專利名稱：：人卵巢癌腫瘤標(biāo)志物he4酶聯(lián)免疫診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程及疾病檢測(cè)診斷試劑方法
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是HE4基因合成、載體構(gòu)建、蛋白表達(dá)及純化，HE4用于ELISA試劑盒及其制法。
背景技術(shù)：
：卵巢癌發(fā)病隱匿，預(yù)后差，是女性最致命的惡性腫瘤之一。如果能在早期診斷卵巢癌將大大提高治愈率，但是卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已經(jīng)到了晚期。目前診斷卵巢癌和監(jiān)測(cè)其復(fù)發(fā)最為敏感的指標(biāo)是檢測(cè)血清CA125。晚期卵巢癌患者中有80。/。能檢測(cè)到CA125的升高，而在早期僅有50~60%，并且CA125在某些良性疾病中也會(huì)上升，導(dǎo)致一些不必要的手術(shù)，大大限制了它的臨床應(yīng)用。于是，許多學(xué)者都致力于尋找更為有效的腫瘤標(biāo)記物，以便早日確診卵巢癌。人附睪分泌蛋白4(humanepididymisprotein4,HE4)最早在人的附睪上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。1999年，Schummer等發(fā)現(xiàn)HE4的mRNA在卵巢癌組織中高表達(dá)，而在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)。2003年，Hellstrom等發(fā)現(xiàn)HE4在卵巢癌患者的血清中的含量也比正常人有明顯增高。因而，HE4作為一個(gè)新的卵巢癌的腫瘤標(biāo)志物，得到了人們更加深入的研究。Hellstrom等人證實(shí)，在特異性為100%的情況下，HE4檢測(cè)卵巢癌的靈敏度為60%，而經(jīng)典卵巢癌腫瘤標(biāo)記物CA125的靈敏度僅為13%，而且HE4檢測(cè)早期卵巢癌的敏感性也明顯優(yōu)于CA125。為進(jìn)一步證實(shí)和擴(kuò)展HE4在卵巢癌的早期檢測(cè)和病程監(jiān)控方面的應(yīng)用前景，在美國(guó)已有近十項(xiàng)臨床研究和臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種HE4基因合成方法、蛋白表達(dá)，合成簡(jiǎn)單，產(chǎn)品純度高，另外還提供人卵巢癌腫瘤標(biāo)記物HE4的ELISA試劑盒制備方法，為卵巢癌早期診斷、療效觀察及預(yù)后判斷提供一種簡(jiǎn)便快捷、經(jīng)濟(jì)可靠的檢測(cè)方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是HE4基因合成根據(jù)Genbank中公布的人HE4的基因序列并結(jié)合大腸桿菌偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)并合成八條PCR引物，通過(guò)重疊PCR方法獲得HE4基因。所述HE4蛋白表達(dá)將合成獲得的HE4基因克隆入pGEX-4Tl載體中，在大腸桿菌中表達(dá)并純化出重組GST-HE4蛋白。經(jīng)凝血酶切割并純化得到HE4蛋白純品。所述試劑盒的制法純化HE4蛋白免疫新西蘭兔，制備并純化多克隆抗體，用純化HE4蛋白免疫小鼠，通過(guò)細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞株，以此雜交瘤細(xì)胞免疫小鼠，制備腹水，腹水中抗體經(jīng)純化后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，以多克隆抗體作為捕獲抗體，以酶標(biāo)記單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，建立檢測(cè)人HE4雙抗體夾心ELISA的試劑盒。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)HE4檢測(cè)試劑盒生產(chǎn)，本發(fā)明所研制的試劑盒可望替代進(jìn)口同類產(chǎn)品，為國(guó)家節(jié)省大量外匯，可使我國(guó)卵巢癌的診斷檢測(cè)技術(shù)達(dá)到世界先進(jìn)水平。本試劑盒具有高度穩(wěn)定性、敏感性及特異性，操作簡(jiǎn)單、快速，適合于卵巢癌的早期、快速診斷。較國(guó)外同類產(chǎn)品相比成本便宜，性價(jià)比高。圖1是本試劑盒的制備工藝流程圖。圖2是經(jīng)重疊PCR獲得的HE4基因DNA片段及重組載體pGEX-4Tl-HE4的雙酶切鑒定結(jié)果圖。其中，1:HE4基因的PCR結(jié)果；2:MarkerDL2000;3:MarkerDL2000;4:pGEX-4Tl-HE4雙酶切結(jié)果。