本發(fā)明屬于中藥制劑檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種中藥制劑的指紋圖譜構(gòu)建方法，具體涉及一種消痛貼膏藥粉或膏或提取物的指紋圖譜質(zhì)量檢測方法。
背景技術(shù)：
：消痛貼膏為西藏奇正藏藥股份有限公司生產(chǎn)的藏成藥，該藥采用中國青藏高原特有的天然藥物，經(jīng)特殊低溫真空凍干工藝精制而成，主要功能為活血化瘀、消腫止痛，用于急慢性挫傷、跌打瘀傷、骨質(zhì)增生、風濕及類風濕疼痛，以其卓越的功效享譽國內(nèi)外，位列中國特有的精品藏藥之首。目前，消痛貼膏的質(zhì)量控制指標除了測定獨一味的含量外，還對獨一味、姜黃進行了薄層鑒別，這樣雖能控制消痛貼膏的質(zhì)量，但無法全面掌控質(zhì)量狀況。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握的消痛貼膏指紋圖譜質(zhì)量檢測方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種消痛貼膏指紋圖譜質(zhì)量檢測方法，具體為：1）取消痛貼膏藥芯袋內(nèi)容物粉末0.8g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積百分比為70%的甲醇溶液25ml，密塞，稱定重量，加熱回流60分鐘，自然冷卻至室溫，再稱定重量，用體積百分比為70%的甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，得供試品溶液；所用消痛貼膏內(nèi)容物粉末可以是組方制備的各種貼膏劑，也可以是按照組方制備的提取物或用原料直接制備的中藥細粉或者按照組方制備各種口服臨床劑型，如片劑、膠囊、顆粒、緩釋制劑等。2）梯度洗脫流動相：十八烷基鍵和硅膠為填充劑；用watersxselecttmhsst3色譜柱，5μm，4.6mm×250mm；流動相：a相為蒸餾水，b相為乙腈；梯度洗脫：0→60min，流速1.00ml/min，a相90%，b相10%；60→80min，流速1.00ml/min，a相70%→40%，b相30%→60%；80→120min，流速1.00ml/min，a相40%→20%，b相60%→80%；120→125min，流速1.00ml/min，a相90%，b相10%；檢測波長235nm，柱溫25℃，進樣量10μl；理論塔板數(shù)按山梔苷甲酯峰計，應不低于6000；3）建立標準藥物圖譜選取24批不同批次的消痛貼膏藥物，根據(jù)步驟1）和步驟2）進行高效液相色譜分析，獲得每個批次藥物的色圖譜，如圖1，該色譜圖經(jīng)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012年版本）處理分析，得高效液相色譜指紋圖譜的共有特征對照圖譜峰圖，如圖2，根據(jù)分離度和樣品的重現(xiàn)性從該特征對照圖譜峰圖中選取共有峰中的29個峰，作為特征峰；該29個特征峰的峰面積總和占總的峰面積的98%以上；其中，4號峰：保留時間8.9min，為山梔苷甲酯峰；9號峰：保留時間為23.6min，為8-o-乙酰山梔苷甲酯峰；4）指紋圖譜的質(zhì)量控制根據(jù)步驟1）和步驟2）獲取待檢測樣品的指紋圖譜，采用中藥指紋圖譜計算機輔助相似度評價軟件（國家藥典委員會）將待檢測樣品的共有特征對照圖譜峰圖與步驟3）中得到的特征對照圖譜峰圖進行比較，以29個共有峰計算得到的相似度不小于0.8。本發(fā)明質(zhì)量檢測方法采用樣品處理方法和色譜條件，利用二極管陣列檢測器的多波長同時檢測能力建立消痛貼膏藥物（藥粉、藥膏或藥物提取物）的指紋圖譜，用作消痛貼膏藥物質(zhì)量檢測，能從色譜的整體面貌上把握消痛貼膏的質(zhì)量情況，可作為消痛貼膏質(zhì)量控制的指標。使消痛貼膏的質(zhì)量控制技術(shù)更加完善、科學，并對今后的標準化生產(chǎn)提供了可利用的質(zhì)量控制模式。該檢測方法具有簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握的特點。附圖說明圖1是本發(fā)明檢測方法中對24批消痛貼膏進樣高效液相色譜儀分析，獲得的色譜圖。圖2是對圖1所示色譜圖用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012年版本）處理分析，獲得的消痛貼膏高效液相色譜指紋圖譜的共有特征對照圖譜峰圖。圖3是標準品山梔苷甲酯和8-o-乙酰山梔苷甲酯所配制的標準品容易色譜圖。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細說明。實施例1成品、試劑和設備的準備：成品：消痛貼膏藥芯袋內(nèi)容物粉末來源：甘肅奇正藏藥有限公司試劑：乙腈（色譜純）來源：色譜純：乙腈，色譜純：水，分析純：甲醇，儀器：waters2695高效液相色譜儀，二極管陣列（pda）檢測器，empower2操作系統(tǒng)。）制備供試品溶液：取約0.8g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液25ml，密塞，稱定重量，加熱回流60分鐘，放冷，再稱定重量，用70%甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，得樣品溶液；2）消痛貼膏指紋圖譜的建立方法：2.1色譜條件高效液相色譜儀waters2695/2998，watersxselecttmhsst3色譜柱，5μm，4.6mm×250mm。