發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及原位鄰近測(cè)定法，具體而言使用鄰近誘導(dǎo)的化學(xué)連接反應(yīng)以形成共價(jià)鍵和隨后轉(zhuǎn)移可檢測(cè)的半抗原的鄰近測(cè)定法。本發(fā)明的特征還在于蛋白-蛋白相互作用、融合蛋白和蛋白翻譯后修飾的檢測(cè)。

發(fā)明背景

鄰近測(cè)定法用于評(píng)價(jià)兩個(gè)特定蛋白或其部分是否緊密鄰近，例如彼此結(jié)合的蛋白，緊密鄰近定位的融合蛋白和/或蛋白。一種被稱為鄰近連接測(cè)定法(pla)的這種測(cè)定法的特征在于與目標(biāo)靶標(biāo)結(jié)合的兩個(gè)抗體(在不同物種中產(chǎn)生)(參見naturemethods3,995-1000(2006))。然后作為具有連接的獨(dú)特寡核苷酸鏈的物種特異性二抗的pla探針與適當(dāng)?shù)囊豢菇Y(jié)合。在靶標(biāo)密切鄰近的情況下，pla探針的寡核苷酸鏈可與額外的ssdna和dna連接酶相互作用，使得它們可以經(jīng)由滾環(huán)循環(huán)擴(kuò)增(rca)循環(huán)和擴(kuò)增。當(dāng)使用高度進(jìn)行性的dna聚合酶諸如phi29dna聚合酶時(shí)，環(huán)狀dna模板可以復(fù)制長(zhǎng)數(shù)百至數(shù)千倍，因此產(chǎn)生長(zhǎng)度為幾百納米至微米的ssdna分子(參見angewandtechemieinternationaledition,2008,47,6330-6337)。擴(kuò)增后，可以經(jīng)由檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)復(fù)制的dna。因此，可見信號(hào)表明目標(biāo)靶標(biāo)是緊密鄰近的。這些測(cè)定法的特征在于使用幾種dna-抗體綴合物以及酶諸如dna連接酶和dna聚合酶。這些綴合物和酶可能是昂貴的，并且它們還需要嚴(yán)格的測(cè)定條件以便實(shí)現(xiàn)正常的功能和穩(wěn)定性。此外，該方法生成擴(kuò)增的dna序列，盡管容易檢測(cè)，但無(wú)法保持與所檢測(cè)的鄰近事件共定位。

用于研究蛋白-蛋白相互作用的另一種測(cè)定法包括雙重結(jié)合劑(db)測(cè)定法，其利用通過柔性接頭連接的具有快速解離速率動(dòng)力學(xué)的兩個(gè)fab片段組成的雙特異性檢測(cè)劑(developmentofbispecificmoleculesfortheinsitudetectionofprotein-proteininteractionsandproteinphosphorylation,chemistry&biology21,1–12,march20,2014)。原則上，因?yàn)殡p重結(jié)合劑包含具有快速解離速率動(dòng)力學(xué)的fab片段，所以如果僅fab片段之一與其表位結(jié)合，則洗掉雙重結(jié)合劑(雙重結(jié)合劑的兩個(gè)fab片段的同時(shí)協(xié)同結(jié)合防止雙重結(jié)合劑的解離并導(dǎo)致陽(yáng)性染色/可見性)。這些方法需要具體開發(fā)具有特異性結(jié)合動(dòng)力學(xué)的fab片段，這使得將其實(shí)現(xiàn)至目標(biāo)靶標(biāo)的寬度不合理。

另一種方法，grossman等人，描述了通過將報(bào)告基團(tuán)從供體探針轉(zhuǎn)移至附近的接受探針來(lái)檢測(cè)鄰近靶核酸的測(cè)定法。探針被設(shè)計(jì)成與靶核酸的互補(bǔ)區(qū)段相鄰地退火。探針對(duì)的退火(密切鄰近)允許發(fā)生反應(yīng)(例如，硫基交換反應(yīng)等)，這便于報(bào)告基團(tuán)(例如熒光猝滅劑)的轉(zhuǎn)移(參見grossman等人,angew.chem.int.ed.2008,47,7119-7122)。