圖3是GST-HE4融合蛋白IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE電泳(12%)，酶切后HE4蛋白的純化結(jié)果及免疫印跡鑒定結(jié)果圖。其中，1:pGEX-4Tl空載體誘導(dǎo)結(jié)果；2:pGEX-4Tl-HE4未誘導(dǎo)對(duì)照；3:pGEX-4Tl-HE4誘導(dǎo)結(jié)果；4:蛋白Marker;5:蛋白Marker;6:GST-HE4融合蛋白酶切去除GST后的純化結(jié)果；7:蛋白Marker;8:酶切并純化后HE4蛋白的免疫印跡結(jié)果。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。實(shí)施例l:HE4基因的構(gòu)建、蛋白表達(dá)、純化及鑒定1.HE4基因的擴(kuò)增根據(jù)Genbank中所提供的人HE4mRNA序列(NM一006103)，去除N末端30個(gè)信號(hào)肽，根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，設(shè)計(jì)合成了8個(gè)引物，分別命名為P1P8，引物由大連寶生物公司合成。P1P8核苷酸序列組成Pl:tggttgtgctactttttgttctttacctaatgataaagaaggttcttgtcP2:ctaattgaggaaaattaatattaacttgaggacaagaaccttctttatcaP3:tctgaatgtgctgataatttaaaatgttgttctgctggttgtgctactttP4:ttgagaatcaacttgacattgatcacgacataaacctaattgaggaaaatP5:ctgatcaaaattgtactcaagaatgtgtttctgattctgaatgtgctgatP6:caaccattacgacaacatttcatttgaccaggacattgagaatcaacttgP7:cgggatccgaaaaaactggtgtttgtcctgaattacaagctgatcaaaattgtaP8:ccgctcgagttattaaaaattaggagtaacacaagaaactttaccacaaccattacgacaa在P7和P8引物的5'端分別引入BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)，重疊PCR方法全人工合成HE4基因。第一輪反應(yīng)將P1和P2配對(duì)，生成產(chǎn)物P12，第二輪PCR以P12作為模板，P3和P4作為引物生成產(chǎn)物P34，第三輪PCR以P34作為模板，P5和P6作為引物生成產(chǎn)物P56，第四輪PCR以P56作為模板，P7和P8作為引物生成HE4基因。PCR反應(yīng)按常規(guī)方法進(jìn)行，瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。結(jié)果應(yīng)用重疊PCR拼接方法，成功獲得了HE4基因，片段長(zhǎng)度與預(yù)期一致。HE4基因核苷酸序列1gaaaaaactggtgtttgtcctgaattacaagctgatcaaaattgtactcaagaatgtgtt61tctgattctgaatgtgctgataatttaaaatgttgttctgctggttgtgctactttttgt121ctttacctaatgataaagaaggttcttgtcctcaagttaatattaattttcctcaatta181gtttatgtcgtgatca^tgtcaagttgattctcaatgtcctggtcaaatgaaatgttgt241cgtaatggttgtggtaaagtttcttgtgttactcctaatttt2822.pGEX-4Tl-HE4表達(dá)載體的構(gòu)建載體pGEX-4Tl以及經(jīng)瓊脂糖凝膠純化后的HE4基因片段，用BamHI和Xhol雙酶切處理，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠純化后連接，得到重組質(zhì)粒pGEX-4Tl-HE4，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，同時(shí)由大連寶生物公司測(cè)序。將重組質(zhì)粒pGEX-4Tl-HE4轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到pGEX-4Tl-HE4的重組克隆菌落。結(jié)果，成功獲得了重組質(zhì)粒pGEX-4Tl-HE4，酶切鑒定結(jié)果如圖2所示。重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)分析，表明重組的HE4片段與設(shè)計(jì)序列完全一致。