本發(fā)明涉及一種雙光子熒光探針及其制備方法和用途，具體地說是一種具有cu²⁺識別功能的雙光子熒光探針及其制備方法。

背景技術(shù)：

銅離子作為人體必要的微量元素之一，與許多生理過程有著緊密聯(lián)系。它在體內(nèi)的平衡對有機體的新陳代謝具有至關(guān)重要的作用，但機體對于細胞內(nèi)銅離子的含量有著十分嚴格的調(diào)控機制，非正常生理濃度的銅離子會導致一系列疾病，例如朊病毒疾病、老年癡呆癥等一些神經(jīng)退行性疾病。另外，銅離子被視為環(huán)境污染的金屬離子之一，過量的銅離子也會對動植物造成嚴重危害。因此，制備檢測生命體系和環(huán)境中銅離子的探針對于生命科學、環(huán)境科學都有著重要的意義。目前，大多數(shù)銅離子探針，僅適用于短波激發(fā)的單光子熒光顯微技術(shù)，由于受背景干擾較大，組織滲透能力弱，限制了該類探針在生物體內(nèi)的應用。近紅外發(fā)光(長波激發(fā))的雙光子吸收材料，相對于單光子吸收材料而言，它適用于雙光子熒光顯微技術(shù)，具有組織自發(fā)熒光弱、自吸收少、滲透能力強等優(yōu)點，為有效地檢測生物體內(nèi)銅離子提供了有利條件。近期，雖報道了一些銅離子識別的雙光子熒光探針，但是，具有良好水溶性和生物相容性并且能夠檢測生物體內(nèi)銅離子的雙光子熒光探針還鮮為報道，目前仍急需探究。

申請人對本申請的主題進行了如下的文獻檢索：

1、xueshu.baidu.com網(wǎng)檢索結(jié)果：(2017/3/23)

2、中國期刊網(wǎng)檢索結(jié)果：

檢索方式一：

篇名-cu²⁺識別的雙光子熒光探針：無相關(guān)文獻。

篇名-一種cu²⁺識別的雙光子熒光探針--席夫堿化合物及其制備方法：無相關(guān)文獻。

檢索方式二：

全文-cu²⁺識別的雙光子熒光探針：無相關(guān)文獻。

全文-一種cu²⁺識別的雙光子熒光探針--席夫堿化合物及其制備方法：無相關(guān)文獻。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種具有cu²⁺識別功能的雙光子熒光探針及其制備方法和用途。本發(fā)明考慮到探針分子的性質(zhì)與識別金屬離子特性之間的密切關(guān)系，我們用具有強給電子能力及較高反應活性的n,n-二乙基水楊醛，與含有季銨鹽基團的苯胺衍生物反應，制備出具有特定配位點、良好水溶性和生物相容性的d–π–a共軛結(jié)構(gòu)的席夫堿化合物(hl)，通過x-ray單晶衍射確定了其結(jié)構(gòu)，并在hepes-buffer溶液中進行了識別金屬離子活性篩選，結(jié)果表明hl分子在紫外-可見光區(qū)可以選擇性地識別cu²⁺，不受其它金屬離子的干擾，實驗證明探針分子與銅離子形成的配合物具有良好的水溶性和生物相容性。生物學實驗表明，探針hl可以透過細胞膜，靶向在細胞線粒體和斑馬魚的肝部及胃部，顯示黃綠色熒光，加入外源性銅離子后，探針在生物體內(nèi)的熒光幾乎完全淬滅，隨著與cu²⁺配位能力更強的組氨酸加入，探針hl被釋放，熒光基本恢復。這一研究結(jié)果的發(fā)現(xiàn)，hl作為cu²⁺識別熒光探針具有重要的實用價值。

本發(fā)明具有cu²⁺識別功能的雙光子熒光探針，為席夫堿化合物(hl)，其結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明具有cu²⁺識別功能的雙光子熒光探針的制備方法，包括如下步驟：