根據(jù)另一種方法，pct公開申請(qǐng)wo2014/139980(對(duì)于與鄰近測(cè)定法和用于實(shí)現(xiàn)其的工具相關(guān)的公開內(nèi)容，其以其整體通過引用并入本文)描述了生物素連接酶底物和酶用于進(jìn)行鄰近測(cè)定的用途。該方法提供了靶分子和鄰近度的檢測(cè)，同時(shí)維持樣品的細(xì)胞環(huán)境。使用生物素連接酶諸如來(lái)自大腸桿菌的酶和用于該酶的肽底物諸如氨基酸底物提供了ffpe樣品中的蛋白-蛋白相互作用的靈敏和特異性檢測(cè)。因?yàn)樯锼剡B接酶可以在生物素存在的情況下有效地生物素化適當(dāng)?shù)碾牡孜?，并且僅當(dāng)酶使得與肽底物物理接觸時(shí)才可發(fā)生反應(yīng)，所以生物素連接酶和底物可以分別與分別識(shí)別目標(biāo)靶標(biāo)的兩種抗體綴合。

發(fā)明概述

本發(fā)明的特征在于用于檢測(cè)靶標(biāo)鄰近的方法。如本文更包括性地描述，本發(fā)明的特征在于用于檢測(cè)靶標(biāo)鄰近的方法，其中(i)化學(xué)反應(yīng)步驟在一對(duì)修飾的特異性結(jié)合分子(例如，兩個(gè)抗體，其各自與適于當(dāng)非常接近時(shí)且在外部刺激后形成共價(jià)鍵(化學(xué)連接)的橋組分綴合，所述橋組分之一還包含可切割鍵和可檢測(cè)部分)之間形成共價(jià)鍵，和(ii)隨后/分開的切割步驟切割最初與可檢測(cè)部分締合的橋組分，使得可檢測(cè)部分被最終轉(zhuǎn)移至相對(duì)的特異性結(jié)合分子?？蓹z測(cè)部分的檢測(cè)表明靶標(biāo)鄰近，因?yàn)橥ㄟ^洗滌將從樣品除去由于鄰近不足而導(dǎo)致的未被接合于化學(xué)鍵形成中的可檢測(cè)部分。

本發(fā)明的方法與顯色和熒光檢測(cè)系統(tǒng)相容，并且所述方法可以手動(dòng)地或在自動(dòng)化系統(tǒng)中進(jìn)行。因?yàn)楸景l(fā)明的方法的特征不在于使用酶諸如dna連接酶或dna聚合酶，所以所述方法使用較少用于檢測(cè)靶標(biāo)鄰近的靈敏和昂貴的試劑，和相對(duì)于測(cè)定條件可能具有更多的靈活性和耐受性的試劑。

重要的是，本發(fā)明的特異性結(jié)合分子(例如，抗體)可以與一個(gè)或多個(gè)(例如，二、三、四、五、6、7、8、9、10或更多個(gè))橋組分綴合。這可以是有利的，因?yàn)槎鄠€(gè)橋組分可以提供增強(qiáng)(例如較暗)的信號(hào)以及實(shí)現(xiàn)信號(hào)的更大可能性。

本發(fā)明的用途的多樣性是令人驚訝的。例如，包括的實(shí)例表明本發(fā)明可用于檢測(cè)蛋白-蛋白相互作用和翻譯后修飾(ptm)狀態(tài)。因此，提供了用于檢測(cè)各種鄰近的生物學(xué)重要的靶標(biāo)的方法，諸如蛋白二聚化、蛋白融合、締合，和ptm，包括磷酸化、糖基化、泛素化、sumo化、亞硝基化、甲基化、乙?；⒅?或等。