3.GST-HE4融合蛋白的表達(dá)pGEX-4Tl-HE4的重組克隆菌落在含100pg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，A綱達(dá)到0.5左右時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)，IPTG終濃度為0.5mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為3h，誘導(dǎo)溫度為37'C，收集菌體后取少量樣品經(jīng)12%SDS-PAGE電泳觀察。結(jié)果，pGEX-4Tl-HE4的重組克隆菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)12%SDS-PAGE電泳確定，表達(dá)的融合蛋白分子量約為37kD(圖3)。將該融合蛋白命名為GST-HE4。4.GST-HE4融合蛋白表達(dá)形式的分析誘導(dǎo)后的細(xì)菌4n，8000rpm離心10min，收集菌體，PBS洗滌一次，8000rpm離心10min，濕菌用PBS重懸，置于冰浴中，超聲破菌，12000rpm離心20min，上清和沉淀分別進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳。結(jié)果，12%SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，GST-HE4融合蛋白為胞漿可溶性表達(dá)。5.GST-HE4融合蛋白的純化和定量收集誘導(dǎo)后的細(xì)菌，PBS洗滌一次，濕菌沉淀用PBS重懸，置于冰浴中，超聲破碎，12000rpm離心20min，上清為待純化的蛋白樣品。將GST-SepharoseTM填料裝于純化柱中，將純化柱與Akta純化儀連接，用PBS緩沖液(按照說(shuō)明書(shū)提供的方法配制)平衡5個(gè)柱體積，待純化的蛋白樣品以1.5ml/min速度上樣，上樣后用平衡緩沖液洗至基線，用蛋白洗脫緩沖液洗脫，收集蛋白峰，洗脫液在PBS中4'C透析過(guò)夜，取小樣12%SDS-PAGE電泳分析純化效果。透析后的純化蛋白用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。結(jié)果，GST-HE4融合蛋白經(jīng)GST親和純化后，SDS-PAGE電泳顯示，在分子量37kD左右有單一條帶，與預(yù)期值相符，凝膠薄層掃描顯示蛋白純度達(dá)90%以上，Bradford法測(cè)定蛋白濃度為2mg/ml。6.GST-HE4融合蛋白的酶切與純化按10U/mg的濃度向純化的GST-HE4融合蛋白中加入凝血酶，22。C酶切16h，經(jīng)GlutathioneSepharose4B瓊脂糖凝膠柱純化，收集流出液，流出液進(jìn)一步純化去除其中的凝血酶，得到高純度的HE4蛋白，取小量樣品用12%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分析。結(jié)果，酶切后得到高純度的HE4蛋白，分子量10kD左右(圖2)，Bradford法測(cè)定蛋白濃度為lmg/ml。7.酶切后HE4蛋白的免疫印跡鑒定參照《分子克隆》中所述方法進(jìn)行。電轉(zhuǎn)移條件為100V電泳lh，封閉液為含5%脫脂奶粉的TBST，一抗為商品化的鼠抗人HE4的單克隆抗體，二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，通過(guò)ECL顯色系統(tǒng)進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果，酶切后的HE4蛋白能與鼠抗人HE4的單克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)(圖3)。實(shí)施例2:兔抗人HE4多克隆抗體的制備1.動(dòng)物免疫取純化后的HE4蛋白500^(約500嗎)，與等量弗氏完全佐劑充分乳化，采用背部皮下多點(diǎn)免疫法免疫新西蘭大耳白兔，以后隔兩周免疫一次，蛋白免疫劑量為300嗎，佐劑為弗氏不完全佐劑，全程共免疫4次，末次免疫后七天兔耳緣靜脈采血。間接ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)后，頸動(dòng)脈放血，收集血清，-20。C凍存。2.兔抗人HE4多克隆抗體的純化及效價(jià)鑒定采用ProteinG親和層析純化兔血清，血清用結(jié)合緩沖液(20mM的磷酸鈉)按一定比例稀釋，上樣后用結(jié)合緩沖液洗5~10個(gè)柱體積，之后用洗脫緩沖液(O.lM的甘氨酸pH2.53.0)洗脫，收集洗脫峰，迅速向每毫升收集的洗脫液中加入100pl的1M的Tris-HCl(pH9.0)，以使抗體處于中性環(huán)境。收集的洗脫液在PBS中4"透析過(guò)夜。經(jīng)ProteinG純化的兔抗人HE4多克隆抗體再采用偶聯(lián)有HE4蛋白的溴化氰活化的瓊脂糖(CNBr-activedsepharose4B)柱純化，間接ELISA方法檢測(cè)純化前后抗體效價(jià)(包被抗原為純化的HE4蛋白)，紫外分光光度計(jì)測(cè)定抗體濃度，抗體經(jīng)0.22pm濾膜過(guò)濾除菌后，-70°(:保存。