一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種雙光子熒光染料及其制備方法和用途，以實現(xiàn)示蹤和定位細胞中的溶酶體，具有單光子熒光量子產(chǎn)率高，斯托克斯位移大，有效雙光子吸收截面大，溶酶體定位系數(shù)高，光穩(wěn)定性好的優(yōu)點。

二、

背景技術(shù)：

溶酶體是真核細胞中的一種酸性細胞器，構(gòu)成了哺乳動物細胞的終端降解“車間”，內(nèi)含多種水解酶，專司分解各種外源和內(nèi)源的大分子物質(zhì)。它們通過吞噬、內(nèi)吞和自噬的途徑接受和降解大分子，并且在多種生理過程中發(fā)揮重要的作用。為了深入了解它們的生理作用，各種溶酶體染料被開發(fā)，其中一些可商業(yè)購得。然而，這些染料大多都是單光子熒光染料。單光子熒光染料由于普遍存在激發(fā)光波長短(350-550nm)、穿透深度淺、光漂白和細胞自熒光等缺陷，因而限制了其在組織和活體成像中的應(yīng)用。

克服這些問題首先需要可以在細胞和組織深處示蹤溶酶體的雙光子(tp)熒光染料，并借助雙光子顯微鏡(tpm)實現(xiàn)該過程的可視化。tpm，它使用兩個低能量的光子激發(fā)，是一種可以在一段較長的時間內(nèi)可視化深處完整組織的新技術(shù)。雙光子熒光染料具有很多單光子熒光染料所不具有的優(yōu)點，如：細胞光毒性小，不會引起熒光自淬滅，時間空間分辨率高，組織滲透深度大，因而雙光子熒光染料已經(jīng)作為科學家們研究的一個重要課題。

確認一個生物活動是否發(fā)生在溶酶體中的最常見方法是利用熒光染料共定位實驗，在共定位實驗中，細胞被熒光染料標記用來識別特定的目標—溶酶體。為了能在雙光子顯微鏡下進行這樣的實驗，特定識別溶酶體的雙光子熒光染料是不可或缺的。

咔唑作為一種經(jīng)典的熒光團，不僅具有大的共軛體系和共平面性能，而且具有良好的光穩(wěn)定性。此外，由于聚乙二醇(peg)鏈既可以增加水溶性，又可以作為溶酶體靶向基團。所以本發(fā)明以咔唑為熒光團，peg鏈為溶酶體靶向基團開發(fā)了一種雙光子熒光溶酶體染料。以peg鏈為溶酶體靶向基團的咔唑基雙光子熒光染料未見報道。

三、

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種雙光子熒光染料及其制備方法和用途，所要解決的技術(shù)問題是通過分子設(shè)計遴選合適的雙光子熒光溶酶體染料結(jié)構(gòu)，以實現(xiàn)示蹤細胞中的溶酶體，并具有良好的雙光子吸收性能和溶酶體定位效果，光穩(wěn)定性好和細胞毒性小的優(yōu)點。

本發(fā)明雙光子熒光染料，是以咔唑為母體，分別簡記為lyso-mco或lyso-nco，其結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明雙光子熒光染料的制備方法，包括如下步驟：

1、中間體1的合成

在圓底燒瓶中加入3,6-二碘咔唑2.095g(5mmol)、koh0.560g(10mmol)、對甲苯磺酸三縮乙二醇單甲醚酯2.40g(me(ch2ch2o)3ots,7.55mmol)和dmf(30ml)后，充分攪拌溶解，室溫下反應(yīng)24小時，反應(yīng)過程中tlc跟蹤；反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液中加入水，然后用二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，硅膠柱分離(洗脫液：石油醚/乙酸乙酯＝6/1，v/v)，得到淡黃色固體1.695g，即為中間體1，產(chǎn)率60.0％。

2、lyso-mco的合成

稱取1.412g(2.5mmol)中間體1、0.33g(2.5mmol)4-甲氧基苯乙炔、5.6mgpd(oac)2、19.1mgcui、26.2mgp(c6h5)3、30mldmf以及6mlet3n于燒瓶中，在n2保護下110℃反應(yīng)2天，反應(yīng)液過濾除去催化劑和不溶物，減壓蒸餾除去dmf和et3n，ch2cl2萃取，硅膠柱分離(洗脫液為v(pe)/v(ch2cl2)＝14:1)，收集得到淡黃色固體lyso-mco，1.023g，產(chǎn)率為71.2％。

