本發(fā)明涉及口蹄疫合成肽疫苗檢測技術領域，具體涉及一種油佐劑疫苗的競爭ELISA定性定量檢測方法。

背景技術：

口蹄疫合成肽疫苗是一種通過人工方法按天然蛋白質的氨基酸順序合成的保護性短肽?，F有定量測定方法通常有Lowry法、BCA法、HPLC等方法?，F有的定量方法中主要是針對純化后的抗原，若用于疫苗破乳后抗原檢測，由于疫苗水相成分較復雜，待檢樣品通常需要耗費大量時間純化后才能達到檢測目的，且很多常規(guī)方法檢測靈敏度有限，無法達到檢測要求。

酶聯免疫吸附試驗(ELISA)一起快速、方便、特異、可定量等優(yōu)點，在很多領域中得到廣泛應用。常規(guī)的間接競爭ELISA中，抗原與有限濃度的抗體同時加入到固相吸附有抗原的ELISA板子中進行反應，抗體與游離的抗原、固相化的抗原結合率概率為50％，得到的結果繪制的標準曲線斜率較低，這使得檢測靈敏度較低。不能很好的反應口蹄疫合成肽疫苗中有效抗原含量。

目前，對于口蹄疫合成肽抗原成品、半成品和疫苗抗原含量定量檢測沒有通用準確的方法。為了尋找更加快速，有效，方便的的檢測方式，本發(fā)明人通過大量實驗在常規(guī)間接競爭ELISA的基礎上進行了改進。

技術實現要素：

針對現有技術中的缺陷，本發(fā)明提供了一種油佐劑疫苗的競爭ELISA定性定量檢測方法，為一種抗原定量檢測方法。通過對間接競爭ELISA方法的改進，先將抗原與有限濃度的抗體先在稀釋板中反應，抗體與抗原先完全中和。在隨后與固相化吸附有抗原的ELISA板中進行反應，造成固相化抗原、待測抗原與抗體結合的機會不均等。最終，得到的標準曲線斜率會大于常規(guī)間接競爭ELISA，從而大大提高檢測靈敏度。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現的：

本發(fā)明提供了一種油佐劑疫苗的競爭ELISA定性定量檢測方法，包括以下步驟：

抗原包被：將0.5μg/mL-5μg/mL人工合成的口蹄疫抗原固相化吸附到ELISA板子上；

稀釋抗體：將已知效價的抗體進行稀釋，抗體稀釋后效價為1:250000-1:1100000；

抗原稀釋：在血清稀釋板上，用稀釋液將待檢抗原稀釋，標準抗原進行不同比例稀釋形成不同濃度的標準抗原稀釋液；

抗原標準曲線繪制及待檢抗原的定量檢測：將稀釋好的待檢抗原和不同濃度的標準抗原稀釋液分別與稀釋好的抗體在稀釋板中進行完全反應，然后將各完全反應后的反應液分別加入到固相化抗原的ELISA板子中繼續(xù)反應，反應結束后，各加入酶標記物、底物依次反應，再各加入終止液終止，測定OD值，采用不同濃度的標準抗原的對數值為橫坐標，標準抗原的OD值為縱坐標繪制抗原標準曲線，然后將待檢抗原的OD值帶入標準曲線中算出待測對應抗原濃度，再乘以稀釋倍數即為待測樣品中抗原實際含量。

優(yōu)選地，所述待檢抗原最低檢測限度為1ng/mL-1.5ng/mL。

優(yōu)選地，抗原標準曲線繪制及待檢抗原的定量檢測步驟中，所述完全反應的時間大于等于60min，反應溫度為37℃。該反應時間可盡可能的保證反應完全。

優(yōu)選地，抗原標準曲線繪制及待檢抗原的定量檢測步驟中，所述各完全反應后的反應液分別加入到固相化抗原的ELISA板子中繼續(xù)反應大于等于30min，反應溫度為37℃。該反應時間若小于30min，會導致反應不徹底，最終OD值偏低，影響結果的準確性。

優(yōu)選地，抗原標準曲線繪制及待檢抗原的定量檢測步驟中，所述酶標記物為SPA-HRP，或者為羊抗豬生物素-IgG和親和素-HRP。

更優(yōu)選地，所述酶標記物為羊抗豬生物素-IgG和親和素-HRP。采用羊抗豬生物素-IgG和親和素-HRP作為酶標記物，由于生物素親和素之間高親和力的牢固結合及多級放大效應，可使抗原的檢測限更低。

