本發(fā)明涉及納米材料技術(shù)、光電化學信號檢測技術(shù)及免疫分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說是一種用于靈敏檢測癌胚抗原的光電化學免疫傳感器的制備及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
作為一種非常重要的腫瘤標志物，癌胚抗原在癌癥的臨床診斷和治療中扮演著重要的角色。近年來，各種各樣的分析方法被發(fā)展用于癌胚抗原的檢測，像熒光、電化學、電化學發(fā)光、比色等分析方法。盡管這些方法可以實現(xiàn)癌胚抗原的檢測，它們存在操作復雜、靈敏度低、費時、成本高等缺點。光電化學分析方法作為一種新興的分析方法，由于其靈敏度高、操作簡單、成本低等優(yōu)點引起了廣泛的關(guān)注！光電活性材料是光電化學分析方法中的重要組成部分，常用的敏化結(jié)構(gòu)通常是以寬帶隙的半導體材料為基礎(chǔ)敏化不同的窄帶隙的半導體材料。降低敏化結(jié)構(gòu)電子-空穴對的復合速率，增強其對可見光的吸收范圍是提高光電化學分析性能的關(guān)鍵。
在傳統(tǒng)的免疫傳感器中常用的識別元素是抗體，其通常是由細胞株或動物產(chǎn)生，獲取過程復雜且成本高，另外其穩(wěn)定性較差，易受高溫、酸堿條件的影響，這些固有的缺陷極大地限制了其廣泛的應(yīng)用。因此急需尋求新型有效的分子識別元素。另外，癌胚抗原在人類血清的含量較低，發(fā)展有效的信號放大方式，提高其分析檢測的靈敏度，對于臨床癌癥的分析診斷具有重要的意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是在摻雜氟的二氧化錫透明導電玻璃上生長三維分層結(jié)構(gòu)的氧化鋅納米棒-納米片，在其表面負載大量的錳摻雜的硫化鎘量子點，其中摻雜氟的二氧化錫透明導電玻璃簡寫為fto，分層結(jié)構(gòu)的氧化鋅納米棒-納米片簡寫znonrs-nss，錳摻雜的硫化鎘量子點簡寫為cds:mn，利用適配體作為癌胚抗原的識別元素，5′端標記有碲化鎘/硒化鎘核殼量子點的dna探針通過與修飾在電極表面的適配體雜交被捕獲到電極表面，其中碲化鎘/硒化鎘核殼量子點簡寫為cdte@cdse，形成znonrs-nss/cds:mn/cdte@cdse雙重敏化結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)最初的光電流信號放大；癌胚抗原通過特異性識別適配體，使5′端標記有cdte@cdse的dna探針解雜交而脫離電極表面，導致cdte@cdse敏化作用消失，降低光電流信號，另外癌胚抗原與適配體形成的生物復合物具有大的空間位阻效應(yīng)，進一步降低光電流信號，基于上述信號放大方式實現(xiàn)對癌胚抗原的靈敏檢測。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下措施來實現(xiàn)的：
（1）制備znonrs-nss/fto電極；
（2）合成cds:mn：將0.5-0.8mmol硝酸鎘和0.04-0.07mmol醋酸錳溶于50ml二次水中，在磁力攪拌下加熱到70℃后，加入10ml新配制的濃度為0.03-0.06m的硫化鈉溶液，繼續(xù)在70℃下加熱回流2-5h，將獲得的沉淀分別用乙醇和二次水各洗滌3次，然后將其溶于二次水中，收集黃色的上層清液獲得cds:mn；
（3）制備cdte@cdse；
（4）標記cdte@cdse在dna探針上，取1ml由步驟（3）中獲得的cdte@cdse和濃度為10mm的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽及濃度為20mm的n-羥基琥珀酰亞胺組成的混合液加入到1ml含有dna探針的ph7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，所用的dna探針濃度為10nmol，其5′端帶有氨基，在37℃下振蕩反應(yīng)2h后，靜置12h，利用微孔管除去未反應(yīng)的dna探針，最后將獲得的標記有cdte@cdse的dna探針重新分散在1mlph7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，其中磷酸鹽緩沖溶液簡寫為pbs，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽簡寫為edc，n-羥基琥珀酰亞胺簡寫為nhs，標記有cdte@cdse的dna探針簡寫為cdte@cdse-dna；