本發(fā)明的范圍內(nèi)包括本文描述的任何特征或特征組合，條件是以任何這種組合包括的特征不是相互不一致的，如從上下文、本說(shuō)明書和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識(shí)將顯而易見。在下面的詳述和權(quán)利要求中，本發(fā)明的額外優(yōu)點(diǎn)和方面是顯而易見的。

例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括使第一修飾的結(jié)合分子與第一靶標(biāo)結(jié)合以形成第一復(fù)合物，和使第二修飾的結(jié)合分子與第二靶標(biāo)結(jié)合以形成第二復(fù)合物。

第一修飾的結(jié)合分子可以包含可切割橋組分(或多于一個(gè)可切割橋組分)，其中可切割橋組分包含切割位點(diǎn)(例如，二硫鍵、鄰位二醇、鄰位羥胺、硝基苯衍生物等)、可檢測(cè)部分(例如，一個(gè)、至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)等)和第一化學(xué)連接基團(tuán)(例如疊氮化物、硫酯、四唑環(huán)等)。切割位點(diǎn)比可檢測(cè)部分和第一化學(xué)連接基團(tuán)更鄰近于第一修飾的結(jié)合分子。第一化學(xué)連接基團(tuán)位于可切割橋組分的末端處。第一化學(xué)連接基團(tuán)在生理?xiàng)l件下是穩(wěn)定的。

第二修飾的結(jié)合分子可以包含不可切割橋組分(或多于一個(gè)不可切割橋組分)，其中不可切割橋組分包含第二化學(xué)連接基團(tuán)(例如，炔基、鹵素基團(tuán)(-cl、-br、-i等)、烯基等)。第二化學(xué)連接基團(tuán)位于不可切割橋組分的末端處。第二化學(xué)連接基團(tuán)在生理?xiàng)l件下是穩(wěn)定的?；瘜W(xué)連接基團(tuán)在第一和第二修飾的結(jié)合分子之間是可互換的。

在一些實(shí)施方案中，第一修飾的結(jié)合分子包含第一抗體，且第二修飾的結(jié)合分子包含第二抗體。在一些實(shí)施方案中，第一修飾的結(jié)合分子包含第一一抗和第一二抗，且第二修飾的結(jié)合分子包含第二一抗和第二二抗；第一二抗對(duì)第一一抗、而非第二一抗是特異性的，且第二二抗對(duì)第二一抗、而非第一一抗是特異性的；且所述可切割橋組分與第一二抗結(jié)合，且所述不可切割橋組分與第二二抗結(jié)合。

所述方法還可以包括將第一化學(xué)連接基團(tuán)與第二化學(xué)連接基團(tuán)共價(jià)連接以形成共價(jià)鍵合的單元，切割可切割橋組分的切割位點(diǎn)，使得共價(jià)鍵合的單元與第二修飾的結(jié)合分子、而非第一修飾的結(jié)合分子結(jié)合，去除不是共價(jià)鍵合的單元的一部分的可切割橋組分(例如洗滌)，和使可檢測(cè)部分可見(例如經(jīng)由顯色系統(tǒng)、熒光系統(tǒng)等)。

本發(fā)明的方法可以包括使第一一抗與第一靶標(biāo)結(jié)合且使第二一抗與第二個(gè)靶標(biāo)結(jié)合；然后使第一二抗與第一一抗結(jié)合，且使第二二抗與第二一抗結(jié)合，其中第一二抗對(duì)第一一抗、而非第二一抗是特異性的，且第二二抗對(duì)第二一抗、而非第一一抗是特異性的。第一二抗可以是如上所述的第一修飾的結(jié)合分子，例如包含如前所述的可切割橋組分。第二二抗可以是如上所述的第二修飾的結(jié)合分子，例如包含如上所述的不可切割橋組分。所述方法還可以包括將第一化學(xué)連接基團(tuán)與匹配的第二化學(xué)連接基團(tuán)共價(jià)連接以形成共價(jià)鍵合的單元；切割可切割橋組分的切割位點(diǎn)，使得共價(jià)鍵合的單元與第二二抗、而非第一二抗結(jié)合；去除不是共價(jià)鍵合的單元的一部分的可切割橋組分；和使可檢測(cè)部分可見。