3、lyso-nco的合成

稱取1.412g(2.5mmol)中間體1、0.36g(2.5mmol)4-乙炔基-n,n-二甲基苯胺、5.6mgpd(oac)2、19.1mgcui、26.2mgp(c6h5)3、30mldmf以及6mlet3n于燒瓶中，在n2保護下110℃反應(yīng)2天，反應(yīng)液過濾除去催化劑和不溶物，減壓蒸餾除去dmf和et3n，ch2cl2萃取，硅膠柱分離(洗脫液為v(pe)/v(ch2cl2)＝13:1)，收集得到墨綠固體lyso-nco，1.14g，產(chǎn)率為76.2％。

本發(fā)明lyso-mco和lyso-nco的合成過程如下：

本發(fā)明雙光子熒光染料的用途，是在活細胞成像時作為溶酶體示蹤劑使用，檢測方法如下：

將本發(fā)明雙光子熒光染料lyso-mco或lyso-nco溶于dmso中制得2mm的母液，取50μl的該母液于10ml容量瓶中，再用不同溶劑定容，配制成10μm的檢測試劑。所用樣品池為1.0×1.0cm的石英比色皿，所用測試使用的溶劑均已除水，測試溫度皆為20～25℃。

本發(fā)明首先對雙光子熒光染料在二甲亞砜dmso溶劑中的的光物理性質(zhì)做了研究，見圖1。從圖1中可以看出，化合物lyso-mco和lyso-nco的紫外最大吸收峰分別為318和328nm。分別以最大吸收波長為激發(fā)波長，它們的單光子熒光發(fā)射峰分別位于403nm和445nm(熒光量子產(chǎn)率分別為38.7％和42.5％)?；衔飈yso-mco發(fā)藍光，化合物lyso-nco發(fā)藍綠光，lyso-nco較lyso-mco約有42nm的紅移。這和紫外吸收光譜的變化規(guī)律一致，隨著末端基團給電子能力的增強，熒光發(fā)射峰的紅移程度也隨之增大。在lyso-mco和lyso-nco濃度為0.5～10μm，可以觀察到lyso-mco和lyso-nco分別在403nm和445nm處的熒光發(fā)射峰強度隨著濃度的變化線性增強(圖3)。接著本發(fā)明對雙光子熒光染料在不同極性溶劑(甲苯toluene，乙酸乙酯ea，四氫呋喃thf，丙酮acetone，甲醇ch3oh，乙醇c2h5oh，n,n-二甲基甲酰胺dmf，二甲亞砜dmso)中的的光物理性質(zhì)做了研究。溶劑的極性大小通常由溶劑的介電常數(shù)(ε)來確定，本實驗選取的溶劑按極性大小順序為：dmso(48.9)＞dmf(36.7)＞ch3oh(33.6)＞c2h5oh(24.3)＞acetone(20.7)＞thf(7.58)＞ea(6.02)＞toluene(2.37)。從圖2和表2中可以看出，兩種熒光染料都有明顯的溶致變色效應(yīng)，并且溶劑的極性對lyso-nco的單光子熒光發(fā)射光譜的影響較lyso-mco更顯著。lyso-nco在不同溶劑中熒光發(fā)射峰位置的明顯變化，其主要原因是由于lyso-nco的分子結(jié)構(gòu)中含有強的給電子基團—二甲氨基，化合物分子表現(xiàn)出較強的電荷轉(zhuǎn)移特征，更容易和大極性的溶劑之間發(fā)生溶劑效應(yīng)導致的。

利用雙光子誘導熒光測量技術(shù)，測試了濃度為10^-3mol/l時目標化合物的雙光子吸收截面，從圖5可以看出，lyso-mco和lyso-nco的最大有效吸收截面(δф)分別是20gm、43gm，雙光子最大激發(fā)波長分別在690nm和700nm。在lyso-mco和lyso-nco濃度分別在0.2～1mm、0.01～1mm范圍內(nèi)，可以觀察到lyso-mco和lyso-nco分別在418nm和493nm處的雙光子熒光發(fā)射峰強度隨著濃度的變化線性增強(圖4)。