（5）光電化學免疫傳感器的構(gòu)建：將步驟（1）中獲得的znonrs-nss/fto電極浸泡在濃度為2%的3-氨丙基三乙氧基硅烷的溶液中，孵化1h，用ph7.4pbs洗滌后，在其表面滴涂20μl由步驟（2）中獲得的cds:mn和濃度為10mm的edc及濃度為20mm的nhs組成的混合液，在室溫下孵化2h后，用ph7.4pbs洗滌除去未反應(yīng)的試劑，將10μl濃度為5.0μm的與癌胚抗原特異性識別的適配體滴涂到電極表面，所用的適配體3′端帶有氨基，并在4℃下孵化12h，用ph7.4pbs洗滌除去多余的適配體后，繼續(xù)滴涂20μl1mm6-羥基-1-己硫醇用于封堵非特異性結(jié)合位點，在室溫下孵化1h后，用ph7.4pbs洗滌，然后將20μl步驟（4）中獲得的cdte@cdse-dna滴涂到電極表面并在37℃下孵化2h，用ph7.4pbs洗滌除去多余的cdte@cdse-dna后，滴涂10μl不同濃度的癌胚抗原，在37℃下孵化2h后用ph7.4pbs洗滌，完成光電化學免疫傳感器的構(gòu)建；
（6）光電流信號檢測：在由步驟（5）中獲得的znonrs-nss/fto電極、鉑對電極和ag/agcl參比電極組成的三電極體系中進行光電流信號檢測，所用的檢測方法為電流-時間曲線法，電壓為0.0v，激發(fā)波長范圍為200-2500nm，每隔10s切換一次激發(fā)光源開關(guān)，所用的檢測溶液為5ml含有0.01m過氧化氫的ph7.4pbs溶液，且在使用前檢測溶液要通氮氣除氧15min，隨著癌胚抗原濃度的增加，光電流信號逐漸減少，通過癌胚抗原濃度與光電流信號之間的關(guān)系可以實現(xiàn)對癌胚抗原的定量檢測。
本發(fā)明所述的制備znonrs-nss/fto電極的具體步驟為：
（1）電沉積法制備znonrs/fto電極：將fto依次用乙醇、丙酮、二次水超聲清洗10min后，在fto表面旋涂濃度為40mm的乙酸鋅種子溶液，轉(zhuǎn)速為1000r/min，時間為30s，然后將旋涂后的fto在120℃干燥10min，重復操作上述“旋涂-干燥”過程6次后，在由fto電極、ag/agcl參比電極和鉑對電極組成的三電極體系進行電沉積操作，沉積電位為0.0v，沉積電解液為由濃度為30-60mm的硝酸鋅、濃度為40-60mm的醋酸銨和濃度為50-80mm的乙二胺組成的混合液，沉積溫度為60-80℃，沉積時間為12h，沉積完成后用二次水和無水乙醇洗滌并在60℃干燥30min；
（2）水熱法制備znonrs-nss/fto電極：將上述獲得znonrs/fto電極插入含有10ml混合液的25ml高壓釜中，且使導電面向下放置，所述的混合液由濃度為8-12mm的硝酸鋅、濃度為8-12mm的六次甲基四胺和濃度為0.5-2mm的檸檬酸鈉組成，在60-70℃加熱6-9h，待冷卻到室溫后，用二次水洗滌并在350℃煅燒30min，最后獲得znonrs-nss/fto電極。
本發(fā)明所述的制備cdte@cdse的具體步驟為：
（1）制備cdte納米晶體：將0.3-0.6mmol硝酸鎘和0.1-0.3g脫水的檸檬酸鈉溶于50ml二次水中，然后加入50-55μl3-巰基丙酸，用濃度為1m的氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液ph至10.5后，加入0.1-0.2mmol亞碲酸鈉和45-60mg硼氫化鈉，在100℃下加熱回流1-3h，最后將反應(yīng)后的混合液用正丙醇離心洗滌多次，并將得到的沉淀在60℃下干燥30min獲得cdte納米晶體；