結(jié)果，間接ELISA檢測(cè)顯示，血清純化前效價(jià)為l:128萬(wàn)，純化后效價(jià)為h64萬(wàn)，表明獲得了高效價(jià)的兔抗人HE4多克隆抗體，抗體濃度為lmg/ml。實(shí)施例3:鼠抗人HE4單克隆抗體的制備1.動(dòng)物免疫取純化的HE4蛋白300(al(約300嗎)與等量弗氏完全佐劑充分乳化，背部皮下多點(diǎn)注射BALB/c小鼠，共免疫3只小鼠，每只小鼠免疫抗原劑量為100pg，兩周后每只小鼠以50ng抗原劑量加等量弗氏不完全佐劑充分乳化后背部皮下多點(diǎn)注射，以后隔兩周免疫一次，每只小鼠免疫劑量為50嗎，不用佐劑，免疫途徑為腹腔注射，從第二次免疫開(kāi)始，每次免疫后的第七天尾靜脈采集小鼠血，間接ELISA方法檢測(cè)血清效價(jià)(包被抗原為純化的HE4蛋白)，效價(jià)達(dá)到1:50000以上后準(zhǔn)備融合，融合前3天，尾靜脈注射加強(qiáng)免疫一次，抗原劑量50^g。2.雜交瘤細(xì)胞株的建立2.1細(xì)胞融合免疫小鼠經(jīng)眼球放血后，無(wú)菌摘取小鼠的脾臟，分離脾細(xì)胞，經(jīng)臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)，取約"108個(gè)脾細(xì)胞，約3xlO"個(gè)SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，將兩種細(xì)胞混合于50ml無(wú)菌離心管中，1200rpm離心5min，棄上清，輕彈管底，使沉淀細(xì)胞松散成均勻糊狀。于37"C水浴中，一手輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，另一手用滴管在1min內(nèi)勻速緩慢滴入1ml50%PEG4000，然后依次在1min內(nèi)勻速滴入1mlRPMI-1640無(wú)血清培養(yǎng)基，2min內(nèi)勻速滴入2mlRPMI-1640無(wú)血清培養(yǎng)基，5min內(nèi)勻速滴入10mlRPMI-1640無(wú)血清培養(yǎng)基。細(xì)胞懸液于800rpm離心8min，棄上清，用HAT選擇培養(yǎng)重懸浮并混勻。將細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100pl/孔，于37°C，含5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第10天換HT選擇培養(yǎng)基，第14天換含20%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。結(jié)果，細(xì)胞融合后第7天可見(jiàn)融合的細(xì)胞克隆，融合率達(dá)90%以上。2.2陽(yáng)性克隆的篩選與克隆化細(xì)胞融合后23周，當(dāng)雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)至孔底面積1/5以上時(shí)，用純化的HE4蛋白作為檢測(cè)抗原，通過(guò)間接ELISA方法進(jìn)行篩選，篩選出能與HE4蛋白反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞(以與陰性血清A450的比值大于2.1判為陽(yáng)性)，用有限稀釋法連續(xù)亞克隆3次(第1次亞克隆用HT選擇培養(yǎng)液，第2和第3次改用普通RPMI-1640完全培養(yǎng)基)，每次亞克隆后7-10天進(jìn)行篩選，直至單克隆細(xì)胞陽(yáng)性孔率為100%時(shí)，挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后液氮凍存。結(jié)果，共獲得3株能穩(wěn)定分泌抗人HE4蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為Hl、B6禾卩F4。2.3單抗亞型的鑒定應(yīng)用小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒(購(gòu)自Hycultbiotechnology公司)鑒定單抗亞型，按操作說(shuō)明將三株雜交瘤上清分別用PBS(pH7.4)適當(dāng)稀釋，至抗體濃度1-50pg/ml，加500^試劑盒中提供的稀釋液至含一條k型試紙條的檢測(cè)管中，再加500pl稀釋好的待檢樣品至檢測(cè)管中，將試紙條完全浸入并輕輕攪動(dòng)，再向檢測(cè)管中加入lml試劑盒中提供的RAM-kappa，使試紙條打印面朝下，室溫振蕩30min左右，觀察結(jié)果。結(jié)果，三株雜交瘤上清的單抗亞型均鑒定為IgGl類，輕鏈亞型均為k鏈。3.腹水制備與純化弗氏不完全佐劑致敏BALB/c小鼠，500pl/只。致敏一周后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞懸液(選擇H1雜交瘤細(xì)胞株，細(xì)胞數(shù)5xl06~lxl07)，710天后采集小鼠腹水，12000rpm,離心5min收集上清。