本發(fā)明涉及一種熒光染料，特別涉及一種含氰基雙光子熒光染料，可用于活細(xì)胞成像。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，雙光子顯微鏡的發(fā)展已經(jīng)徹底改變了對(duì)組織器官特別是厚的或高散射標(biāo)本的觀測(cè)。雙光子熒光顯微成像兼具諸如近紅外激發(fā)、暗場(chǎng)成像、避免熒光漂白和光致毒、定靶激發(fā)、高分辨率、降低生物組織吸光系數(shù)及自發(fā)熒光干擾等特點(diǎn)而顯著地優(yōu)于單光子熒光顯微成像。雙光子熒光成像技術(shù)具有近紅外激光激發(fā)、光毒性小和光漂白、自發(fā)熒光干擾弱及組織穿透深度大等優(yōu)點(diǎn)，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。然而，傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料雙光子吸收截面(two-photonabsorptioncross-sections，σ)小、雙光子激發(fā)發(fā)光亮度(two-photonexcitationbrightness,σ×φ,其中φ為發(fā)光量子產(chǎn)率)低，難以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞或深層組織高質(zhì)量雙光子熒光成像，這大大阻礙了雙光子熒光顯微成像技術(shù)的發(fā)展。開(kāi)發(fā)雙光子激發(fā)作用截面大、雙光子激發(fā)發(fā)光亮度高、生物相容性好的新型高效雙光子熒光探針，是提高雙光子熒光成像質(zhì)量、拓展雙光子熒光成像應(yīng)用范圍的關(guān)鍵。因此，雙光子熒光染料的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與合成已逐漸成為當(dāng)前研究的焦點(diǎn)。

目前，用于細(xì)胞成像的雙光子熒光染料日益豐富，但含有雙氰基的雙光子熒光染料的開(kāi)發(fā)卻相對(duì)滯后。在已報(bào)道的含雙氰基的熒光染料中多為苯乙烯衍生物其雙光子性能依然存在諸多不足，例如專(zhuān)利cn101037541a報(bào)道了一類(lèi)以二苯乙烯為母體的雙氰基雙光子熒光染料，但專(zhuān)利中并未闡述其在活細(xì)胞成像方面的應(yīng)用。因此，在活細(xì)胞熒光成像檢測(cè)方面，依然缺乏優(yōu)良的雙氰基熒光染料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服上述不足而提供一種含氰基雙光子熒光染料，該染料具有膜通透性好、顯色強(qiáng)、光穩(wěn)定性好、毒性低的特點(diǎn)。

本發(fā)明還提供該種含氰基雙光子熒光染料的制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種含氰基雙光子熒光染料，其結(jié)構(gòu)通式如(i)所示：

其中：上述r表示氫、烷基、羥烷基或醚基。

上述結(jié)構(gòu)通式中，r優(yōu)選氫、c1-12的烷基、c1-12的羥烷基或乙醚基。

上述的r最優(yōu)選乙基，即含氰基雙光子熒光染料為3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑。

上述含氰基雙光子熒光染料的制備方法，包括步驟如下：

先將咔唑鹵代反應(yīng)在氮上引入r基生成取代咔唑，再使取代咔唑與n,n-二甲基甲酰胺發(fā)生vilsmeier(維爾斯邁爾)反應(yīng)得到3,6-二甲酰基-9-乙基咔唑中間體，將3,6-二甲?；?9-乙基咔唑中間體與(4-氰基芐基)亞磷酸二乙酯發(fā)生michael(邁克爾)加成反應(yīng)生成氰基雙光子熒光染料。

上述的維爾斯邁爾反應(yīng)是先在0℃向部分n,n-二甲基甲酰胺中滴加三氯氧磷攪拌至待有白色沉淀生成后，將溶解在另一部分n,n-二甲基甲酰胺中的取代咔唑加入到其中，升溫至100℃，攪拌反應(yīng)20-35h。n,n-二甲基甲酰胺、三氯氧磷及取代咔唑的物質(zhì)的量比為36～39:18～19.5:1。前后兩部分所用n,n-二甲基甲酰胺的物質(zhì)的量比在1～1.1：1。

所述的3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑的制備反應(yīng)式如圖1所示。

本發(fā)明含氰基雙光子熒光染料在對(duì)活細(xì)胞染色進(jìn)行熒光成像中的應(yīng)用。所述的活細(xì)胞優(yōu)選活性hela細(xì)胞。