使用mtt技術(shù)對lyso-mco和lyso-nco的細胞毒性進行了測試，從圖6可以看出，兩者的細胞毒性很低，適用于細胞內(nèi)示蹤溶酶體。為了進一步證明熒光染料lyso-mco和lyso-nco的性能，我們研究了二者在細胞成像中的最佳濃度、最佳細胞培養(yǎng)時間、光穩(wěn)定性和溶酶體定位系數(shù)測試。首先mcf細胞由deme(invitrogen)培養(yǎng)液培養(yǎng)，成像前一天，mcf細胞放于激光共聚焦皿中，成像時mcf細胞分別和0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μm的熒光染料lyso-mco/lyso-nco的dmso溶液于37℃、含5％co2的細胞培養(yǎng)箱中孵育30min，用中性的pbs緩沖溶液洗滌3次。使用雙光子熒光共聚焦顯微鏡成像，設(shè)置綠色通道tracker1，激發(fā)波長為690nm，發(fā)射波段為380～420nm，這個通道用來接受染料分子lyso-mco發(fā)射的熒光。重設(shè)綠色通道tracker1，激發(fā)波長為700nm，發(fā)射波段為425～465nm，這個通道用來接受染料分子lyso-mco發(fā)射的熒光。從圖7可以觀察到，熒光染料lyso-mco和lyso-nco的在細胞成像中的最佳濃度為2.0μm。利用單一變量法，在相同實驗條件下，我們用2.0μm熒光染料lyso-mco和lyso-nco進行細胞成像，研究二者的最佳細胞培養(yǎng)時間。如圖8和9所示，熒光染料lyso-mco和lyso-nco的最佳細胞培養(yǎng)時間皆為12min。與此同時，熒光染料的光穩(wěn)定性也是取決其性能的關(guān)鍵指標。因此，在相同的實驗條件下，我們用熒光染料lyso-mco和lyso-nco的最佳濃度培養(yǎng)細胞到最佳時間進行細胞成像，研究二者在不同時間點(0-20min)的光穩(wěn)定性，即最長觀察時間。從圖10和11可以看出，熒光染料lyso-mco和lyso-nco的觀察時間皆為20min，在10min時，商品化溶酶體染色劑lysosome@trackerred的熒光發(fā)射強度幾乎降低為0，而熒光染料lyso-mco和lyso-nco的熒光強度還有70％左右，這表明熒光染料lyso-mco和lyso-nco的光穩(wěn)定性遠勝于lysosome@trackerred。從圖12可以看出，熒光染料lyso-mco和lyso-nco的綠色通道與商品化溶酶體染色劑lysosome@trackerred的紅色通道之間圖像重疊效果很好，并得到了很高的位置重合系數(shù)(定位系數(shù)分別為0.9475和0.9398)。這一結(jié)果表明：熒光染料lyso-mco和lyso-nco能夠成功地選擇性定位細胞中的溶酶體。

本發(fā)明熒光染料分子結(jié)構(gòu)簡單，易于合成，雙光子吸收性能好，快速靈敏，光穩(wěn)定性好，細胞毒性小，能夠有效實現(xiàn)示蹤和可視化細胞內(nèi)的溶酶體。

四、附圖說明

圖1是10μm的lyso-mco和lyso-nco在dmso中歸一化的紫外吸收光譜和熒光光譜。

圖2是10μm的lyso-mco和lyso-nco在不同溶劑中歸一化的紫外吸收光譜(a:lyso-mco,c:lyso-nco)和熒光光譜(b:lyso-mco,d:lyso-nco)。

圖3是10μm的lyso-mco(a)和lyso-nco(b)在不同濃度(0.5～10μm)下的單光子熒光光譜，插圖為單光子熒光發(fā)射峰強度隨染料濃度變化的線性關(guān)系。

圖4是lyso-mco(a,0.2～1mm)和lyso-nco(b,0.01～1mm)在不同濃度下的雙光子熒光光譜，插圖為雙光子熒光發(fā)射峰強度隨染料濃度變化的線性關(guān)系。

圖5是lyso-mco和lyso-nco在dmso中的有效雙光子吸收截面數(shù)值。

圖6是不同含量(0μm、5μm、10μm、15μm)的lyso-mco/lyso-nco的作用下的細胞存活率。

圖7是mcf細胞與不同濃度的lyso-mco/lyso-nco染色后的熒光共焦顯微鏡成像；比例尺：10μm。

圖8是mcf細胞與2.0μm的lyso-mco染色在不同的培養(yǎng)時間下的熒光共焦顯微鏡成像；比例尺：10μm。

圖9是mcf細胞與2.0μm的lyso-nco染色在不同的培養(yǎng)時間下的熒光共焦顯微鏡成像；比例尺：10μm。

圖10是mcf細胞與lyso-mco/lysosome@trackerred光穩(wěn)定性測試，在培養(yǎng)12min后在不同時間點(0-20min)熒光共焦顯微鏡成像。比例尺：10μm。