二氧化硅吸附法對(duì)腹水進(jìn)行預(yù)處理，采用辛酸-飽和硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化將預(yù)處理過(guò)的腹水與醋酸緩沖液(0.06mol/L,pH5.0)按體積比1:2混合，用1mol/L的HC1調(diào)pH至4.8;按每毫升混合液加11^辛酸的比例，室溫?cái)嚢柘轮鸬渭尤胄了幔?0min內(nèi)加完，4°C靜置2h，12000rpm離心30min，上清經(jīng)125pm尼龍篩過(guò)濾后加入1/10體積的PBS，用1mol/L的NaOH調(diào)pH至7.2;在4匸下加入飽和硫酸銨，靜置1h;12000rpm離心30min，棄上清，沉淀溶于適量PBS(含137mmol/LNaCl，2.6mol/LKCl，0.2mmol/LEDTA)中，用100倍以上體積的PBS，4"C透析過(guò)夜，最后12000rpm離心30min，收集上清，紫外分光光度計(jì)測(cè)定純化后單克隆抗體含量，0.22pl濾膜過(guò)濾后于-70。C保存。結(jié)果，紫外分光光度計(jì)測(cè)定抗體濃度為15mg/ml。4.純化后鼠抗人HE4單克隆抗體的間接ELISA鑒定以純化的HE4蛋白作為檢測(cè)抗原，將純化后的小鼠腹水倍比稀釋，以1:200稀釋的正常小鼠血清作為陰性對(duì)照，應(yīng)用間接ELISA方法檢測(cè)，以與陰性血清的比值大于2.1判段為陽(yáng)性，計(jì)算單抗效價(jià)。結(jié)果，純化的小鼠腹水的效價(jià)達(dá)到1:256000。5.辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記純化的單克隆抗體用過(guò)碘酸鹽氧化法獲得酶標(biāo)二抗溶解5mg辣根過(guò)氧化物酶于1.2ml超純水中，加入新配制的0.1mol/L的過(guò)碘酸鈉0.3ml,室溫靜置20min，將上述溶液在1mmol/L的醋酸鈉中4。C透析24h，期間每4h更換透析液。用0.02mol/L的碳酸鈉溶液制備單抗樣品至10mg/ml，將0.5ml制備好的抗體溶液加入經(jīng)透析的辣根過(guò)氧化物酶溶液中，室溫靜置2h，在混合液中加入100pl硼氫化鈉(4mg/ml的水溶液)，4'C反應(yīng)2h，向混合液中加入等體積的飽和硫酸銨，4°。反應(yīng)30min后12000rpm離心15min，棄上清，沉淀溶于1ml的PBS中，在PBS中透析過(guò)夜，次日12000rpm離心15min后取上清加入等體積的甘油，分裝后-70'C保存。取少量酶標(biāo)二抗，用純化的HE4作為包被抗原，間接ELISA方法檢測(cè)。結(jié)果，經(jīng)間接ELISA方法檢測(cè)酶標(biāo)單抗可在1:10000稀釋下獲得良好的檢測(cè)效果。實(shí)施例4:人卵巢癌腫瘤標(biāo)志物HE4雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立1.檢測(cè)方法在本實(shí)施例中，應(yīng)用實(shí)施例2中獲得的兔抗人HE4多克隆抗體為捕獲抗體，以實(shí)施例3中獲得的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人HE4單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，建立檢測(cè)卵巢癌腫瘤標(biāo)志物HE4的多抗和單抗雙抗體夾心ELISA方法。2.酶標(biāo)板包被用包被液(0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，pH9.6)將兔抗人HE4多克隆抗體稀釋成10pg/ml，混勻，96孔酶標(biāo)板中每孔加入100pl稀釋好的多抗溶液，將酶標(biāo)板密封于4t:過(guò)夜。3.酶標(biāo)板封閉用含有3%魚(yú)明膠和5%蔗糖的PBS作為封閉液。將包被過(guò)夜的酶標(biāo)板拍干，每孔加入200pl封閉液，37'C封閉lh，用洗板液(TBST)洗板3次后將酶標(biāo)板拍干。酶標(biāo)板干燥后密封入裝有干燥劑的金屬箔袋內(nèi)，4"C保存。4.被檢血清的處理被檢血清用樣品稀釋液(含1%BSA和0.05%吐溫-20的PBS)做適當(dāng)比例的稀釋。100^1/孔，37"C反應(yīng)lh后用洗板液洗板3次后將酶標(biāo)板拍干。5.酶標(biāo)二抗的處理酶標(biāo)二抗保存于含50%甘油的PBS中，用pH7.2的PBS做1:10000稀釋后使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。100pl/L，37'C反應(yīng)30min后用洗板液洗板3次后將酶標(biāo)板拍干。6.顯色和終止用TMB顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯色。