1、化合物ⅰ的合成

將50.00g(47.6mmol)二乙醇胺溶解在80mldmso中，加入20ml(18.8mmol)對氟硝基苯，140℃反應3.5h；待反應液冷卻至室溫后，倒入1000ml水中(有大量黃色固體粉末析出)，常溫下攪拌10min后抽濾，水洗兩遍，真空干燥8-12h，得黃色粉末ⅰ40.00g，即為化合物ⅰ，產(chǎn)率94％。

2、化合物ⅱ的合成

將5.00g(22mmol)化合物ⅰ溶解在30ml乙腈中，在冰鹽浴條件下逐滴滴加2ml(11mmol)pbr3，然后加熱回流6h；待反應液冷卻至室溫后倒入冰水中，用飽和na2co3溶液緩慢調(diào)至中性，此時有大量黃色固體粉末析出，抽濾，用乙醇重結(jié)晶，真空干燥8-12h，得淡黃色棒狀晶體ⅱ5.78g，為化合物ⅱ，產(chǎn)率75％。

3、化合物ⅲ的合成

將4.00g(11.4mmol)化合物ⅱ溶解在20mlthf中，加入40ml40％的三甲胺水溶液，用100ml高壓反應釜在90℃反應12h；減壓除去有機溶劑，冷卻至室溫后，緩慢滴加含有8.00g(45.6mmol)六氟磷酸銨的水溶液，此時有橘黃色固體析出，抽濾，真空干燥24h，得化合物ⅲ6.2g，產(chǎn)率89％。

4、化合物ⅳ的合成

將2.00g(3.3mmol)化合物ⅲ用20ml甲醇溶解在50ml的史萊克燒瓶中，依次加入0.10g5％pd/c和1ml水合肼，在氮氣保護下回流反應12h；趁熱濾除pd/c，減壓除去溶劑，將粗產(chǎn)物用無水乙醇加熱洗滌，趁熱抽濾得白色固體1.43g，即為化合物ⅳ，產(chǎn)率75％。

5、目標產(chǎn)物hl的合成

將0.50g(2.61mmol)4-nn’-二羥乙基水楊醛加熱溶解在15ml乙醇中，滴加2滴冰醋酸，攪拌5min后加入1.00g(1.75mmol)化合物ⅳ，回流反應12h后有黃色固體析出，趁熱抽濾，用乙腈和乙醇(v/v＝1:1)重結(jié)晶得黃褐色針狀晶體1.02g，即為目標產(chǎn)物hl，產(chǎn)率73％。

本發(fā)明合成路線如下：

本發(fā)明雙光子熒光探針在檢測生物體內(nèi)銅離子時可以作為cu²⁺識別熒光探針應用。

本發(fā)明雙光子熒光探針能夠可逆性地識別細胞內(nèi)外源性銅離子，在識別細胞內(nèi)銅離子后熒光淬滅，并且在組氨酸的作用下實現(xiàn)雙光子熒光探針的熒光恢復。

本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

1、hl的合成原料易得，成本低，反應條件溫和，處理簡單。

2、目標分子中引入季銨鹽基團，既可以調(diào)節(jié)分子內(nèi)推拉電子能力，從而產(chǎn)生非線性光學效應，又能很大程度上增加探針的水溶性和生物相容性，便于實現(xiàn)在生物體內(nèi)和環(huán)境中微量元素檢測方面的應用。

3、hl作為cu²⁺探針選擇性好、檢測限低、靈敏度高，且可以通過組氨酸實現(xiàn)可逆性。在hepes-buffer溶液中分別加入不同金屬離子后，僅當銅離子存在時，hl的紫外可見吸收強度迅速減弱，同時在短波位置上出現(xiàn)一個新的吸收峰(圖2)，單光子和雙光子熒光發(fā)射強度明顯減弱(圖2，圖3)，隨著組氨酸的加入，hl的光譜又基本恢復。

