基于自帶電荷同位素試劑的生物分子標(biāo)記和定量分析方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種基于自帶電荷同位素試劑的生物分子標(biāo)記和定量分析方法。將兩組不同生理或病理?xiàng)l件的整體蛋白分別作為控制組與疾病組，分別進(jìn)行賴(lài)氨酸ε?氨基及N端氨基全部同重標(biāo)記，分別標(biāo)記為?N(C1113CH11N+OCH2)2和?N(C12H1115N+OCH2)2，其單個(gè)標(biāo)記后氨基的質(zhì)量差異為12.6mDa；同重標(biāo)記后兩組蛋白按等比例混合進(jìn)行高分辨質(zhì)譜和串級(jí)質(zhì)譜分析得到一個(gè)數(shù)據(jù)組；對(duì)數(shù)據(jù)組進(jìn)行定性、定量數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，得到蛋白質(zhì)的ID及疾病組每一個(gè)蛋白質(zhì)相對(duì)于控制組的相對(duì)比例，即疾病條件下所有蛋白的上調(diào)或下調(diào)情況。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明不僅標(biāo)記效率高，準(zhǔn)確度高，便宜易得；而且自帶電荷，將大大增強(qiáng)帶標(biāo)記蛋白的電噴霧電離和質(zhì)譜分析靈敏度和效率。適用于整體蛋白質(zhì)基于高分辨串級(jí)質(zhì)譜分析的定量。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
基于自帶電荷同位素試劑的生物分子標(biāo)記和定量分析方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種生物分子的定量方法，尤其是涉及一種基于自帶電荷同位素試劑的生物分子標(biāo)記和定量分析方法，主要涉及與生物質(zhì)譜相關(guān)的系統(tǒng)生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]同位素、同重、或近同重標(biāo)記現(xiàn)已廣泛用于蛋白的定量分析。標(biāo)記過(guò)程中，標(biāo)記試劑與蛋白質(zhì)N端氨基、C端羧基、或氨基酸序列上殘基上的官能團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)發(fā)生反應(yīng)，生成新的共價(jià)官能團(tuán)。這些新的官能團(tuán)的電離效率往往較原來(lái)的官能團(tuán)的低，從而導(dǎo)致標(biāo)記后蛋白質(zhì)的分析效率較低。
[0003]
【申請(qǐng)人】前期在整體蛋白質(zhì)定性定量分析方面已經(jīng)做了較多的工作，有較好的基礎(chǔ)。
[0004]在定量數(shù)據(jù)挖掘方面，公布號(hào)為CN103389335A的中國(guó)專(zhuān)利公布了一種鑒定生物大分子的分析裝置和方法。公布號(hào)為CN 104765984A的中國(guó)專(zhuān)利公布了一種生物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)快速建立與搜索的方法。公布號(hào)為CN104359967A的中國(guó)專(zhuān)利公布了一種生物質(zhì)譜重疊同位素輪廓的解析方法。上述專(zhuān)利中公布了同位素輪廓指紋比對(duì)算法(isotopic envelopefingerprinting，iEF)，直接在原始數(shù)據(jù)上進(jìn)行匹配離子的搜索和蛋白質(zhì)的鑒定。該算法無(wú)需對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行“去同位素”預(yù)處理，可以節(jié)省相應(yīng)的時(shí)間；根據(jù)各個(gè)離子中是否有同位素峰缺失和同位素峰相對(duì)強(qiáng)度的偏差對(duì)理想及非理想實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行很好的區(qū)分，保證蛋白鑒定的可信度;根據(jù)已知重疊離子的同位素峰相對(duì)強(qiáng)度關(guān)系對(duì)重疊實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行有效的解析。基于該算法
【申請(qǐng)人】成功地開(kāi)發(fā)了整體蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)搜索引擎ProteinGoggle，在單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白(泛素、肌紅蛋白)及整體蛋白質(zhì)組混合物(組蛋白H4家族翻譯后修飾異構(gòu)體、大腸桿菌)的定性鑒定中，表現(xiàn)出較高的可信度和較好的應(yīng)用前景。在定量分析方面，ProteinGoggle有著它內(nèi)在的和獨(dú)特的潛在優(yōu)勢(shì);一方面基于同位素輪廓及其中每個(gè)同位素的指紋比對(duì)可以快速精確地搜索同位素或同重標(biāo)記的定量離子對(duì);另一方面，搜索過(guò)程中每個(gè)離子中每個(gè)同位素峰的實(shí)驗(yàn)強(qiáng)度都被記錄和輸出，可以用來(lái)直接計(jì)算相對(duì)定量比。