顯色液配制A液(0.05mol/L的檸檬酸，0.1mol/L的磷酸氫二鈉)6ml+B液(含2mg/mlTMB的無(wú)水乙醇中)0.3ml+C液(0.75%H202)20^1，現(xiàn)用現(xiàn)配，50(!l/孔，37"C避光反應(yīng)15min，之后加入2M的硫酸，50pl/孔。7.檢測(cè)結(jié)果本實(shí)驗(yàn)結(jié)果以ELISA實(shí)驗(yàn)的A45o值表示。8.對(duì)照陰性對(duì)照孔的檢測(cè)樣品為不加血清的樣品稀釋液，純化好的HE4蛋白作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。實(shí)施例5:人卵巢癌腫瘤標(biāo)志物HE4雙抗體夾心ELISA試劑盒的組成1.ELISA板已包被好純化的兔抗人HE4多克隆抗體并已進(jìn)行了封閉。2.待檢樣品稀釋液含l。/。BSA和0.05。/c)吐溫-20的PBS。3.酶標(biāo)二抗:辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人HE4單克隆抗體，保存于含50%甘油的PBS。4.酶標(biāo)二抗稀釋液pH7.2的PBS5.10x洗板液0.2mol/L的Tris-HCl，1.5mol/L的NaCl，0.5%的吐溫漏206.顯色液A液為0.05mol/L的檸檬酸和0.1mol/L的磷酸氫二鈉，B液為含2mg/mlTMB的無(wú)水乙醇，C液為0.75%H202。7.終止液2M的硫酸。8.陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品純化的HE4蛋白。實(shí)施例6:人卵巢癌腫瘤標(biāo)志物HE4雙抗體夾心ELISA試劑盒的實(shí)驗(yàn)性能1.試劑盒的檢測(cè)區(qū)間取包被好兔抗人HE4多克隆抗體并已進(jìn)行了封閉的酶標(biāo)板，每個(gè)樣品做三復(fù)孔，加入用樣品稀釋液梯度稀釋的HE4蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，100pl/L，37"C反應(yīng)1h，洗板液洗板3次，將酶標(biāo)板拍干，加入l:10000稀釋的酶標(biāo)二抗，100^1/孔，37"C反應(yīng)30min，洗板液洗板3次，將酶標(biāo)板拍干，加入顯色液50|il/L37°C避光反應(yīng)15min，之后加入2M的硫酸，50pl/孔。酶標(biāo)儀檢測(cè)A45Q，以不同濃度的HE4標(biāo)準(zhǔn)品蛋白為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的A^值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果，本試劑盒具有良好線性關(guān)系的檢測(cè)區(qū)間為15pM~900pM，如果被檢血清的HE4濃度高于次測(cè)量范圍，則應(yīng)使用樣品稀釋液稀釋樣品后再檢測(cè)。2.試劑盒的精密度采用4份人血清標(biāo)本進(jìn)行測(cè)試，每份標(biāo)本復(fù)孔檢測(cè)，在20天內(nèi)每天不同時(shí)間內(nèi)進(jìn)行2次檢測(cè)。本檢測(cè)試劑盒精密度的總CV值〈10n/。，此項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3.試劑盒的檢測(cè)限檢測(cè)限代表區(qū)別于零濃度的可檢測(cè)到的HE4抗原的最低濃度。采用不含HE4蛋白的樣品稀釋液和4份來(lái)源于健康人的血清，后者用樣品稀釋液稀釋至5pM，在兩個(gè)獨(dú)立日內(nèi)進(jìn)行4次檢測(cè)，每次重復(fù)24次檢測(cè)。結(jié)果，本試劑盒的檢測(cè)限〈5pM。4.試劑盒的回收率將己知濃度的HE4蛋白加入到正常人血清標(biāo)本中，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行稀釋，測(cè)定HE4的濃度。％回收率=測(cè)得的HE4濃度(pM)/(內(nèi)源性HE4濃度(pM)+加入的HE4濃度(pM))*100%。計(jì)算本試劑盒的回收率為(100±15)%，此項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>5.試劑盒的應(yīng)用實(shí)例使用本試劑盒共檢測(cè)了65例女性血清中HE4的含量，其中健康者20例,術(shù)前經(jīng)確診為卵巢癌患者45例。在本研究中，95。/。的健康女性個(gè)體的HE4檢測(cè)值位于或低于150pM，而卵巢癌患者血清中，HE4含量顯著升高，95.6%達(dá)到300pM以上，本檢測(cè)結(jié)果與臨床資料有很高程度的一致性，與國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道相符。