液、顯色液各50μl，混勻，封板，置37℃避光顯色20分鐘。每孔加終止液50μl，混勻，10分鐘內(nèi)完成結果測定。用酶標儀在450nm波長下測定各孔的OD值并記錄。
以甲狀腺球蛋白含量為對數(shù)橫坐標，以吸光度為縱坐標，在對數(shù)坐標紙上繪制標準曲線，從標準曲線上查得各待測樣品的甲狀腺球蛋白含量。
2.性能指標：
甲狀腺球蛋白標準曲線范圍1.0μg/L至200μg/L，相應吸光度為0.3～1.5.呈曲線表現(xiàn)?？瞻孜舛刃∮?.2。
(1)分析靈敏度：對甲狀腺球蛋白含量分別為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μg/L的標準品及空白對照各測定12次，求出各組的均值和標準差。以空白對照均值加3倍空白標準差的吸光度對應甲狀腺球蛋白量為本法的檢測低限，結果為0.10μg/L。
以某一甲狀腺球蛋白的重復測定值的CV最接近于20％的該組具有的甲狀腺球蛋白量為本法的功能靈敏度，即可定量報告的最低限，確定為1.0μg/L。
(2)精密度：取2個標準品，濃度為20μg/L和100μg/L，每個標準品同時測定8個復管，批內(nèi)變異系數(shù)為7～9％。取2個標準品，濃度為20μg/L和100μg/L，每個標準品同時測定8次，批間變異系數(shù)分別為11～12％。
(3)準確性：取2個標準品，濃度為100μg/L和200μg/L，各加入一定量的甲狀腺球蛋白標準品，測定甲狀腺球蛋白的回收率在93～106％之間，平均回收率為101.6％。
(4)穩(wěn)定性：
將實施例1～3和對比例1～4制備的試劑盒在20℃分別放置6個月和12個月后，測定試劑盒的靈敏度，并對數(shù)據(jù)進行回歸分析，計算R2值。結果見下表。
由上表可知：
1)本發(fā)明實施例1～3試劑盒的穩(wěn)定性良好，在20℃分別放置6個月和12個月后靈敏度不變，且線性良好。另外，本發(fā)明實施例1～3試劑盒在4℃下保存36個月，其靈敏度及線性良好，與剛制備的試劑盒無明顯差別。
2)在20℃分別放置6個月和12個月后對比例1～3試劑盒的靈敏度明顯下降，且線性不佳；而對比例4試劑盒的靈敏度僅有所下降，但是其線性不佳。
本發(fā)明內(nèi)容僅僅舉例說明了要求保護的一些具體實施方案，其中一個或更多個技術方案中所記載的技術特征可以與任意的一個或多個技術方案相組合，這些經(jīng)組合而得到的技術方案也在本申請保護范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術方案已經(jīng)在本發(fā)明公開內(nèi)容中具體記載一樣。