[0005]在定量標(biāo)記方面，公布號(hào)為CN105137088A的中國(guó)專(zhuān)利公布了一種整體蛋白質(zhì)定量分析方法ο公布號(hào)為CN105242050A的中國(guó)專(zhuān)利公布了一種不同生理或病理?xiàng)l件下整體蛋白質(zhì)的定量分析方法，該專(zhuān)利對(duì)N端氨基進(jìn)行同重標(biāo)記，分別標(biāo)記為-N(CH2D)2和-N(13CH3)2t5上述兩份專(zhuān)利均是基于重同位素的定量標(biāo)記方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的就是為了提供一種標(biāo)記效率高且標(biāo)記蛋白電離效率高的整體蛋白質(zhì)定量方法，本發(fā)明的方法可以實(shí)現(xiàn)相對(duì)或絕對(duì)標(biāo)記定量；同時(shí)保證了分析的靈敏度和效率。
[0007]本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
[0008]—種基于自帶電荷同位素試劑的生物分子標(biāo)記和定量分析方法，包括以下步驟:
[0009](I)將兩組不同生理或病理?xiàng)l件的整體蛋白分別作為控制組與疾病組，分別進(jìn)行賴(lài)氨酸ε_(tái)氨基及N端氨基全部同重標(biāo)記，分別標(biāo)記為-N(Cn13CHnN+OCH2)2和_N(C12Hn15N+OCH2)2，其單個(gè)標(biāo)記后氨基的質(zhì)量差異為12.6mDa ；
[0010](2)同重標(biāo)記后兩組蛋白按等比例混合進(jìn)行高分辨質(zhì)譜和串級(jí)質(zhì)譜分析得到一個(gè)數(shù)據(jù)組；
[0011](3)對(duì)數(shù)據(jù)組進(jìn)行定性、定量數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，得到蛋白質(zhì)的ID及疾病組每一個(gè)蛋白質(zhì)相對(duì)于控制組的相對(duì)比例，即疾病條件下所有蛋白的上調(diào)或下調(diào)情況，上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)最大的蛋白即為與該疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的蛋白。
[0012]優(yōu)選地，步驟(I)中，控制組蛋白或疾病組蛋白，一組蛋白質(zhì)用氰基硼氫化鈉和含13C的N(3_醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鑰鹽標(biāo)記，另一組蛋白質(zhì)用氰基硼氫化鈉和含15N的N(3-醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鑰鹽標(biāo)記。
[0013]N(3_醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鑰鹽為自帶電荷同位素試劑，合成方法可依照文獻(xiàn)【馬慧敏，等。合成化學(xué)，2014，22(2)，230-233】來(lái)進(jìn)行。
[0014]其中，含13C的N(3_醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鑰鹽的合成采用13C標(biāo)記多聚甲醛(如Cambridge Isotope Lab，99%，產(chǎn)品代碼CLM-229-1，$720.00/1G)，含 15N的N(3_醛基-4-輕基節(jié)基)氯化卩比啶鐵鹽的合成采用15N標(biāo)記的卩比啶(如Cambridge Isotope Lab，98% +，產(chǎn)品代碼NLM-305-0.5，$445.50/0.5G)。
[0015]優(yōu)選地，步驟(I)中進(jìn)行同重標(biāo)記的反應(yīng)過(guò)程和條件如下:蛋白溶解在乙酸鈉緩沖溶液后，加入新配制的含13C的N( 3-醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鑰鹽或含15N的N( 3-醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鑰鹽，在攪拌條件下加入600mM的新配制的氰基硼氫化鈉溶液，室溫反應(yīng)I小時(shí)后，用氨水淬滅。
[0016]優(yōu)選地，所述的乙酸鈉緩沖溶液為I OOmmo 1/L，pH為5-6。
[0017]優(yōu)選地，所述的含13C的N(3_醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鑰鹽或含15N的“3-醛基_4-羥基芐基)氯化吡啶鑰鹽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4% (w/w)。
[0018]優(yōu)選地，所述的氨水溶液體積分?jǐn)?shù)為4%(v/v)。
[0019]步驟(2)所述的等比例混合指:按照控制組與疾病組的重量、體積或摩爾量以1:1比例進(jìn)行混合。
[0020]步驟(3)中對(duì)數(shù)據(jù)組進(jìn)行定性、定量數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，得到蛋白質(zhì)的ID及疾病組每一個(gè)蛋白質(zhì)相對(duì)于控制組的相對(duì)比例為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，優(yōu)選使用【背景技術(shù)】中介紹的整體蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)搜索引擎?1"(^6；[116(^816，同時(shí)也可以使用其他數(shù)據(jù)解析工具。
[0021]本發(fā)明涉及的方法同樣適用于蛋白質(zhì)序列中賴(lài)氨酸ε-氨基及N端氨基其他基于自帶電荷的同位素標(biāo)記、同重標(biāo)記和全同重標(biāo)記；同樣適用于氨基酸其他特定官能團(tuán)的基于自帶電荷的同位素標(biāo)記、同重標(biāo)記和全同重標(biāo)記。除蛋白質(zhì)外，本發(fā)明涉及的方法同樣適用于(但不局限于)多肽、代謝產(chǎn)物等的標(biāo)記定量。