流動相：a：蒸餾水；b：乙腈，梯度洗脫。進樣量10μl，檢測波長235nm；柱溫25℃。梯度洗脫如下：時間(min)流速(ml/min)a(%)b(%)0→601.00901060→801.0070→4030→6080→1201.0040→2060→80120→1251.0090102.3方法學考察2.3.1檢測波長的選擇消痛貼膏收載于《中國藥典》2015年版一部，其含量測定成份選取了山梔苷甲酯和8-o-乙酰山梔苷甲酯（這兩種成份是消痛貼膏中一味藥材的有效成分，《中國藥典》在該藥材和消痛貼膏含量測定項下均選用這兩種作為指標成份），檢測波長為235nm。在該波長下，兩組成份穩(wěn)定，重現(xiàn)性高，故在做高效液相色譜指紋圖譜時選取235nm波長為檢測波長。2.3.2流動相及柱溫的確定實驗表明使用空調(diào)控制室溫，在22～26℃的室溫條件下，色譜峰的保留時間沒有明顯的變化，經(jīng)5次在該溫度范圍內(nèi)的測試，結(jié)果顯示色譜峰的保留時間、峰高、峰面積數(shù)據(jù)的rsd均小于1.2%，色譜柱在25℃條件下的測試結(jié)果是可靠的，故選取25℃作為柱溫控制值。經(jīng)采用不同的流動相梯度洗脫，本發(fā)明檢測方法中所提供的梯度是最佳方案，尤其是方法開始的最初20min以1ml/min的流速進行洗脫可使物質(zhì)得到較好的分離，滿足測試的需要。2.3.3穩(wěn)定性考察：取供試品溶液測試品分別在0h，6h，12h，24h，36h，48h這六個時間點進行測試，考察色譜峰保留時間與峰面積的一致性，各指紋圖譜特征峰的保留時間與峰面積的rsd均小于1.1%。2.3.4重復性實驗取消痛貼膏5份，制作供試品，分別進樣。結(jié)果顯示各指紋峰的保留時間、峰高及峰面積的rsd均小于1.2%。2.4高效液相色譜圖中選作特征指紋峰的保留時間及編號2.4.1按照色譜條件和供試品制備方法，對24批消痛貼膏進樣高效液相色譜儀分析，對所獲得的如圖1所示的色譜圖經(jīng)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012年版本）處理分析，獲得圖2所示的消痛貼膏高效液相色譜指紋圖譜的共有特征對照圖譜峰圖，根據(jù)分離度、樣品的重現(xiàn)性選取選取29個特征峰，該29個特征峰的保留時間見表1，從表1可以看出：4號峰的保留時間為8.9min，9號峰的保留時間為23.6min。圖2中的4號峰為山梔苷甲酯峰，9號峰為8-o-乙酰山梔苷甲酯峰；而標準品山梔苷甲酯、8-o-乙酰山梔苷甲酯的所配制的標準品溶液色譜圖，見圖3。圖2是消痛貼膏供試品形成的共有峰，屬于消痛貼膏樣品色譜圖。而圖3是標準品山梔苷甲酯、8-o-乙酰山梔苷甲酯的所配制的標準品溶液色譜圖，只代表本次配制的標準溶液，與消痛貼膏樣品峰沒有直接關(guān)系；標準溶液中4號峰和9號峰的高度，直接取決于標準品的稱樣量。表1消痛貼膏對照圖譜編號、保留時間2.4.2對24批消痛貼膏高效液相色譜指紋圖譜相似度評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相似度均大于0.95，具體結(jié)果見表2。表224批消痛貼膏高效液相色譜指紋圖譜相似度s1s2s3s4s5s6s7s8s9s10s11s12s13s14s15s16s17s18s19s20s21s22s23s24對照指紋圖譜s110.9780.9240.9250.9410.9430.9280.90610.9780.9240.9250.9410.9430.9280.90610.9780.9240.9250.9410.9430.9280.9060.974s20.97810.9640.9630.9090.910.9010.8750.97810.9640.9630.9090.910.9010.8750.97810.9640.9630.9090.910.9010.8750.973s30.9240.96410.9950.9040.9050.9020.8930.9240.96410.9950.9040.9050.9020.8930.9240.96410.9950.9040.9050.9020.8930.971s40.9250.9630.99510.9070.9070.9030.890.9250.9630.99510.9070.9070.9030.890.9250.9630.99510.9070.9070.9030.890.971s50.9410.9090.9040.90710.9960.9830.9640.9410.9090.9040.90710.9960.9830.9640.9410.9090.9040.90710.9960.9830.9640.974s60.9430.910.9050.9070.99610.9820.9640.9430.910.9050.9070.99610.9820.9640.9430.910.9050.9070.99610.9820.9640.974s70.9280.9010.9020.9030.9830.98210.9560.9280.9010.9020.9030.9830.98210.9560.9280.9010.9020.9030.9830.98210.9560.967s80.9060.8750.8930.890.9640.9640.95610.9060.8750.8930.890.9640.9640.95610.9060.8750.8930.890.9640.9