在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分的可見性表明第一靶標(biāo)和第二靶標(biāo)相距不超過60nm，相距不超過50nm，相距不超過40nm，相距不超過30nm，相距不超過25nm，相距不超過15nm，相距不超過10nm，相距不超過5nm等。

本發(fā)明的方法可以手動(dòng)或使用自動(dòng)化染色機(jī)進(jìn)行。本發(fā)明的一個(gè)方面是用于進(jìn)行測(cè)定的試劑和試劑盒是足夠穩(wěn)定的，使得它們可以用于自動(dòng)化染色儀器上。例如，所述試劑可配置為在室溫下具有大于1個(gè)月的保質(zhì)期。

在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分包含非內(nèi)源化合物，肽標(biāo)簽(例如衍生自血凝素的ha標(biāo)簽、flag標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、v5標(biāo)簽、e-標(biāo)簽、vsv標(biāo)簽等)或寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，可切割橋組分包含x個(gè)聚乙二醇基團(tuán)(pegx)，其中x≥1。在一些實(shí)施方案中，不可切割橋組分包含x個(gè)聚乙二醇基團(tuán)(pegx)，其中x≥1。

在一些實(shí)施方案中，將第一化學(xué)連接基團(tuán)與第二化學(xué)連接基團(tuán)共價(jià)連接的步驟包括使樣品與催化劑(例如用于引發(fā)huisgen1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)的銅(i))、紫外光或脫保護(hù)條件(例如肼(n2h4))接觸。在一些實(shí)施方案中，化學(xué)連接基團(tuán)適于在少于兩小時(shí)內(nèi)形成共價(jià)鍵合的單元。

在一些實(shí)施方案中，切割可切割橋組分的切割位點(diǎn)的步驟包括使樣品與還原劑(例如二硫蘇糖醇(dtt)、β-巰基乙醇(bme)或三(2-羧乙基)膦)(tcep))、高碘酸鈉(naio4)或紫外光接觸。在一些實(shí)施方案中，切割位點(diǎn)包含二硫鍵、鄰位二醇、鄰位羥胺或硝基苯基衍生物。

本發(fā)明的一個(gè)方面是測(cè)定可以在商業(yè)上合理和化學(xué)穩(wěn)健的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行(例如，時(shí)間足夠低，使得水解和熱降解的不利影響不會(huì)影響測(cè)定性能-更短時(shí)間的主要原因更多是由于提高的測(cè)試效率)。在一些實(shí)施方案中，化學(xué)連接基團(tuán)適于在少于4小時(shí)、3小時(shí)、2小時(shí)或1小時(shí)內(nèi)形成共價(jià)鍵合的單元。

本發(fā)明的特征還在于用于檢測(cè)靶標(biāo)接近的組合物，例如用于本文所述的方法中的組合物。例如，本發(fā)明的特征在于包含如本文所述的可切割橋組分的組合物。組合物還可以包含與可切割橋組分綴合的抗體。在一些實(shí)施方案中，所述抗體與至少一個(gè)可切割橋組分綴合。在一些實(shí)施方案中，所述抗體與至少兩個(gè)可切割橋組分、至少五個(gè)可切割橋組分、至少十個(gè)可切割橋組分或至少十五個(gè)可切割橋組分綴合。本發(fā)明的特征還在于包含如本文所述的不可切割橋組分的組合物。組合物還可以包含與不可切割橋組分綴合的抗體。在一些實(shí)施方案中，所述抗體與至少一個(gè)不可切割橋組分綴合。在一些實(shí)施方案中，所述抗體與至少兩個(gè)不可切割橋組分、至少五個(gè)不可切割橋組分、至少十個(gè)不可切割橋組分或至少十五個(gè)不可切割橋組分綴合。

