檢測二氯喹啉酸的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，具體涉及一種用于檢測二氯喹啉酸的酶聯(lián)免疫試 劑盒及其應(yīng)用，可定性、定量檢測土壤中二氯喹啉酸的殘留量。
【背景技術(shù)】
[0002] 二氯喹啉酸是由德國巴斯夫公司開發(fā)的新型喹啉酸類激素型除草劑，具有選擇性 強(qiáng)和持效期長的特點。二氯喹啉酸在一年生雜草和禾本科作物之間有明顯的選擇性，可用 于秧前和秧后的水稻田或直播水稻田的雜草防除，是我國稻田主要除草劑品種之一。由于 二氯喹啉酸顯酸性，在酸性土壤中降解緩慢，容易給后茬敏感作物造成嚴(yán)重危害，特別在水 稻與煙草輪作地區(qū)，可造成煙草生長畸形。伴隨二氯喹啉酸應(yīng)用量的逐年增長，應(yīng)用范圍的 逐年擴(kuò)大，由于不合理的使用而導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)生藥害的事件也常有發(fā)生。在實際應(yīng)用中，水 稻田施用二氯喹啉酸后，經(jīng)過半年的降解，二氯喹啉酸仍會有相當(dāng)累積。水稻田施用二氯喹 啉酸后的近300天內(nèi)，除水稻外，不能種植任何作物;兩年內(nèi)不能種植煙草、茄子、番茄、胡蘿 卜、芹菜等作物，不能用施過二氯喹啉酸的水灌上述作物。為了緩解因土壤殘留二氯喹啉酸 而致煙草畸形生長，減少由此而造成的經(jīng)濟(jì)損失，種植前檢測植煙土壤中二氯喹啉酸的含 量顯得尤為重要。
[0003] 目前常用的二氯喹啉酸檢測方法主要是儀器方法，如高效液相色譜法、液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法，采用這些分析方法需要昂貴的儀器和專門的技術(shù)人員，樣品前處理過程復(fù)雜 且花費高、費時長，難以滿足大量樣品和現(xiàn)場樣品快速檢測的需要。因此，開發(fā)一種不受檢 測設(shè)備限制并且能夠?qū)崿F(xiàn)對大批量樣品進(jìn)行快速檢測的產(chǎn)品和方法成為迫切需要解決的 問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的正是針對上述現(xiàn)有技術(shù)狀況而提供一種能夠檢測土壤中二氯喹啉 酸殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒，并提供一種高效、準(zhǔn)確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定 量檢測方法，應(yīng)用本發(fā)明的酶聯(lián)免疫法測定土壤中二氯喹啉酸的殘留量，具有檢測限低、特 異性強(qiáng)、操作簡便、檢測速度快、檢測成本低，易于推廣等優(yōu)點。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：本發(fā)明的試劑盒包括:包被有包被 原的酶標(biāo)板、二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液、二氯喹啉酸抗體、酶標(biāo)二抗、底物顯色液、終止液、洗 滌液、復(fù)溶液，所述包被原為二氯喹啉酸偶聯(lián)抗原，所述酶標(biāo)二抗為酶標(biāo)記的二氯喹啉酸抗 抗體，所述二氯喹啉酸偶聯(lián)抗原是由二氯喹啉酸半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述二氯喹 啉酸半抗原是由二氯喹啉酸與溴乙酰氯反應(yīng)得到，二氯喹啉酸半抗原分子結(jié)構(gòu)式為：
[0006] 所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清 蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白或纖維蛋白原。
[0007] 所述二氯喹啉酸抗體是以二氯喹啉酸偶聯(lián)抗原作為免疫原制備獲得，所述二氯喹 啉酸抗體為二氯喹啉酸單克隆抗體或二氯喹啉酸多克隆抗體，其中優(yōu)選二氯喹啉酸單克隆 抗體。
[0008] 所述酶標(biāo)二抗的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選辣 根過氧化物酶;酶標(biāo)二抗是由酶和二氯喹啉酸抗抗體偶聯(lián)得到的。
[0009] 當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時，所述底物顯色液由底物液A液和底物液B液組成，A 為過氧化氫或過氧化脲，B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，所述終止液為卜2 mol/L的硫酸 溶液或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶時，所述底物顯色液為對硝基磷酸 鹽緩沖液，所述終止液為1~2 mol/L氫氧化鈉溶液。
[0010] 所述二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0 yg/UO.5 yg/UU yg/LJA μ g/L，13.5 yg/L，40.5 yg/L〇
[0011] 所述洗滌液優(yōu)選為pH值為7.4，含有0.5%~1.0%吐溫-20、0.01%Q~0.03%。疊氮化鈉 防腐劑、〇. 1~0.3 mol/L的磷酸鹽緩沖液，其中的百分比為重量體積百分比，單位g/mL。
[0012] 所述復(fù)溶液優(yōu)選為?11值為7.0、0.02 111〇1/1的磷酸鹽緩沖液。
[0013]本發(fā)明中酶標(biāo)板的制備過程為：用包被緩沖液將包被原稀釋成20 yg/mL，每孔加 入100 yL，25°C避光孵育2 h或4°C過夜，傾去孔中液體，用洗滌液洗滌2次，每次30 s，拍干， 然后在每孔中加入150~200 yL封閉液，25 °C避光孵育卜2 h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用 鋁膜真空密封保存。