（2）制備cdte@cdse：首先制備硒氫化鈉溶液，將0.2-0.3mmol硒粉和0.8-1.2mmol硼氫化鈉溶于10ml除氧的二次水中，在磁力攪拌下，60℃油浴加熱50min，整個過程均在氮氣保護下進行；然后制備含有二價鎘離子的溶液，將0.2-0.5mmol硝酸鎘和30-35μl3-巰基丙酸溶于10ml除氧的二次水中，隨后用濃度為1m的氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液ph至10.5；最后制備cdte@cdse，將上述獲得cdte納米晶體溶于25ml除氧的二次水后，用濃度為1m的氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液ph至10.5，在氮氣的保護下，先緩慢地逐滴加入1-5ml含有二價鎘離子的溶液，再緩慢地逐滴加入1-5ml硒氫化鈉溶液，在70-90℃加熱反應(yīng)20-60min，將獲得的反應(yīng)混合液用正丙醇離心洗滌多次，最后將得到的沉淀在60℃下干燥30min并重新分散在25ml除氧的二次水中，備用。
本發(fā)明的有益效果：
（1）本發(fā)明制備的znonrs-nss/fto電極，具有良好的導電性、生物相容性和大的比表面積，可以極大地增加量子點和信號分子的負載量，進一步放大分析信號，從而提高檢測的靈敏度。
（2）利用cds:mn和cdte@cdse共同敏化zno，形成的多元敏化結(jié)構(gòu)，不僅可以有效地抑制電子-空穴對的復合而且可以增強對可見光的吸收，極大地增強光電流信號，進一步提高分析的靈敏度。
（3）本發(fā)明采用適配體代替?zhèn)鹘y(tǒng)的抗體作為癌胚抗原的識別元素，可以極大地降低分析操作的復雜性和成本，另外，利用癌胚抗原特異性識別適配體誘導dna探針解雜交而脫離電極表面，導致cdte@cdse敏化作用消失及癌胚抗原與適配體形成的生物復合物自身的空間位阻效應(yīng)實現(xiàn)信號放大，該信號放大方式靈敏、高效，對于臨床癌癥的治療和診斷具有重要的意義。
具體實施方式:
為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實施例。
實施例1:光電化學免疫傳感器用于癌胚抗原的檢測
（1）制備znonrs-nss/fto電極，首先利用電沉積法制備znonrs/fto電極：將fto依次用乙醇、丙酮、二次水超聲清洗10min后，在fto表面旋涂濃度為40mm的乙酸鋅種子溶液，轉(zhuǎn)速為1000r/min，時間為30s，然后將旋涂后的fto在120℃干燥10min，重復操作上述“旋涂-干燥”過程6次后，在由fto電極、ag/agcl參比電極和鉑對電極組成的三電極體系進行電沉積操作，沉積電位為0.0v，沉積電解液為由濃度為50mm的硝酸鋅、濃度為50mm的醋酸銨和濃度為70的乙二胺組成的混合液，沉積溫度為70℃，沉積時間為12h，沉積完成后用二次水和無水乙醇洗滌并在60℃干燥30min；然后利用水熱法制備znonrs-nss/fto電極：將上述中獲得znonrs/fto電極插入含有10ml混合液的25ml高壓釜中，且使導電面向下放置，所述的混合液由濃度為10mm的硝酸鋅、濃度為10mm的六次甲基四胺和濃度為1mm的檸檬酸鈉組成，在70℃加熱6h，待冷卻到室溫后，用二次水洗滌并在350℃煅燒30min，最后獲得znonrs-nss/fto電極；
（2）合成cds:mn：將0.6mmol硝酸鎘和0.06mmol醋酸錳溶于50ml二次水中，在磁力攪拌下加熱到70℃后，加入10ml新配制的濃度為0.05m的硫化鈉溶液，繼續(xù)在70℃下加熱回流3h，將獲得的沉淀分別用乙醇和二次水各洗滌3次，然后將其溶于二次水中，收集黃色的上層清液獲得cds:mn；