4、hl具有很好的細胞膜通透性，以720nm為激發(fā)波長時，觀察到其雙光子熒光顯影結(jié)果(圖4，圖5)，這種長波激發(fā)短波發(fā)射的光具有對細胞和組織損傷小、滲透能力強的特點，hl可以靶向細胞線粒體，可逆性地識別細胞內(nèi)外源性銅離子。目前，不存在類似的熒光探針，具有較強的商業(yè)價值。

附圖說明

圖1是hl的晶體結(jié)構(gòu)圖(為了便于觀察，省略氫原子和兩個六氟磷酸根)，ccdc號為1537634。說明本發(fā)明合成的hl是一個結(jié)構(gòu)明確的新型席夫堿化合物。

圖2是hl在hepes-buffer溶液中與金屬離子作用的吸收光譜圖(a)和發(fā)射光譜圖(b)。該圖說明了無論是紫外-可見吸收光譜還是發(fā)射光譜，hl都能實現(xiàn)對銅離子的選擇性識別。

圖3是探針hl識別cu²⁺可逆性的研究。(a)單光子熒光光譜圖；(b)hl熒光“on-off”循環(huán)次數(shù)；(c)雙光子熒光光譜圖；(d)hl加入cu²⁺和組氨酸前后的有效雙光子吸收截面變化圖。該圖說明hl加cu²⁺熒光淬滅，隨著組氨酸的加入熒光基本恢復，hl作為銅離子探針具有良好的可逆性。

圖4hl加入cu²⁺和組氨酸前后肝癌細胞的雙光子熒光成像研究結(jié)果。(a)雙光子作用圖；(b)細胞內(nèi)熒光強度分析圖；(c)流式細胞儀分析圖。該圖說明，探針hl可以靶向細胞線粒體，可逆性地識別細胞內(nèi)的外源性銅離子。

圖5hl加入cu²⁺和組氨酸前后斑馬魚的雙光子熒光成像研究結(jié)果。(a)hl雙光子顯影圖；(b)hl加cu²⁺雙光子顯影圖；(c)hl加cu²⁺再加組氨酸的雙光子顯影圖。該圖說明，探針hl可以進入斑馬魚肝部和胃部，可逆性地識別活體內(nèi)的外源性銅離子。

具體實施方式

1、化合物ⅰ的合成

將50.00g(47.6mmol)二乙醇胺溶解在80mldmso中，加入20ml(18.8mmol)對氟硝基苯，140℃反應3.5h；待反應液冷卻至室溫后，倒入1000ml水中(有大量黃色固體粉末析出)，常溫下攪拌10min后抽濾，水洗兩遍，真空干燥8-12h，得黃色粉末ⅰ40.00g，即為化合物ⅰ，產(chǎn)率94％。

¹h-nmr(400mhz,d6-dmso,ppm)δ:8.01(d,j＝9.5hz,2h),6.82(d,j＝9.5hz,2h),4.86(t,j＝5.1hz,2h),3.65-3.54(m,8h)。

2、化合物ⅱ的合成

將5.00g(22mmol)化合物ⅰ溶解在30ml乙腈中，在冰鹽浴條件下逐滴滴加2ml(11mmol)pbr3，然后80℃加熱回流6h；待反應液冷卻至室溫后倒入冰水中，用飽和na2co3溶液緩慢調(diào)至中性，此時有大量黃色固體粉末析出，抽濾，用乙醇重結(jié)晶，真空干燥8-12h，得淡黃色棒狀晶體ⅱ5.78g，為化合物ⅱ，產(chǎn)率75％。

¹h-nmr(400mhz,d6-dmso,ppm),δ:7.80(d,j＝7.9hz,2h),7.50(dd,j＝18.9,8.0hz,2h,),4.13(s,2h,),3.59(s,2h),3.44(t,j＝10.8hz,2h),3.37(t,j＝8.0hz,2h),3.24(d,j＝14.2hz,2h),2.42(s,2h).¹³c-nmr(100mhz,d6-dmso,ppm)δ28.81,61.65,112.32,124.23,137.42,155.72.esi-ms:m/z,calcd:349.93,found:351.92([m]+h⁺)。