優(yōu)選地，所述稀釋后酶標記物的用量為100μL，稀釋比例為1:5000-1:10000。

優(yōu)選地，所述底物為：TMB溶液。

優(yōu)選地，所述終止液為2mol/L的H₂SO₄溶液。

優(yōu)選地，所述待檢抗原為：口蹄疫合成肽疫苗經破乳后的水相抗原合成肽抗原成品或半成品中的一種。

本發(fā)明的原理是：將抗原與有限濃度的抗體先在稀釋板中反應，待抗原抗體反應完全后，將反應液加入到固相吸附有抗原的ELISA板子中進行反應，之后加入酶標記物進行反應，最后與底物顯色進行檢測。最終的檢測結果表現為抗原濃度越高，顯色后檢測的OD值越低，成反比關系。將標準抗原進行不同比例稀釋進行競爭ELISA檢測繪制標準曲線，檢測樣品與標準曲線關聯從而達到定量的要求。

現有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

1)本方法先將抗原與有限濃度的抗體先在稀釋板中反應，抗體與待檢抗原先完全中和，達到完全抑制的目的。在隨后固相化吸附有抗原的ELISA板中，固相化抗原與抗體結合隨之減少，使得固相化抗原、待測抗原與抗體結合機會不均等。因此，得到的標準曲線斜率會大于常規(guī)間接競爭法，從而大大提高檢測靈敏度。

2)競爭抑制ELISA對試劑的要求非常少，不管是單抗還是多抗都可以用于實驗，更重要的是不管被檢對象是大分子物質還是多肽、小分子藥物、小分子激素等只有一個表位的分子不能使用夾心ELISA的都可以使用競爭ELISA進行檢測。

3)由于抗原抗體反應具有較高特異性，當抗原材料中的干擾物質不易去除，或不易得到足夠的純化抗原時，可用競爭法達到檢測目的。同時反應抗體稀釋后濃度較低，降低了非特異反應和交叉反應的干擾。

4)本方法可對合成肽抗原成品、半成品和合成肽疫苗抗原有效含量的定量檢測，檢測范圍廣。同時疫苗破乳后，水相成分較復雜，該方法簡單，操作簡便，破乳后水相樣品無需進行純化處理即可達到定量檢測目的，相比較其他檢測方法花費時間較短。

5)本發(fā)明采用間接法，利用很少量的酶可誘導大量的催化反應，產生可供觀察的顯色現象，使得抗原能在較低濃度下進行定量，靈敏度較高，且重復性好。

附圖說明

通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯：

圖1為實施例1的抗原標準曲線；

圖2為實施例2的抗原標準曲線；

圖3為對比例1的抗原標準曲線。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例1

本實施例提供了一種油佐劑疫苗的競爭ELISA定性定量檢測方法，具體采用以下步驟：

1.抗原包被：將3μg/mL人工合成口蹄疫抗原，每孔100μL，固相化到ELISA板子上；

2.稀釋抗體：將已知效價的抗體進行一定比例稀釋，稀釋后抗體效價為1:250000；

3.待檢抗原(所述待檢抗原為合成肽抗原成品，待檢抗原采用HPLC方法測得其抗原濃度為39.25μg/mL)與標準抗原稀釋：在血清稀釋板上，用稀釋液將待檢抗原按1:100稀釋，標準抗原分別按稀釋后濃度為1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL進行稀釋；

4.抗原抗體反應：在稀釋板中，將100μL稀釋好的待檢抗原和標準抗原中分別加入等量稀釋好的抗體并混勻，于37℃下孵育60min；

5.孵育結束后，將血清稀釋板中的各反應液分別吸取100μL到固相化有抗原的ELISA板中，于37℃下孵育30min；

6.孵育結束后，以PBST為洗液，洗板5次并拍干板中液體，向ELISA板中加入100μL1:10000稀釋好的SPA-HRP，于37℃下孵育30min；

7.孵育結束后，以PBST為洗液，洗板5次并拍干板中液體，向ELISA板中加入100μLTMB溶液，于37℃下避光顯色15min；

8.顯色結束后，向ELISA板中加入100μL 2mol/LH₂SO₄溶液終止反應，并于450nm波長下測定OD值；

9.根據測定的OD值，將各標準抗原濃度以10為底對數作為橫坐標，各標準抗原測得的OD450為縱坐標，進行線性回歸，得到標準曲線的回歸方程為y＝-0.3609x+1.4572，如圖1所示；將待檢抗原的OD值帶入標準曲線中算出待測對應抗原濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品中抗原實際含量。本實施例中，測得待檢抗原的OD值為0.525，計算得樣品中抗原的實際含量為38.02μg/mL。該計算結果與采用HPLC方法測得的結果基本一致。