[0022]本發(fā)明的解析方法基于所述質(zhì)譜的原始二級(jí)質(zhì)譜，通過(guò)計(jì)算含標(biāo)記基團(tuán)碎片離子的平均相對(duì)強(qiáng)度從而計(jì)算標(biāo)記蛋白在不同生理或病理?xiàng)l件下的相對(duì)強(qiáng)度。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的定量方法對(duì)整體蛋白質(zhì)序列中賴(lài)氨酸ε_(tái)氨基及N端氨基的同重標(biāo)記和其高分辨串級(jí)質(zhì)譜標(biāo)記碎片離子同位素輪廓指紋比對(duì)原位數(shù)據(jù)解析，標(biāo)記效率高，準(zhǔn)確度高，便宜易得;而且自帶電荷，將大大增強(qiáng)帶標(biāo)記蛋白的電噴霧電離和質(zhì)譜分析靈敏度和效率。適用于整體蛋白質(zhì)基于高分辨串級(jí)質(zhì)譜分析的定量。
【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1:定量分析流程圖。
[0024]圖2:蛋白質(zhì)分子賴(lài)氨酸ε-氨基和N端氨基全同重二甲基標(biāo)記示意圖。
[0025]圖3:自帶電荷同位素試劑的合成。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0027]實(shí)施例
[0028]—種基于自帶電荷同位素試劑的生物分子標(biāo)記和定量分析方法，如圖1所示，包括以下步驟:
[0029](I)將兩組不同生理或病理?xiàng)l件的整體蛋白分別作為控制組與疾病組，分別進(jìn)行賴(lài)氨酸氨基及N端氨基全部同重標(biāo)記，一組蛋白質(zhì)用氰基硼氫化鈉和含13C的Ν(3_醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鑰鹽標(biāo)記，另一組蛋白質(zhì)用氰基硼氫化鈉和含15N的Ν(3-醛基-4-輕基芐基)氯化吡啶鑰鹽標(biāo)記，分別標(biāo)記為-N(C1113CHnN+OCH2) 2和_N(C12Hn15N+OCH2) 2 (如圖2所示)，其單個(gè)標(biāo)記后氨基的質(zhì)量差異為12.6mDa;反應(yīng)過(guò)程和條件如下:蛋白溶解在乙酸鈉緩沖溶液(10mM,pH 5-6)后，加入新配制的4% (w/w)的含13C的N(3-醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鑰鹽或含15N的N( 3-醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鑰鹽，在攪拌條件下加入600mM的新配制的氰基硼氫化鈉溶液，室溫反應(yīng)I小時(shí)后，用4% (v/v)的氨水淬滅。
[0030](2)同重標(biāo)記后兩組蛋白按等比例混合進(jìn)行高分辨質(zhì)譜和串級(jí)質(zhì)譜分析得到一個(gè)數(shù)據(jù)組，等比例混合指:按照控制組與疾病組的重量、體積或摩爾量以1:1比例進(jìn)行混合；
[0031](3)對(duì)數(shù)據(jù)組進(jìn)行定性、定量數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，得到蛋白質(zhì)的ID及疾病組每一個(gè)蛋白質(zhì)相對(duì)于控制組的相對(duì)比例，即疾病條件下所有蛋白的上調(diào)或下調(diào)情況，上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)最大的蛋白即為與該疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的蛋白。對(duì)數(shù)據(jù)組進(jìn)行定性、定量數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，得到蛋白質(zhì)的ID及疾病組每一個(gè)蛋白質(zhì)相對(duì)于控制組的相對(duì)比例為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，優(yōu)選使用【背景技術(shù)】中介紹的整體蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)搜索引擎ProteinGoggle，同時(shí)也可以使用其他數(shù)據(jù)解析工具。
[0032]N(3_醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鑰鹽為自帶電荷同位素試劑，合成方法可依照文獻(xiàn)【馬慧敏，等。合成化學(xué)，2014,22(2)，230-233】來(lái)進(jìn)行，步驟如圖3所示。其中，含13C的N(3-醛基-4-輕基節(jié)基)氯化卩比啶鐵鹽的合成采用13C標(biāo)記多聚甲醛(如Cambridge Isotope Lab，99%，產(chǎn)品代碼CLM-229-1 4720.00/1G)，含15N的N(3_醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鑰鹽的合成采用 15N標(biāo)記的吡啶(如Cambridge Isotope Lab，98% +，產(chǎn)品代碼NLM-305-0.5,$445.50/0.5G)o
[0033]以上方法基于所述質(zhì)譜的原始二級(jí)質(zhì)譜，通過(guò)計(jì)算含標(biāo)記基團(tuán)碎片離子的平均相對(duì)強(qiáng)度從而計(jì)算標(biāo)記蛋白在不同生理或病理?xiàng)l件下的相對(duì)強(qiáng)度。本發(fā)明的定量方法對(duì)整體蛋白質(zhì)序列中賴(lài)氨酸ε_(tái)氨基及N端氨基的同重標(biāo)記和其高分辨串級(jí)質(zhì)譜標(biāo)記碎片離子同位素輪廓指紋比對(duì)原位數(shù)據(jù)解析，標(biāo)記效率高，準(zhǔn)確度高，適用于整體蛋白質(zhì)基于高分辨串級(jí)質(zhì)譜的定量分析。