圖11是mcf細胞與2.0μm的lyso-nco/lysosome@trackerred光穩(wěn)定性測試，在培養(yǎng)12min后在不同時間點(0-20min)熒光共焦顯微鏡成像。比例尺：10μm。

圖12是2.0μm的lyso-mco和lyso-nco在mcf細胞中的溶酶體定位成像(圖a、e是mcf細胞的明場，圖b、f分別是2μm的lyso-mco和lyso-nco的成像，圖c、g是2μmlysosome@trackerred的成像，圖d是b、c的疊加，圖h是f、g的疊加。圖d、h的插圖分別為lyso-mco和lyso-nco與lysosome@trackerred的的熒光強度相關(guān)性，即二者對應(yīng)的綠色通道與紅色通道的熒光強度相關(guān)性)。

五、具體實施方式

下面通過具體的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步分析說明。

實施例1：化合物lyso-mco和lyso-nco的合成

1、中間體1的合成

在圓底燒瓶中加入3,6-二碘咔唑2.095g(5mmol)、koh0.560g(10mmol)、對甲苯磺酸三縮乙二醇單甲醚酯2.40g(me(ch2ch2o)3ots,7.55mmol)和dmf(30ml)后，充分攪拌溶解，室溫下反應(yīng)24小時，反應(yīng)過程中tlc跟蹤；反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液中加入水，然后用二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，硅膠柱分離(洗脫液：石油醚/乙酸乙酯＝6/1，v/v)，得到淡黃色固體1.695g，即為中間體1，產(chǎn)率60.0％。

m.p.72.4-74.6℃。ft-ir(kbr,cm^-1):2884,1474,1422,1292,1123,798.¹hnmr(cdcl3,400mhz):δ(ppm)8.29(d,j＝1.6hz,2h),7.70(d,j＝1.6hz,1h),7.68(d,j＝1.6hz,1h),7.22(d,j＝8.6hz,2h),4.40(t,j＝5.6hz,2h,ch2),3.81(t,j＝5.6hz,2h,ch2),3.52–3.37(m,8h),3.33(s,3h,ch3)；¹³cnmr(cdcl3,100mhz):δ(ppm)139.76,134.50,129.21,124.03,111.32,81.94,77.37,77.25,77.05,76.73,71.84,70.99,70.63,70.56,69.33,59.05,43.48；hrms(esi,m/z):calcdforc19h21i2no3([m+h]⁺)565.9709,found565.9689；anal.calcdforc19h21i2no3:c40.37,h3.74,i44.90,n2.47,o8.49；foundc40.58,h3.64,n2.26.

2、lyso-mco的合成

稱取1.412g(2.5mmol)中間體1、0.33g(2.5mmol)4-甲氧基苯乙炔、5.6mgpd(oac)2、19.1mgcui、26.2mgp(c6h5)3、30mldmf以及6mlet3n于燒瓶中，在n2保護下110℃反應(yīng)2天，反應(yīng)液過濾除去催化劑和不溶物，減壓蒸餾除去dmf和et3n，ch2cl2萃取，用硅膠柱分離(洗脫液為v(pe)/v(ch2cl2)＝14:1)，收集得到淡黃色固體lyso-mco，1.023g，產(chǎn)率為71.2％。

m.p.123.5-125.4℃.ft-ir(kbr,cm^-1):2870,2520,1604,1360,1246,1021.¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ(ppm)8.23(d,j＝0.8hz,2h),7.62(d,j＝8.5,1.4hz,2h),7.51(d,j＝8.7hz,4h),7.41(d,j＝8.5hz,2h),6.90(d,j＝8.8hz,4h),4.47(t,j＝5.6hz,2h,ch2),3.87(t,j＝5.8hz,2h),3.84(s,6h,ch3),3.46(m,j＝8.7hz,8h,ch2),3.33(s,3h,ch3)；¹³cnmr(100mhz,cdcl3):δ(ppm)159.36,140.50,132.92,129.58,123.81,122.58,115.93,114.41,114.01,109.30,89.11,87.70,77.35,77.24,77.04,76.72,71.84,71.02,70.66,70.58,69.37,59.02,55.32,43.53.hrms(esi,m/z):calcdforc37h35no5[m+h]⁺574.2611,found574.2593；anal.calcdforc37h35no5:c77.47,h6.15,n2.44；foundc77.00,h6.11,n2.26.