還公開了用于實(shí)施所公開的實(shí)施方案的試劑盒。例如，本發(fā)明的特征在于包含如本文所述的第一修飾的結(jié)合分子和/或第二修飾的結(jié)合分子的試劑盒。所述試劑盒還可以包含有效地將第一化學(xué)連接基團(tuán)與第二化學(xué)連接基團(tuán)共價(jià)連接以形成共價(jià)鍵合的單元的催化劑。在一些實(shí)施方案中，化學(xué)連接基團(tuán)適于在少于4小時(shí)、3小時(shí)、2小時(shí)或1小時(shí)內(nèi)形成共價(jià)鍵合的單元。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含用于切割可切割橋組分的切割位點(diǎn)的試劑。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含用于使可檢測(cè)部分可見的系統(tǒng)。

在一些實(shí)施方案中，第一靶標(biāo)包含靶蛋白，且第二靶標(biāo)包含翻譯后修飾(例如磷酸化、泛素化、糖基化、泛素化等)。因此，本發(fā)明的測(cè)定可用于原位檢測(cè)具有翻譯后修飾(例如磷酸化、泛素化、糖基化、泛素化等)的靶蛋白。

附圖簡(jiǎn)述

圖1a-圖1c是修飾的特異性結(jié)合部分的示意圖。圖1a和圖1b顯示特異性結(jié)合部分和可切割橋組分的示意圖。所述可切割橋組分包含切割位點(diǎn)(可切割接頭)、可檢測(cè)部分(半抗原)和化學(xué)連接基團(tuán)(cl)。半抗原(可檢測(cè)部分)和化學(xué)連接基團(tuán)可以是直鏈或支鏈排列的?？梢栽谒腥N官能團(tuán)間使用接頭?？汕懈罱宇^比其他兩個(gè)基團(tuán)更鄰近于特異性結(jié)合部分。圖1c顯示特異性結(jié)合部分(例如抗體)和不可切割橋組分。所述可切割橋組分包含接頭和化學(xué)連接基團(tuán)(cl)。

圖2顯示化學(xué)連接反應(yīng)性基團(tuán)(cl-a和cl-b)的非限制性示例性結(jié)構(gòu)和形成共價(jià)鍵的相應(yīng)條件。

圖3是顯示參與根據(jù)本公開的鄰近測(cè)定法的概念和主要步驟的示意圖。頂部顯示系統(tǒng)中的鄰近測(cè)定法，其中兩個(gè)目標(biāo)靶標(biāo)密切鄰近。底部顯示系統(tǒng)中的鄰近測(cè)定法，其中兩個(gè)目標(biāo)靶標(biāo)不密切鄰近。本發(fā)明不限于圖3中所述的組分和步驟。

圖4是顯示包含具有可切割橋組分的抗體的抗體綴合物的非限制性實(shí)例(上圖)和包含不可切割橋組分的抗體綴合物的非限制性實(shí)例(底圖)的示意圖。

圖5顯示替代可切割橋組分(三官能分子)，其中可切割橋組分包含支架，并且可檢測(cè)部分/半抗原與支架結(jié)合。

圖6是顯示使用本發(fā)明的測(cè)定法檢測(cè)蛋白翻譯后修飾(ptm)、諸如磷酸化或泛素化的示意圖。

圖7是顯示山羊抗兔(gar)與可切割橋組分的綴合物a的合成的示意圖，所述可切割橋組分包含peg8接頭、二硫鍵、血凝素標(biāo)簽(ha-標(biāo)簽)作為半抗原以及疊氮基(n3)。