利用本發(fā)明所述含氰基雙光子熒光染料標(biāo)記后的雙光子熒光圖像顯示，染料能很好的穿透活hela細(xì)胞的胞膜進(jìn)入細(xì)胞從而使細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)出明亮的綠色熒光，證明了本發(fā)明所述雙光子熒光染料具有優(yōu)良的細(xì)胞膜通透性和雙光子熒光成像性能。本發(fā)明制備的含氰基雙光子熒光染料具備不錯(cuò)的雙光子熒光活性吸收截面(12.56gm)和優(yōu)良的細(xì)胞膜通透性，同時(shí)還具有顯色強(qiáng)、光穩(wěn)定性好、毒性低的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞的雙光子成像。與此同時(shí)，它還可以在不影響其共軛結(jié)構(gòu)的前提下對(duì)其進(jìn)行具有靶向性的雙光子生物探針改造，從而可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為相應(yīng)的生理、病理學(xué)研究用生物檢測(cè)試劑。

附圖說(shuō)明

圖1為3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑的制備反應(yīng)式；

圖2為3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑在不同溶劑中的紫外吸收光譜圖；

圖3為3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑在不同溶劑中的單光子熒光光譜圖；

圖4為3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑在不同溶劑中的雙光子熒光光譜圖；

圖5為3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑?qū)钚詇ela細(xì)胞進(jìn)行染色在800納米激光輻照下得到的雙光子熒光照片，a為染料在細(xì)胞內(nèi)的熒光成像，b是細(xì)胞的微分干涉(dic)成像，c為a和b的疊加圖像(共定位圖)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合優(yōu)選的具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1

含氰基雙光子熒光染料(3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑)的制備：

(1)9-乙基咔唑的合成

室溫下，將氫氧化鉀28g500mmol溶解在60ml的丙酮中，攪拌反應(yīng)30min，咔唑13.2g80mmol加入到上述反應(yīng)液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)4h。將溴乙烷120mmol緩慢滴加到上述反應(yīng)液中，攪拌反應(yīng)過(guò)夜。將反應(yīng)液倒入200ml的冰水中，有黃色沉淀析出，過(guò)濾，乙醇重結(jié)晶得到白色針狀產(chǎn)品8.2g，產(chǎn)率52.6％。¹hnmr(400mhz)：8.11(d,j＝7.2,2h),7.48-7.41(m,4h),7.24(d,j＝9.2,2h),4.38(d,j＝6.8,2h),1.52-1.42(m,3h)；

(2)3,6-二甲?；?9-乙基咔唑的合成

將22ml0.3moldmf加入到250ml的三口瓶中，降溫至0℃，三氯氧磷28ml0.3mol逐滴加入到上述反應(yīng)液中，攪拌30min，待有白色沉淀生成后將溶解在20mldmf中的3.15g16mmoln-乙基咔唑加入到反應(yīng)液中，升溫至100℃，攪拌反應(yīng)30h后冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入200ml的冰水中，氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph至8，二氯甲烷萃取，硫酸鎂干燥，硅膠擔(dān)載柱分離，得淡黃色固體2.1g產(chǎn)率52.3％。¹hnmr(400mhz)：10.11(s,2h)8.92(s,2h)8.08(d,j＝8.0,2h)7.91(d,j＝8.0,2h)4.59(d,j＝6.4,2h)1.37(s,3h)；

(3)3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑的合成

無(wú)水無(wú)氧的條件下，取1.0g3.98mmol3,6-二甲酰基-9-乙基咔唑及(4-氰基芐基)亞磷酸二乙酯2.5g9.88mmol置于50ml的三口瓶中，加入20ml的無(wú)水thf溶解，然后將1.6g叔丁醇鉀溶解在10ml無(wú)水thf中，緩慢滴加到上述反應(yīng)液中，室溫下攪拌反應(yīng)24h，將反應(yīng)液倒入100ml水中，乙酸乙酯萃取，硫酸鎂干燥，硅膠擔(dān)載柱分離，得黃綠色固體1.2g產(chǎn)率67.2％。¹hnmr(400mhz)：8.48(s,2h)7.81-7.86(m,10h)7.66(t,j＝9.2,4h)7.38(d,j＝16.4,2h)4.47(d,j＝6.8,2h)1.35(t,j＝6.4,3h)。