SEQUENCELISTING<110>大連美億德生物科技有限公司<120>人卵巢癌腫瘤標(biāo)志物HE4酶聯(lián)免疫診斷試劑盒<130>AnovelmultiplemarkerbioassayutilizingHE4andCA125forthepredictionofovariancancerinpatientswithapelvicmass<160>10<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>50<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)密碼子人工合成HE4引物PI<400>1tggttgtgctac臓gttctttacctaatgataaagaaggttcttgtc50<210>2<211>50<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)密碼子人工合成HE4引物P2<400>2ctaattgaggaaaattaatattaacttgaggacaagaaccttctttatca50<210>3<211>50<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)密碼子人工合成HE4引物P3<400>3tctgaatgtgctgataatttaaaatgttgttctgctggttgtgctacttt<210>4<211>50<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)密碼子人工合成HE4引物P4<400>4ttgagaatcaacttgacattgatcacgacataaacctaattgaggaaaat<210>5<211>50<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)密碼子人工合成HE4引物P5<400>5ctgatcaaaattgtactcaagaatgtgtttctgattctgaatgtgctgat<210>6<211>50<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)密碼子人工合成HE4引物P6<400>6caaccattacgacaacatttcatttgaccaggacattgagaatcaacttg<210>7<211>54<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)密碼子人工合成HE4引物P7<400>7cgggatccgaaaaaactggtgtttgtcctgaattacaagctgatcaaaattgta54<210>8<211>61<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)密碼子人工合成HE4引物P8<400>8ccgctcgagttattaaaaattaggagtaacacaagaaactttaccacaaccattacgaca60361<210>9<211>282<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)密碼子人工合成引物后，采用重疊PCR法拼接的HE4基因序列<400>9gaaaaaactggtgtttgtcctgaattacaagctgatcaaaattgtactcaagaatgtgtt60tctgattctgaatgtgctgataatttaaaatgttgttctgctggttgtgctactttttgt120tctttacctaatgataaagaaggttcttgtcctcaagttaatattaattttcctcaatta180ggtttatgtcgtgatcaatgtcaagttgattctcaatgtcctggtcaaatgaaatgttgt240cgtaatggttgtggtaaagtttcttgtgttactcctaatttt282<210>10<211>94<212>PRT<213>human<300><301>Hellstrom，I.，Raycraft,J.，Hayden-Ledbetter，M.，Ledbetter,J.A.,Schummer,M,McIntosh,M.，Drescher，C.,Urban，N.andHellstrom,K.E.<302>TheHE4(WFDC2)proteinisabiomarkerforovariancarcinoma<303>CancerRes.63(13),3695-3700(2003)<304>63<305>13<306>3695-3700<307>2003-07-01<308>AA052683<309>2005-04-14<313>(31)..