3、lyso-nco的合成

稱取1.412g(2.5mmol)中間體1、0.36g(2.5mmol)4-乙炔基-n,n-二甲基苯胺、5.6mgpd(oac)2、19.1mgcui、26.2mgp(c6h5)3、30mldmf以及6mlet3n于燒瓶中，在n2保護下110℃反應(yīng)2天，反應(yīng)液過濾除去催化劑和不溶物，減壓蒸餾除去dmf和et3n，ch2cl2萃取，硅膠柱分離(洗脫液為v(pe)/v(ch2cl2)＝13:1)，收集得到墨綠固體lyso-nco，1.14g，產(chǎn)率為76.2％。

m.p.145.2-147.6℃.ft-ir(kbr,cm^-1):2884,2807,2207,1610,1512,1360,1130.¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ(ppm)8.22(s,2h),7.60(d,j＝8.5hz,2h),7.46(d,j＝8.7hz,4h),7.39(d,j＝8.5hz,2h),6.69(d,j＝8.4hz,4h),4.47(t,j＝5.6hz,2h,ch2),3.86(t,j＝5.7hz,2h,ch2),3.55(m,6h,ch2),3.41(t,j＝3.1hz,2h,ch2),3.34(s,3h,ch3),2.99(s,12h,ch3)；¹³cnmr(100mhz,cdcl3):δ(ppm)149.86,140.23,132.56,129.43,123.56,122.59,114.88,111.97,110.74,109.16,88.71,88.32,71.81,70.99,70.61,70.53,69.34,58.98,43.45,40.28.hrms(esi,m/z):calcdforc39h41n3o3[m+h]⁺600.3250,found600.3226；anal.calcdforc39h41n3o3:c78.10,h6.89,n7.00；foundc78.05,h6.89,n6.80.

實施例2：雙光子熒光染料lyso-mco和lyso-nco在dmso中的光譜測試

將本發(fā)明雙光子熒光染料lyso-mco和lyso-nco分別溶于dmso中制得1mm的母液，取100μl的該母液于10ml容量瓶中，再用不同溶劑定容，配制成10μm的檢測試劑。從圖1中化合物lyso-mco和lyso-nco的紫外最大吸收峰分別為318和328nm。lyso-mco和lyso-nco分別在318nm、328nm激發(fā)下，lyso-mco和lyso-nco的單光子熒光發(fā)射峰分別位于403nm和445nm(圖1和表1)。化合物lyso-mco發(fā)藍光，化合物lyso-nco發(fā)藍綠光，lyso-nco較lyso-mco約有42nm的紅移。這和紫外吸收光譜的變化規(guī)律一致，隨著末端基團給電子能力的增強，熒光發(fā)射峰的紅移程度也隨之增大。在lyso-mco和lyso-nco濃度為0.5～10μm，可以觀察到lyso-mco和lyso-nco分別在403nm和445nm處的熒光發(fā)射峰強度隨著濃度的變化線性增強(圖3)。

表1化合物lyso-mco和lyso-nco在不同溶劑中的紫外吸收和單光子熒光光譜數(shù)據(jù)

注：a為紫外最大吸收波長；b為單光子熒光發(fā)射光譜的最大發(fā)射波長；c為斯托克斯位移；d為最大摩爾吸光系數(shù)。

實施例3：lyso-mco和lyso-nco的的雙光子吸收性能測試

利用雙光子誘導熒光測量技術(shù)，測試了濃度為10^-3mol/l時目標化合物的雙光子吸收截面，從圖5可以看出，lyso-mco和lyso-nco的最大有效吸收截面(δф)分別是20gm、43gm，雙光子最大激發(fā)波長分別在690nm和700nm。從圖5中可以看出lyso-nco的雙光子吸收性能比lyso-mco更好。在lyso-mco和lyso-nco濃度分別在0.2～1mm、0.01～1mm范圍內(nèi)，可以觀察到lyso-mco和lyso-nco分別在418nm和493nm處的雙光子熒光發(fā)射峰強度隨著濃度的變化線性增強(圖4)。