[0014] 其中，在酶標(biāo)板制備過程中所用到的包被緩沖液為pH值為9.6,0.05 mol/L的碳酸 鹽緩沖液，封閉液為pH值為7.1~7.5，含有1%~3% (g/mL)酪蛋白、0.1~0.3 m〇VL的磷酸鹽緩 沖液。
[0015] 本發(fā)明的檢測原理為： 本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被二氯喹啉酸偶聯(lián)抗原，加 入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入二氯喹啉酸單克隆抗體溶液，樣本中殘留的二氯喹啉 酸和酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭二氯喹啉酸單克隆抗體，加入酶標(biāo)二抗進(jìn)行放 大作用，用顯色液顯色，樣本吸光度值與其所含殘留物二氯喹啉酸的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn) 曲線比較，再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣本中二氯喹啉酸的殘留量。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測二氯喹啉酸的方法，它包括步 驟： (1) 樣品前處理； (2) 用試劑盒進(jìn)行檢測； (3) 分析檢測結(jié)果。
[0017] 本發(fā)明檢測二氯喹啉酸的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競爭ELISA方法定性或定 量檢測樣品中二氯喹啉酸殘留量;對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快 速檢測大批量樣品；主要試劑以工作液的形式提供，檢驗方法方便易行，具有檢測限低、特 異性高、操作簡便、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)構(gòu) 簡單、使用方便、價格便宜、攜帶便利、檢測方法高效、準(zhǔn)確、簡便、適于大批量樣品篩選的定 性、定量檢測。
【附圖說明】
[0018] 圖1:二氯喹啉酸半抗原合成路線圖。
[0019] 圖2:試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合具體的實施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本 發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0021] 實施例1試劑盒組分的制備 1、二氯喹啉酸半抗原的制備 取0.43 g溴乙酰氯，加10 mL氯仿溶解，加30.28 g A1C13攪拌，室溫反應(yīng)2 h，滴加含有 1.0 g二氯喹啉酸的吡啶溶液20 mL，50 °C反應(yīng)4 h。停止反應(yīng)，旋蒸，除去有機(jī)溶劑，加水溶 解，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH=5，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，濃縮，得到紅色油狀物，上硅膠柱， 石油醚/乙酸乙酯(v/V，1/1)，洗脫分離，得到溴乙?；揉岚肟乖a(chǎn)物1.38 g，收率 92%〇
[0022] 取上述半抗原經(jīng)核磁共振氫譜鑒定，1H M1R(CDC13,300 ΜΗΖ)δ:4.353 (2,2H)， 8.330 (7，lH，d，J=3.832)，8.812 (9，lH，dd，J=3.832，J=1.700)，8.703 (15，lH，d，J= 1.700)化學(xué)位移δ=4.35的為間隔臂上亞甲基的氫的共振吸收峰，除原料本身氫的特征吸收 峰外，該吸收峰的存在證明間隔臂偶聯(lián)成功。
[0023] 2、抗原的制備 免疫原制備--二氯喹啉酸半抗原與牛血清白蛋白（BSA)(也可選用其它蛋白如人血 清蛋白、鼠血清蛋白）偶聯(lián)得到免疫原。
[0024] 取22 mg半抗原，溶解于0.8 mL Ν，Ν-二甲基甲酰胺(DMF)中，攪拌，溶解澄清，得到 反應(yīng)液Α;稱取BSA 30 mg，使之充分溶解在4 mL 0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(CB，pH 9.6) 中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24 h，用0.01 mol/L磷酸鹽緩 沖液(PBS)4 °C透析3 d，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，得到免疫原。 [0025] 包被原制備一一二氯喹啉酸半抗原與卵清蛋白（0VA)(也可選用其它蛋白如血藍(lán)蛋 白、纖維蛋白）偶聯(lián)得到包被原。
[0026] 取18 mg半抗原，溶解于1 mL DMF中，溶解澄清，得到反應(yīng)液A;稱取0VA 30 mg，使 之充分溶解在6 11^0.1111〇1/108(?!19.6)中，將反應(yīng)液4逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并 于室溫下攪拌24 h，用0.01 mol/L PBS 4 °C透析3 d，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的 小分子物質(zhì)，得到包被原。
[0027] 3、二氯喹啉酸單克隆抗體的制備 動物免疫:將上述步驟得到的免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150 yg/只， 使其產(chǎn)生抗血清。
[0028] 細(xì)胞融合和克隆化：小鼠血清測定結(jié)果較高后，取其脾細(xì)胞，按8:1(數(shù)量配比）比 例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液