實(shí)施例2

含氰基雙光子熒光染料(3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙醚基咔唑)的制備：

(1)9-乙醚基咔唑的合成

室溫下，將氫氧化鉀28g500mmol溶解在60ml的丙酮中，攪拌反應(yīng)30min，咔唑13.2g80mmol加入到上述反應(yīng)液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)4h。將2-溴乙基乙基醚120mmol緩慢滴加到上述反應(yīng)液中，攪拌反應(yīng)過(guò)夜。將反應(yīng)液倒入200ml的冰水中，有黃色沉淀析出，過(guò)濾，乙醇重結(jié)晶得到白色針狀產(chǎn)品9.8g，產(chǎn)率51.3％。¹hnmr(400mhz)：8.38(d,j＝1.6,1h)8.19(d,j＝7.6,1h)7.54-7.63(m,3h)7.45-7.49(m,1h)7.22(t,j＝7.2,2h)4.52(t,j＝5.6,2h)3.71(t,j＝5.2,2h)3.29-3.35(m,2h)0.93(t,j＝6.8,3h)

(2)3,6-二甲?；?9-乙醚基咔唑的合成

將22ml0.3moldmf加入到250ml的三口瓶中，降溫至0℃，三氯氧磷28ml0.3mol逐滴加入到上述反應(yīng)液中，攪拌30min，待有白色沉淀生成后將溶解在20mldmf中的3.82g16mmoln-乙醚基咔唑加入到反應(yīng)液中，升溫至100℃，攪拌反應(yīng)30h后冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入200ml的冰水中，氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph至8，二氯甲烷萃取，硫酸鎂干燥，硅膠擔(dān)載柱分離，得淡黃色固體2.8g產(chǎn)率59.3％。¹hnmr(400mhz)：10.06(s,2h)8.82(d,j＝0.8,1h)8.55(d,j＝1.6,1h)7.99-8.02(m,1h)7.81(d,j＝8.8,1h)7.64-7.72(m,2h)4.63(t,j＝4.8,2h)3.75(t,j＝5.2,2h)3.31-3.36(m,2h)0.92(t,j＝6.8,3h)；

(3)3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙醚基咔唑的合成

無(wú)水無(wú)氧的條件下，取1.17g3.98mmol3,6-二甲?；?9-乙醚基咔唑及(4-氰基芐基)亞磷酸二乙酯2.5g9.88mmol置于50ml的三口瓶中，加入20ml的無(wú)水thf溶解，然后將1.6g叔丁醇鉀溶解在10ml無(wú)水thf中，緩慢滴加到上述反應(yīng)液中，室溫下攪拌反應(yīng)24h，將反應(yīng)液倒入100ml水中，乙酸乙酯萃取，硫酸鎂干燥，硅膠擔(dān)載柱分離，得黃綠色固體1.6g產(chǎn)率81.5％。

光學(xué)性質(zhì)的測(cè)定試驗(yàn)：

本發(fā)明所述含氰基雙光子熒光染料在二氯甲烷(dcm)、乙酸乙酯(ea)、乙醇(etoh)、乙腈(acn)、二甲亞砜(dmso)和磷酸緩沖鹽溶液(pbs)等不同溶劑中的光學(xué)性質(zhì)。在測(cè)定3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑的紫外吸收、單光子熒光及雙光子熒光光譜的過(guò)程中，染料分子在不同溶劑dcm、ea、etoh、acn、dmso和pbs中的濃度均為1×10^-5mol/l；參比溶液為ph＝13的熒光素水溶液，濃度為2×10^-6mol/l；測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1和附圖2-4。

(1)染料的紫外吸收性質(zhì)

染料在不同溶劑中的紫外吸收都同時(shí)呈現(xiàn)出兩個(gè)相似的特征吸收帶。首先在330nm左右的吸收，可能源于探針?lè)肿又械娜〈沁蛲ㄟ^(guò)雙鍵與苯環(huán)相連形成的共軛大π鍵，在光的照射下所產(chǎn)生的π→π*躍遷；而在390nm左右的吸收帶，則源于氰基氮原子上的孤電子對(duì)與苯環(huán)π電子共軛形成的n→π*躍遷。