圖8是顯示圖7的gar-ha肽綴合物的純化的代表性sec色譜圖。

圖9是顯示使用市售dab顯色檢測(cè)系統(tǒng)使用ihc方法檢測(cè)可檢測(cè)部分/半抗原h(huán)a-標(biāo)簽的顯微照片。

圖10是顯示用于檢測(cè)可檢測(cè)部分/半抗原的鄰近測(cè)定和隨后的免疫組織化學(xué)測(cè)定法，以及使用熒光團(tuán)-酪酰胺(cy5-tyr)檢測(cè)方法的替代檢測(cè)方法的步驟的流程圖。

圖11是顯示用于確定用于從綴合物a完全切割ha-標(biāo)簽的條件的步驟的流程圖(參見實(shí)施例3)。

圖12a-12d是顯微照片，其顯示如實(shí)施例3中所述使用各種濃度的二硫蘇糖醇(ddt)、無(wú)dtt(圖12a)、50mmdtt(圖12b)、75mmdtt(圖12c)和100mmdtt(24分鐘dtt孵育，使用半抗原-酪酰胺擴(kuò)增(hq-tyramp))(圖12d)測(cè)定ki67后染色的扁桃體組織載片，進(jìn)行所述實(shí)施例3以建立足以原位切割的dtt濃度。

圖13a和圖13b是顯微照片，其顯示如實(shí)施例3中所述顯示無(wú)dtt(圖13a)和50mmdtt(24分鐘dtt孵育，使用半抗原-酪酰胺擴(kuò)增(hq-tyramp))(圖13b)的情況下使用可切割橋組分進(jìn)行e-鈣粘蛋白(e-cad)測(cè)定的染色的皮膚組織切片。

圖14a-圖14c是顯示扁桃體切片中cd20的檢測(cè)的顯微照片，其顯示cu(i)/l比率和伴隨染色的影響。圖14a顯示1:5的cu(i)/比率，圖14b顯示1:3的cu(i)/l比率，且圖14c顯示不添加cu(i)的對(duì)照。使用gam-peg4-cch的綴合物中的反應(yīng)性乙炔基(參見實(shí)施例3)。當(dāng)添加cu(i)時(shí)，實(shí)現(xiàn)了cd20的特異性檢測(cè)。當(dāng)省略cu時(shí)，沒有觀察到染色。這表明在gam綴合物中存在反應(yīng)性乙炔官能團(tuán)。

圖15a和15b是顯微照片，其顯示使用商業(yè)dab顯色檢測(cè)用cu(i)(圖15a)和無(wú)cu(i)(圖15b)檢測(cè)正常扁桃體組織切片中的e-鈣粘蛋白(e-cad)/β-聯(lián)蛋白(β-cat)。

圖16a-圖16d是顯微照片，其顯示用市售的半抗原-酪酰胺擴(kuò)增(ventanaoptiview擴(kuò)增試劑盒)檢測(cè)正常扁桃體組織切片中的e-鈣粘蛋白(e-cad)/β-聯(lián)蛋白(β-cat)，其顯示省略小鼠抗β-cat的鄰近測(cè)定法(圖16a)、省略兔抗e-cad的鄰近測(cè)定法(圖16b)、用cu(i)的兔抗e-cad和小鼠抗β-cat鄰近測(cè)定法(圖16c)和排除cu(i)的兔抗e-cad和小鼠抗β-cat鄰近測(cè)定法(圖16d)。

圖17a-圖17d是顯微照片，其顯示用于使用cu(i)和ventanaoptiviewdab以及ventana擴(kuò)增試劑盒檢測(cè)正常扁桃體切片載片中的e-鈣粘蛋白(e-cad)和p120-聯(lián)蛋白(p120)的鄰近的測(cè)定法(圖17a)，且顯示不包括cu(i)的陰性對(duì)照(圖17b)。圖17c和圖17d是切片的顯微照片，其中用如本文所述的鄰近測(cè)定(圖17c)和排除cu(i)的鄰近測(cè)定(圖17d)使用結(jié)合正常扁桃體組織切片中的蛋白的不同表位的小鼠抗ecad和兔抗ecad一抗檢測(cè)e-鈣粘蛋白。