[0034]上述的對(duì)實(shí)施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對(duì)這些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說(shuō)明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過(guò)創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于自帶電荷同位素試劑的生物分子標(biāo)記和定量分析方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將兩組不同生理或病理?xiàng)l件的整體蛋白分別作為控制組與疾病組，分別進(jìn)行賴(lài)氨酸ε -氨基及N端氨基全部同重標(biāo)記，分別標(biāo)記為-N (Cn13CHnN+OCH2) 2和_N( C12Hn15N+OCH2) 2，其單個(gè)標(biāo)記后氨基的質(zhì)量差異為12.6mDa; (2)同重標(biāo)記后兩組蛋白按等比例混合進(jìn)行高分辨質(zhì)譜和串級(jí)質(zhì)譜分析得到一個(gè)數(shù)據(jù)組； (3)對(duì)數(shù)據(jù)組進(jìn)行定性、定量數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，得到蛋白質(zhì)的ID及疾病組每一個(gè)蛋白質(zhì)相對(duì)于控制組的相對(duì)比例，即疾病條件下所有蛋白的上調(diào)或下調(diào)情況，上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)最大的蛋白即為與該疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的蛋白。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于自帶電荷同位素試劑的生物分子標(biāo)記和定量分析方法，其特征在于，步驟(I)中，控制組蛋白或疾病組蛋白，一組蛋白質(zhì)用氰基硼氫化鈉和含13C的N(3-醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鑰鹽標(biāo)記，另一組蛋白質(zhì)用氰基硼氫化鈉和含15N的N(3-醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鑰鹽標(biāo)記。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于自帶電荷同位素試劑的生物分子標(biāo)記和定量分析方法，其特征在于，含13C的N(3-醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鑰鹽的合成采用13C標(biāo)記多聚甲醛，含15N的N(3-醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鑰鹽的合成采用15N標(biāo)記的吡啶。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于自帶電荷同位素試劑的生物分子標(biāo)記和定量分析方法，其特征在于，步驟(I)中進(jìn)行同重標(biāo)記的反應(yīng)過(guò)程和條件如下:蛋白溶解在乙酸鈉緩沖溶液后，加入含13C的N(3-醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鑰鹽或含15N的N(3-醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鑰鹽，在攪拌條件下加入氰基硼氫化鈉溶液，室溫反應(yīng)I小時(shí)后，用氨水淬滅。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基于自帶電荷同位素試劑的生物分子標(biāo)記和定量分析方法，其特征在于，所述的乙酸鈉緩沖溶液為lOOmmol/L，pH為5-6。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基于自帶電荷同位素試劑的生物分子標(biāo)記和定量分析方法，其特征在于，所述的含13C的N(3-醛基-4-羥基芐基)氯化吡啶鑰鹽或含15N的“3-醛基_4-羥基芐基)氯化吡啶鑰鹽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4% (w/w)。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基于自帶電荷同位素試劑的生物分子標(biāo)記和定量分析方法，其特征在于，所述的氨水溶液體積分?jǐn)?shù)為4% (v/v)。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于自帶電荷同位素試劑的生物分子標(biāo)記和定量分析方法，其特征在于，步驟(2)所述的等比例混合指:按照控制組與疾病組的重量、體積或摩爾量以1:1比例進(jìn)行混合。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK105866429SQ201610296568
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月6日
【發(fā)明人】田志新, 方后琴
【申請(qǐng)人】同濟(jì)大學(xué)