溶劑對(duì)染料吸收光譜的影響較為復(fù)雜，一方面在非質(zhì)子性有機(jī)溶劑dcm、ea、和acn中，最大吸收波長(zhǎng)λ^amax隨著溶液極性的增加而逐漸藍(lán)移，對(duì)于這種反溶劑化效應(yīng)有的研究者認(rèn)為當(dāng)極性增大到一定程度時(shí)，溶質(zhì)和溶劑分子相互作用在局域內(nèi)形成電場(chǎng)，使得基態(tài)相對(duì)穩(wěn)定，從而相對(duì)增大了基態(tài)和激發(fā)態(tài)間的能量，使吸收峰藍(lán)移，而在dmso中可能由于dmso(v＝2.24cp)的高粘度使得探針的最大吸收峰與dcm(v＝0.44cp)相比出現(xiàn)了輕微的紅移；在質(zhì)子性溶劑乙醇中，由于探針?lè)肿又械那杌鵦n能與乙醇中的羥基oh形成氫鍵cn┈h–o，從而導(dǎo)致探針最大吸收峰的紅移現(xiàn)象的發(fā)生。另一方面，與在dmso(λ^amax＝398nm)等有機(jī)溶劑中的最大吸收峰相比，探針?lè)肿釉趐bs水相中最大吸收峰(λ^amax＝327nm)出現(xiàn)較大藍(lán)移，而且吸收帶變平滑，同時(shí)伴有明顯的減色效應(yīng)。

(2)染料的單光子熒光性質(zhì)

對(duì)比染料在不同溶劑中的單光子熒光光譜可以看出，在ea中染料分子的最大發(fā)射波長(zhǎng)λ^emax出現(xiàn)在449nm處，與極性相對(duì)較弱的dcm相比輕微的藍(lán)移，而熒光強(qiáng)度則達(dá)到最大值。另一方面，在dcm、etoh、acn、dmso和pbs中，染料的最大發(fā)射峰位置呈現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，即隨著溶劑極性的增加，最大發(fā)射波長(zhǎng)輕微紅移，而熒光強(qiáng)度基本上隨著溶劑極性的增加逐漸減弱，其中染料在dmso中熒光強(qiáng)度反常的增強(qiáng)可能是由于dmso的高粘度提高了franck-condon(夫蘭克-康登)垂直躍遷的幾率所致，隨著粘度的增加，扭曲變化程度變小，熱能損耗變小，從而使得熒光強(qiáng)度變大。染料在pbs水相中熒光量子產(chǎn)率最低只21.88％，在dmso中熒光量子產(chǎn)率達(dá)到最大值86.02％，而在dcm(72.82％)、ea(68.72％)、etoh(61.33％)和acn(62.17％)等溶劑中的熒光量子產(chǎn)率卻相差不大，并且隨著溶劑極性的增加熒光量子產(chǎn)率基本呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)。

(3)染料的雙光子熒光性質(zhì)

染料在不同溶劑中的雙光子熒光峰與單光子熒光峰相比略微紅移，這種紅移現(xiàn)象可以用再吸收效應(yīng)解釋。由于染料分子的線性吸收峰的長(zhǎng)波段區(qū)域與發(fā)射光譜短波段區(qū)域的重疊，染料在該區(qū)域發(fā)射的熒光有一部分會(huì)被它自身的基態(tài)分子所吸收，使其雙光子熒光的最大吸收峰發(fā)生紅移。另一方面，染料在dcm、ea、etoh和acn中的活性吸收截面分別為4.62gm、3.69gm、6.10gm和5.88gm，水相pbs中的雙光子熒光強(qiáng)度最低，其活性吸收截面只有0.86gm；而在dmso中染料分子具有最強(qiáng)的雙光子熒光，相應(yīng)的活性吸收截面約為在水相pbs中的15倍達(dá)到12.56gm。

表1本發(fā)明染料在不同溶劑中的光譜數(shù)據(jù)

λ^amax為最大吸收波長(zhǎng)；λ^emax為單光子最大發(fā)射波長(zhǎng)；фs為單光子量子產(chǎn)率；δs為雙光子吸收截面；фs*δs為雙光子活性吸收截面。

毒性試驗(yàn)和成像觀察：

(1)hela細(xì)胞培養(yǎng)