圖18a-圖18d是顯微照片，其顯示用擴(kuò)增檢測(cè)用ventanaoptiviewdab染色的正常皮膚組織切片中的e-鈣粘蛋白(e-cad)/β-聯(lián)蛋白(β-cat)，其中圖18a顯示e-cad和β-cat之間的鄰近測(cè)定，且圖18b是其中排除cu(i)的對(duì)照。圖18c還顯示不同皮膚切片中的e-cad和β-cat之間的鄰近測(cè)定，且圖18d是其中排除cu(i)催化劑的相應(yīng)陰性對(duì)照。

圖19a-圖19c是顯示使用cy5-tyr的正常扁桃體切片中的ecad/β-cat的基于熒光團(tuán)-酪酰胺的檢測(cè)的顯微照片(藍(lán)色=dapi，紅色=用于ecad/β-cat的cy5)。

圖20a-圖20d是顯微照片，其顯示用擴(kuò)增的用ventanaoptiviewdab染色的正常扁桃體組織切片中的cd19/cd21的鄰近測(cè)定。圖20b是圖20a的對(duì)照，其中排除cu(i)。圖20c顯示在正常扁桃體組織中通過使用小鼠抗cd21和兔抗cd21一抗檢測(cè)cd21，且圖20d是圖20c的對(duì)照，其中排除cu(i)。

圖21a-圖21c是顯示用于使用抗her2(克隆4b5)和檢測(cè)磷酸化的抗p-tyr抗體來(lái)檢測(cè)her2磷酸化的鄰近測(cè)定的顯微照片。組織來(lái)自使用dab顯色檢測(cè)的3合1異種移植物載片，其中圖21a顯示僅添加抗her2抗體，圖21b顯示使用抗her2(克隆4b5)和抗p-tyr抗體與cu(i)的鄰近測(cè)定，且圖21c顯示圖21b的對(duì)照，其中排除cu(i)。

圖22是使用如本文所述的測(cè)定法檢測(cè)蛋白的泛素化的示意圖。

圖23a-圖23d是顯示檢測(cè)mcf-7異種移植物中的孕酮受體(pr)的泛素化的顯微照片。mcf-7細(xì)胞是pr陽(yáng)性的。圖23a顯示pr和泛素之間的鄰近測(cè)定。圖23b是沒有cu(i)催化劑的鄰近測(cè)定的對(duì)照。圖23c和圖23d是各自使用市售的ventanaultraviewdab檢測(cè)法檢測(cè)的pr(圖23c)和泛素(圖23d)的標(biāo)準(zhǔn)ihc檢測(cè)。

圖24a-圖24d是顯示檢測(cè)zr-7551異種移植物中的孕酮受體(pr)的泛素化的顯微照片。zr-751細(xì)胞是pr陽(yáng)性的。圖24a顯示pr和泛素之間的鄰近測(cè)定。圖24b是沒有cu(i)催化劑的鄰近測(cè)定的對(duì)照。圖24c和圖24d是各自使用市售的ventanaultraviewdab檢測(cè)法檢測(cè)的pr(圖24c)和泛素(圖24d)的標(biāo)準(zhǔn)ihc檢測(cè)。

圖25a-圖25d是顯微照片，其中圖25a與圖24a相同，除了其顯示劃分為(b)-(d)的區(qū)域，其在圖25b-圖25d的顯微照片中以更高的放大率顯示。更高的放大率更容易顯示泛素化的pr的異質(zhì)性。