3、化合物ⅲ的合成

將4.00g(11.4mmol)化合物ⅱ溶解在20mlthf中，加入40ml40％的三甲胺水溶液，用100ml高壓反應釜在90℃反應12h；減壓除去有機溶劑，冷卻至室溫后，緩慢滴加含有8.00g(45.6mmol)六氟磷酸銨的水溶液，此時有橘黃色固體析出，抽濾，真空干燥24h，得化合物ⅲ6.2g，產(chǎn)率89％。

¹h-nmr(d2o,400mhz,ppm)δ:8.15(d,j＝9.2,2h),6.83(d,j＝9.6,2h),4.00(t,j＝8.0,4h),3.49(t,j＝7.6,4h),3.18(s,18h)。

4、化合物ⅳ的合成

將2.00g(3.3mmol)化合物ⅲ用20ml甲醇溶解在50ml的史萊克燒瓶中，依次加入0.10g5％pd/c和1ml水合肼，在氮氣保護下70℃回流反應12h；趁熱濾除pd/c，減壓除去溶劑，將粗產(chǎn)物用無水乙醇加熱洗滌，趁熱抽濾得白色固體1.43g，即為化合物ⅳ，產(chǎn)率75％。

5、目標產(chǎn)物hl的合成

將0.50g(2.61mmol)4-nn’-二羥乙基水楊醛加熱溶解在15ml乙醇中，滴加2滴冰醋酸，攪拌5min后加入1.00g(1.75mmol)化合物ⅳ，回流反應12h后有黃色固體析出，趁熱抽濾，用乙腈和乙醇(v/v＝1:1)重結(jié)晶得黃褐色針狀晶體1.02g，即為目標產(chǎn)物hl，產(chǎn)率73％。

ir(kbr,cm^-1):3443,2982,1627,1519,837,560.¹h-nmr(d3-mecn,400mhz,ppm)δ:8.57(s,1h),7.31(d,j＝8.3,3h),6.98(d,j＝8.0,2h),6.32(t,j＝18.1,1h),6.16(s,1h),3.72(t,7.2,4h),3.45(t,j＝7.3,8h),3.15(s,18h),1.18(t,j＝7.0,6h).¹³c-nmr(100mhz,d3-mecn)δ:159,155,148,143,141,134,122,117,116,104,61,56,45,43,12.esi-ms:m/z,calcd:745.29,found:227.68([m-2pf6^–]²⁺/2)；anal.calc.forc27h45on5f12p2:c,43.49；h,6.08；n,9.39.found:c,43.48；h,6.06；n,9.41。

【目標分子hl的生物學研究】

1、活細胞內(nèi)cu²⁺的檢測

人體肝癌細胞(hepg2)與低濃度(10μmol)的hl在含有5％co2氣體和95％空氣的培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)0.5h，然后在其中加入銅離子培養(yǎng)0.5h，最后加入his(組氨酸)，再培養(yǎng)0.5h。雙光子激光共聚焦顯影結(jié)果表明，目標分子不僅可以透過細胞膜靶向線粒體部位，而且識別線粒體中的銅離子后熒光淬滅，在組氨酸的作用在實現(xiàn)了探針的熒光恢復。

2、斑馬魚體內(nèi)cu²⁺的檢測

將孵化五天的斑馬魚放在hepes-buffer溶液中，加入hl(5μmol)，在常溫下培養(yǎng)2h，然后在其中加入銅離子培養(yǎng)0.5h，最后加入his(組氨酸)，再培養(yǎng)0.5h。雙光子激光共聚焦顯影結(jié)果表明，目標分子不僅可以進入斑馬魚的胃部和肝部，而且識別斑馬魚體中的銅離子后熒光淬滅，在組氨酸的作用下實現(xiàn)了探針的熒光恢復。