首先將hela細(xì)胞注入到含有雙抗(青霉素和鏈霉素)和10％的小牛血清的伊格爾培養(yǎng)基(eagleminimalessentialmedium)中，然后置于含有5％co2的恒溫(37℃)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)hela細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期，再接片培養(yǎng)：用鉻酸洗液浸泡蓋玻片半小時(shí)，再依次分別用清水、超純水沖洗三遍后，烘干，滅菌后放到無(wú)菌一次性培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液倒出后，細(xì)胞用pbs緩沖液沖洗三遍，再用1毫升濃度為0.25wt％的胰酶溶液消化3分鐘，倒掉胰酶溶液，再加入少量培養(yǎng)基溶液，然后用移液槍鼓氣吹打均勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)，留取適當(dāng)密度的細(xì)胞后，加入培養(yǎng)基，再次吹打均勻，然后將細(xì)胞加入到提前準(zhǔn)備好的含有載玻片的培養(yǎng)皿中，把接種好的培養(yǎng)皿放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待其貼壁生長(zhǎng)。在co2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-36小時(shí)，待細(xì)胞密度達(dá)到50％-70％，即可用于細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)。

(2)3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑?qū)ela細(xì)胞的染色。

將準(zhǔn)備好的活細(xì)胞用4wt％的多聚甲醛溶液浸泡半小時(shí)，然后在室溫下用0.5％tritonx-100溶液再處理2-3分鐘，將細(xì)胞固定。

先將染料3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑配成1mm的dmso母液，用5微摩爾染料染色hela細(xì)胞在恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，然后用d-hans溶液洗去未進(jìn)入細(xì)胞的多余的染料溶液，再加入幾滴pbs溶液，把載玻片的細(xì)胞生長(zhǎng)面朝下蓋在培養(yǎng)皿的底片上，即可將培養(yǎng)皿放到熒光顯微鏡上進(jìn)行熒光成像。

(3)3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑?qū)ela細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。

首先采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板來(lái)檢測(cè)細(xì)胞濃度，滴一滴細(xì)胞培養(yǎng)液到含有四塊16格1mm×1mm的大方格的計(jì)數(shù)板上，數(shù)一下每個(gè)方格上的細(xì)胞個(gè)數(shù)，取平均值n(細(xì)胞濃度為n/mm³)。將細(xì)胞的濃度控制在5000～50000個(gè)/mm³，然后對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋?zhuān)俜湃?6孔板培養(yǎng)。待96孔板中的細(xì)胞生長(zhǎng)一天24h后，分別在2h、8h、12h和24h時(shí)在不同孔板中加入5微摩爾的染料3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑，然后在每個(gè)孔板中加入20微升濃度為5mg/ml的活細(xì)胞檢測(cè)劑3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，再繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。依次把孔板內(nèi)的培養(yǎng)液吸去，再向每個(gè)空格中分別加入150微升dmso，將孔板放到搖床上低速振蕩使結(jié)晶物得到充分的溶解。最后在酶標(biāo)儀上讀取各孔的吸光值(od490nm)進(jìn)行計(jì)算。對(duì)照孔(培養(yǎng)液、細(xì)胞、濃度相同的藥物溶解介質(zhì)、二甲基亞砜和mtt)調(diào)零孔(二甲基亞砜、培養(yǎng)基和mtt)。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表2可以看出：hela細(xì)胞在含有5μm染料的培養(yǎng)基中孵育2h、8h、12h和24h后細(xì)胞的存活率。在染色2h以?xún)?nèi)，hela細(xì)胞的存活率89％左右，隨著孵育染色時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)胞的存活率也在下降，24h時(shí)細(xì)胞的存活率為51％。所以當(dāng)染色濃度為5μm染色時(shí)間為30min時(shí)，可以認(rèn)為染料對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯毒性。

表2.染料毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

(4)3,6-雙(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑染色hela細(xì)胞雙光子成像觀察

用上述染色的hela細(xì)胞做雙光子熒光圖像，用800納米激光持續(xù)輻照，在雙光子熒光顯微鏡下觀察、記錄細(xì)胞中的熒光分布等，結(jié)果見(jiàn)附圖5，本發(fā)明所述熒光染料染色hela細(xì)胞，在800納米激光持續(xù)輻照后，得到清晰的雙光子熒光成像照片，本發(fā)明所述的熒光染料在活細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)區(qū)域具有清晰的綠色熒光成像，這表明本發(fā)明所述的熒光染料具有好的膜通透性和雙光子熒光成像性能。

以上是結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)介紹，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。