實施例4：細胞毒性測試

mtt(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)實驗是根據(jù)已報道的文獻，做細胞毒性測試。分別在同一批mcf細胞中加入0，5，10，15μm的熒光染料分子，此條件是在37℃、含5％co2的細胞培養(yǎng)箱中孵育24小時，根據(jù)細胞存活度的公式：細胞存活率％＝od570(樣品)/od570(對照組)×100，可算得細胞存活率(圖6)。從圖6中我們可以看出，染料lyso-mco和lyso-nco的濃度為10μm時，細胞存活率分別為83％、88％左右，當二者的濃度達到15μm時，細胞存活率仍然分別有約80％、85％，說明了本發(fā)明熒光染料分子的細胞毒性小，因此可以用來做細胞檢測及跟蹤溶酶體。

實施例4：光穩(wěn)定性測試

mcf細胞由deme(invitrogen)培養(yǎng)液培養(yǎng)，成像前一天，mcf細胞放于激光共聚焦皿中，成像時mcf細胞分別和2μm的熒光染料lyso-mco和lyso-nco的dmso溶液于37℃、含5％co2的細胞培養(yǎng)箱中孵育12min，用中性的pbs緩沖溶液洗滌3次后，再往培養(yǎng)皿中分別加入0.5μm商品化溶酶體染色劑lysosome@trackerred溶液繼續(xù)孵育12min，用中性的pbs緩沖溶液洗滌3次。用雙光子熒光共聚焦成像，設(shè)置綠色通道tracker1，激發(fā)波長為690nm，發(fā)射波段為380～420nm，這個通道用來接受染料分子lyso-mco在不同時間點(0-20min)發(fā)射的熒光。在相同測試條件下，重設(shè)綠色通道tracker1，激發(fā)波長為700nm，發(fā)射波段為425～465nm，這個通道用來接受染料分子lyso-mco在不同時間點(0-20min)發(fā)射的熒光。設(shè)置紅色通道tracker2，激發(fā)波長為577nm，發(fā)射波長為580-600nm，這個通道用來接收商品化溶酶體染色劑lysosome@trackerred發(fā)射的熒光。從圖10和11可以看出，熒光染料lyso-mco和lyso-nco的最長觀察時間皆為20min，在10min時，商品化溶酶體染色劑lysosome@trackerred的熒光發(fā)射強度幾乎降低為0，而熒光染料lyso-mco和lyso-nco的熒光強度還有70％左右，這表明熒光染料lyso-mco和lyso-nco的光穩(wěn)定性遠勝于lysosome@trackerred。

實施例5：細胞溶酶體定位測試

mcf細胞由deme(invitrogen)培養(yǎng)液培養(yǎng)，成像前一天，mcf細胞放于激光共聚焦皿中，成像時mcf細胞分別和2μm的熒光染料lyso-mco和lyso-nco的dmso溶液于37℃、含5％co2的細胞培養(yǎng)箱中孵育12min，用中性的pbs緩沖溶液洗滌3次后，再往培養(yǎng)皿中分別加入0.5μm商品化溶酶體染色劑lysosome@trackerred溶液繼續(xù)孵育12min，用中性的pbs緩沖溶液洗滌3次。用雙光子熒光共聚焦成像，設(shè)置綠色通道tracker1，激發(fā)波長為690nm，發(fā)射波段為380～420nm，這個通道用來接受染料分子lyso-mco發(fā)射的熒光。設(shè)置紅色通道tracker2，激發(fā)波長為577nm，發(fā)射波長為580-600nm，這個通道用來接收商品化溶酶體染色劑lysosome@trackerred發(fā)射的熒光。在相同測試條件下，重設(shè)綠色通道tracker1，激發(fā)波長為700nm，發(fā)射波段為425～465nm，這個通道用來接受染料分子lyso-mco發(fā)射的熒光。從圖12可以看出，熒光染料lyso-mco和lyso-nco的綠色通道與商品化溶酶體染色劑lysosome@trackerred的紅色通道之間圖像重疊效果很好，并得到了很高的位置重合系數(shù)(定位系數(shù)分別為0.9475和0.9398)。這一結(jié)果表明：熒光染料lyso-mco和lyso-nco能夠成功地選擇性定位細胞中的溶酶體。