實施例2

本實施例提供了一種油佐劑疫苗的競爭ELISA定性定量檢測方法，具體采用以下步驟：

1.抗原包被：將3μg/mL人工合成口蹄疫抗原，每孔100μL，固相化到ELISA板子上；

2.稀釋抗體：將已知效價的抗體進行一定比例稀釋，稀釋后抗體效價為1:1100000；

3.待檢抗原(所述待檢抗原為疫苗破乳后的水相樣品，破乳效率為89.2％，經純化后，采用HPLC方法測得其抗原濃度為148.83ng/mL)與標準抗原稀釋：在血清稀釋板上，將待檢抗原用稀釋液按1:100稀釋，已知標準抗原進行稀釋，稀釋濃度分別為1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL；

4.抗原抗體反應：在稀釋板中，將100μL稀釋好的待檢抗原和標準抗原中加入等量稀釋好的抗體并混勻，于37℃下孵育60min；

5.孵育結束后，將血清稀釋板中的反應液吸取100μL到固相化有抗原的ELISA板中，于37℃下孵育30min；

6.孵育結束后，以PBST為洗液，洗板5次并拍干板中液體，向ELISA板中加入100μL1:10000稀釋好的羊抗豬生物素-IgG，于37℃下孵育30min；

7.孵育結束后，以PBST為洗液，洗板5次并拍干板中液體，向ELISA板中加入100μL1:5000稀釋好的親和素-HRP，于37℃下孵育30min；

8.孵育結束后，以PBST為洗液，洗板5次并拍干板中液體，向ELISA板中加入100μLTMB溶液，于37℃下避光顯色15min；

9.顯色結束后，向ELISA板中加入100μL 2mol/LH₂SO₄溶液終止反應，并于450nm波長下測定OD值；

10.根據測定的OD值，以標準抗原濃度以10為底對數作為橫坐標，OD450為縱坐標，進行線性回歸，得到標準曲線的回歸方程為y＝-0.4021x+1.5186，如圖2所示；將待檢抗原的OD值帶入標準曲線中算出待測對應抗原濃度，抗原實際含量＝[(對應抗原濃度×稀釋倍數)/破乳效率]/2即為樣品中抗原實際含量。本實施例中，測得待檢抗原的OD值為1.350，計算得樣品中抗原的實際含量為147.43ng/mL。該計算結果與采用HPLC方法測得的結果基本一致。

注：由于疫苗破乳后，油相與水相分離，水相中實際抗原濃度增大1倍，計算疫苗實際抗原濃度需除以2。

采用本實施例方法對該樣品的10個平行樣進行同時測定，其結果的波動范圍在±0.80內，說明其重復性良好。

對比例1

本對比例提供了一種油佐劑疫苗的競爭ELISA定性定量檢測方法，包括以下步驟：

1.抗原包被：將3μg/mL人工合成口蹄疫抗原，每孔100μL，固相化到ELISA板子上；

2.稀釋抗體：將已知效價的抗體進行一定比例稀釋，稀釋后抗體效價為1:250000；

3.待檢抗原(所述待檢抗原為合成肽抗原成品，待檢抗原采用HPLC方法測得其抗原濃度為39.25μg/mL)與標準抗原稀釋：在血清稀釋板上，用稀釋液將待檢抗原按1:100稀釋，已已知標準抗原進行稀釋，稀釋濃度分別為1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL；所述待檢抗原與實施例1的待檢抗原為相同樣品；

4.抗原抗體反應：將稀釋好的待檢抗原和標準抗原中加入等量稀釋好的抗體并混勻，取100μL加入到固相化有抗原的ELISA板中，于37℃下孵育60min；

5.孵育結束后，以PBST為洗液，洗板5次并拍干板中液體，向ELISA板中加入100μL 1:10000稀釋好的SPA-HRP，于37℃下孵育30min；

6.孵育結束后，以PBST為洗液，洗板5次并拍干板中液體，向ELISA板中加入100μL底物溶液，于37℃下避光顯色15min；

7.顯色結束后，向ELISA板中加入100μL 2mol/LH₂SO₄溶液終止反應，并于450nm波長下測定OD值；

8.根據測定的OD值，以標準抗原濃度以10為底對數作為橫坐標，OD450為縱坐標，進行線性回歸，得到標準曲線的回歸方程為y＝-0.2787+1.3962，如圖3所示；將待檢抗原的OD值帶入標準曲線中算出待測對應抗原濃度，再乘以稀釋倍數即為樣品中抗原實際含量。本實施例中，測得待檢抗原的OD值為0.659，計算得樣品中抗原的實際含量為44.67μg/mL。該計算結果與采用HPLC方法測得的結果相差了5.42μg/mL。因此，對比實施例1和對比例1的結果可知，采用本發(fā)明的方法測定的結果更準確。

本發(fā)明具體應用途徑很多，以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。應當指出，以上實施例僅用于說明本發(fā)明，而并不用于限制本發(fā)明的保護范圍。對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進，這些改進也應視為本發(fā)明的保護范圍。