(124)<400>10GluLysThrGlyValCysProGluLeuGinAlaAspGinAsnCysThr151015GinGluCysValSerAspSerGluCysAlaAspAsnLeuLysCysCys202530SerAlaGlyCysAlaThrPheCysSerLeuProAsnAspLysGluGly354045SerCysProGinValAsnlieAsnPheProGinLeuGlyLeuCysArg505560AspGinCysGinValAspSerGinCysProGlyGinMetLysCysCys65707580ArgAsnGlyCysGlyLysValSerCysValThrProAsnPhe8590權(quán)利要求1、一組HE4基因合成引物，其特征是根據(jù)GenBank中人HE4基因序列并結(jié)合大腸桿菌偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)并合成PCR引物，PCR引物核苷酸序列組成P1tggttgtgctactttttgttctttacctaatgataaagaaggttcttgtcP2ctaattgaggaaaattaatattaacttgaggacaagaaccttctttatcaP3tctgaatgtgctgataatttaaaatgttgttctgctggttgtgctactttP4ttgagaatcaacttgacattgatcacgacataaacctaattgaggaaaatP5ctgatcaaaattgtactcaagaatgtgtttctgattctgaatgtgctgatP6caaccattacgacaacatttcatttgaccaggacattgagaatcaacttgP7cgggatccgaaaaaactggtgtttgtcctgaattacaagctgatcaaaattgtaP8ccgctcgagttattaaaaattaggagtaacacaagaaactttaccacaaccattacgacaa。2、人工合成的HE4基因，其特征是根據(jù)權(quán)利要求1設(shè)計(jì)的引物，通過(guò)重疊PCR方法獲得HE4基因，基因序列如下1gaaaaaactggtgtttgtcctgaattacaagctgatcaaaattgtactcaagaatgtgtt61tctgattctgaatgtgctgataatttaaaatgttgttctgctggttgtgctactttttgt121tctttacctaatgataaagaaggttcttgtcctcaagttaatattaattttcctcaatta181ggtttatgtcgtgatcaatgtcaag11ga11ctcaatgtcctggtcaaatgaaatg11gt241cgtaatggttgtggtaaagtttcttgtgttactcctaatttt282。3、HE4蛋白表達(dá)，其特征是根據(jù)權(quán)利要求2所述基因，將合成獲得的HE4基因通過(guò)BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)克隆入pGEX-4Tl載體中，在大腸桿菌中表達(dá)并純化出重組GST-HE4蛋白。經(jīng)凝血酶切割并純化得到HE4蛋白純品，其氨基酸序列組成EKTGVCPELQADQNCTQECVSDSECADNLKCCSAGCATFCSLPNDKEGSCPQVNINFP()LGLCRDQCQVDSQCPGQMKCCRNGCGKVSCVTPNF。4、HE4ELISA檢測(cè)試劑盒，其制備方法是用含權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)HE4免疫動(dòng)物獲得多克隆抗體和單克隆抗體，以此多克隆抗體作為捕獲抗體，以單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，裝配成雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)試劑盒。5、權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征是它可用于人卵巢癌的輔助診斷。特別是對(duì)卵巢癌患者的早期輔助診斷。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種人卵巢癌腫瘤標(biāo)志物HE4酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，其制備方法及用途。通過(guò)合成的HE4基因引物，采用重疊PCR方法全人工合成HE4基因；將該基因構(gòu)建到pGEX-4T1表達(dá)載體中并進(jìn)行蛋白表達(dá)；表達(dá)的HE4融合蛋白經(jīng)酶切純化后得到HE4純品，并以此免疫動(dòng)物，獲得多克隆抗體及單克隆抗體；用兔抗人HE4多克隆抗體包被ELISA板并進(jìn)行封閉，以此兔多克隆抗體為捕獲抗體，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人HE4單克隆抗體為檢測(cè)抗體，裝配成檢測(cè)HE4的雙抗體夾心ELISA試劑盒。本試劑盒特點(diǎn)在于檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)，適于卵巢癌的早期診斷，為卵巢癌病人療效觀察及預(yù)后判斷提供一種簡(jiǎn)便快捷、經(jīng)濟(jì)可靠的檢測(cè)方法。文檔編號(hào)C12N15/11GK101525614SQ200910011148公開(kāi)日2009年9月9日申請(qǐng)日期2009年4月13日優(yōu)先權(quán)日2009年4月13日發(fā)明者吳芬芳,李慶偉,王克威,王華穎,陳立勇申請(qǐng)人:大連美億德生物科技有限公司