（3）制備cdte@cdse，首先制備cdte納米晶體：將0.5mmol硝酸鎘和0.2g脫水的檸檬酸鈉溶于50ml二次水中，然后加入52μl3-巰基丙酸，用濃度為1m的氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液ph至10.5后，加入0.1mmol亞碲酸鈉和50mg硼氫化鈉，在100℃下加熱回流2h，最后將反應(yīng)后的混合液用正丙醇離心洗滌多次，并將得到的沉淀在60℃下干燥30min獲得cdte納米晶體；然后制備cdte@cdse：首先制備硒氫化鈉溶液，將0.25mmol硒粉和1.0mmol硼氫化鈉溶于10ml除氧的二次水中，在磁力攪拌下，60℃油浴加熱50min，整個過程均在氮氣保護下進行；然后制備含有二價鎘離子的溶液，將0.3mmol硝酸鎘和32μl3-巰基丙酸溶于10ml除氧的二次水中，隨后用濃度為1m的氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液ph至10.5；最后制備cdte@cdse：將上述獲得cdte納米晶體溶于25ml除氧的二次水后，用濃度為1m的氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液ph至10.5，在氮氣的保護下，先緩慢地逐滴加入3ml含有二價鎘離子的溶液，再緩慢地逐滴加入3ml硒氫化鈉溶液，在80℃加熱反應(yīng)30min，將獲得反應(yīng)混合液用正丙醇離心洗滌多次，最后將得到的沉淀在60℃下干燥30min并重新分散在25ml除氧的二次水中，備用；
（4）標記cdte@cdse在dna探針上，取1ml由步驟（3）中獲得的cdte@cdse和濃度為10mm的edc及濃度為20mm的nhs組成的混合液加入到1ml含有dna探針的ph7.4pbs中，所用的dna探針濃度為10nmol，其5′端帶有氨基，在37℃下振蕩反應(yīng)2h后，靜置12h，利用微孔管除去未反應(yīng)的dna探針，最后將獲得的cdte@cdse-dna重新分散在1mlph7.4pbs中；
（5）光電化學免疫傳感器的構(gòu)建：將步驟（1）中獲得的znonrs-nss/fto電極浸泡在濃度為2%的3-氨丙基三乙氧基硅烷的溶液中，孵化1h，用ph7.4pbs洗滌后，在其表面滴涂20μl由步驟（2）中獲得的cds:mn和濃度為10mm的edc及濃度為20mm的nhs組成的混合液，在室溫下孵化2h后，用ph7.4pbs洗滌除去未反應(yīng)的試劑，將10μl濃度為5.0μm的與癌胚抗原特異性識別的適配體滴涂到電極表面，所用的適配體3′端帶有氨基，并在4℃下孵化12h，用ph7.4pbs洗滌除去多余的適配體后，繼續(xù)滴涂20μl1mm6-羥基-1-己硫醇用于封堵非特異性結(jié)合位點，在室溫下孵化1h后，用ph7.4pbs洗滌，然后將20μl步驟（4）中獲得的cdte@cdse-dna滴涂到電極表面并在37℃下孵化2h，用ph7.4pbs洗滌除去多余的cdte@cdse-dna后，滴涂10μl不同濃度的癌胚抗原，在37℃下孵化2h后用ph7.4pbs洗滌，完成光電化學免疫傳感器的構(gòu)建；
（6）光電流信號檢測：在由步驟（5）中獲得的znonrs-nss/fto電極、鉑對電極和ag/agcl參比電極組成的三電極體系中進行光電流信號檢測，所用的檢測方法為電流-時間曲線法，電壓為0.0v，激發(fā)波長范圍為200-2500nm，每隔10s切換一次激發(fā)光源開關(guān)，所用的檢測溶液為5ml含有0.01m過氧化氫的ph7.4pbs溶液，且在使用前檢測溶液要通氮氣除氧15min，隨著癌胚抗原濃度的增加，光電流信號逐漸減少，通過癌胚抗原濃度與光電流信號之間的關(guān)系可以實現(xiàn)對癌胚抗原的定量檢測。
sequencelisting
<110>濟南大學
<120>檢測癌胚抗原的光電化學免疫傳感器的制備及應(yīng)用
<130>2017
<160>2
<170>patentinversion3.3
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<212>dna
<213>人工合成
<400>1
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<212>dna
<213>人工合成
<400>2
aattgaataagc12