640.95610.953s910.9780.9240.9250.9410.9430.9280.90610.9780.9240.9250.9410.9430.9280.90610.9780.9240.9250.9410.9430.9280.9060.974s100.97810.9640.9630.9090.910.9010.8750.97810.9640.9630.9090.910.9010.8750.97810.9640.9630.9090.910.9010.8750.973s110.9240.96410.9950.9040.9050.9020.8930.9240.96410.9950.9040.9050.9020.8930.9240.96410.9950.9040.9050.9020.8930.971s120.9250.9630.99510.9070.9070.9030.890.9250.9630.99510.9070.9070.9030.890.9250.9630.99510.9070.9070.9030.890.971s130.9410.9090.9040.90710.9960.9830.9640.9410.9090.9040.90710.9960.9830.9640.9410.9090.9040.90710.9960.9830.9640.974s140.9430.910.9050.9070.99610.9820.9640.9430.910.9050.9070.99610.9820.9640.9430.910.9050.9070.99610.9820.9640.974s150.9280.9010.9020.9030.9830.98210.9560.9280.9010.9020.9030.9830.98210.9560.9280.9010.9020.9030.9830.98210.9560.967s160.9060.8750.8930.890.9640.9640.95610.9060.8750.8930.890.9640.9640.95610.9060.8750.8930.890.9640.9640.95610.953s1710.9780.9240.9250.9410.9430.9280.90610.9780.9240.9250.9410.9430.9280.90610.9780.9240.9250.9410.9430.9280.9060.974s180.97810.9640.9630.9090.910.9010.8750.97810.9640.9630.9090.910.9010.8750.97810.9640.9630.9090.910.9010.8750.973s190.9240.96410.9950.9040.9050.9020.8930.9240.96410.9950.9040.9050.9020.8930.9240.96410.9950.9040.9050.9020.8930.971s200.9250.9630.99510.9070.9070.9030.890.9250.9630.99510.9070.9070.9030.890.9250.9630.99510.9070.9070.9030.890.971s210.9410.9090.9040.90710.9960.9830.9640.9410.9090.9040.90710.9960.9830.9640.9410.9090.9040.90710.9960.9830.9640.974s220.9430.910.9050.9070.99610.9820.9640.9430.910.9050.9070.99610.9820.9640.9430.910.9050.9070.99610.9820.9640.974s230.9280.9010.9020.9030.9830.98210.9560.9280.9010.9020.9030.9830.98210.9560.9280.9010.9020.9030.9830.98210.9560.967s240.9060.8750.8930.890.9640.9640.95610.9060.8750.8930.890.9640.9640.95610.9060.8750.8930.890.9640.9640.95610.953對照指紋圖譜0.9740.9730.9710.9710.9740.9740.9670.9530.9740.9730.9710.9710.9740.9740.9670.9530.9740.9730.9710.9710.9740.9740.9670.95311、消痛貼膏指紋圖譜檢測方法為：取消痛貼膏藥芯袋內(nèi)容物粉末約0.8g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液25ml，密塞，稱定重量，加熱回流60分鐘，放冷，再稱定重量，用70%甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液,即得，作為供試品溶液。色譜條件為：高效液相色譜儀waters2695/2998，watersxselecttmhsst3色譜柱，5um，4.6mm×250mm。流動相：a相為水；b相為乙腈，梯度洗脫。進樣量10ul，檢測波長235nm；柱溫25℃。梯度洗脫如下：時間(min)流速(ml/min)a(%)b(%)0→601.00901060→801.0070→4030→6080→1201.0040→2060→80120→1251.009010測定法：將供試品溶液注入高效液相色譜儀即得。當前第1頁12