圖26a-圖26d是顯示未檢測(cè)到calu-3異種移植物中的孕酮受體(pr)的泛素化的顯微照片。calu-3細(xì)胞是pr陰性的。圖26a顯示缺乏pr和泛素之間的鄰近測(cè)定的信號(hào)。圖26b是沒有cu(i)催化劑的鄰近測(cè)定的對(duì)照。圖26c和圖26d是各自使用市售的ventanaultraviewdab檢測(cè)法檢測(cè)的pr(圖26c)和泛素(圖26d)的標(biāo)準(zhǔn)ihc檢測(cè)。

圖27a-圖27c是顯示檢測(cè)calu-3細(xì)胞中her2的泛素化的顯微照片。calu-3細(xì)胞是her2陽(yáng)性的。圖27a顯示her2和泛素之間的鄰近測(cè)定。圖27b是沒有cu(i)催化劑的鄰近測(cè)定的對(duì)照。圖27c顯示圖27a在更高放大率下的區(qū)域。在calu-3細(xì)胞中檢測(cè)到泛素化的her2。

圖28a-圖28d是顯示使用本發(fā)明的鄰近測(cè)定法檢測(cè)mlh1-pms2異源二聚體的顯微照片。圖28a顯示使用兔抗pms2mab的hela細(xì)胞異種移植物中pms2的標(biāo)準(zhǔn)ihc。圖28b顯示使用小鼠抗mlh1mab的hela細(xì)胞異種移植物中mlh1的ihc。圖28c顯示mlh1-pms2異源二聚體的鄰近測(cè)定，且圖28d是沒有cu(i)催化劑的鄰近測(cè)定的對(duì)照。

優(yōu)選實(shí)施方案的描述

i.術(shù)語(yǔ)

除非另有說(shuō)明，否則技術(shù)術(shù)語(yǔ)根據(jù)常規(guī)用途使用。分子生物學(xué)中常用術(shù)語(yǔ)的定義可見于benjaminlewin,genesv,由oxforduniversitypress出版,1994(isbn0-19-854287-9);kendrew等人(編),theencyclopediaofmolecularbiology,由blackwellscienceltd.出版,1994(isbn0-632-02182-9);和roberta.meyers(編),molecularbiologyandbiotechnology:acomprehensivedeskreference,由vchpublishers,inc.出版,1995(isbn1-56081-569-8)。除非另有解釋，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本公開所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。單數(shù)術(shù)語(yǔ)“一個(gè)/種(a)”、“一個(gè)/種(an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文另有明確指出。類似地，詞語(yǔ)“或”旨在包括“和”，除非上下文另有明確指出。還應(yīng)當(dāng)理解，為核酸或多肽給出的所有堿基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子量值是近似的，并且提供用于描述。盡管與本文所述的方法和材料相似或等效的方法和材料可用于實(shí)施或測(cè)試本公開，但合適的方法和材料在下文中描述。術(shù)語(yǔ)“包含”意指“包括”。

本文提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其他參考文獻(xiàn)都以其整體或者對(duì)于其參考文獻(xiàn)的上下文內(nèi)相關(guān)的該部分通過引用并入本文。所有g(shù)enbank登錄號(hào)通過引用并入本文，因?yàn)樗鼈冊(cè)?011年6月8日出現(xiàn)在數(shù)據(jù)庫(kù)中。在沖突的情況下，將以本說(shuō)明書，包括術(shù)語(yǔ)的解釋，為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)例是說(shuō)明性的，并不旨在進(jìn)行限制。

為了便于綜述本公開的各個(gè)實(shí)施方案，提供了以下特定術(shù)語(yǔ)的解釋：

施用：通過任何有效的途徑向受試者提供或給予試劑，例如組合物。示例性的施用途徑包括但不限于口服、注射(諸如皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和靜脈內(nèi))、舌下、直腸、經(jīng)皮(例如局部)、鼻內(nèi)、陰道和吸入途徑。

試劑：可用于實(shí)現(xiàn)目標(biāo)或結(jié)果的任何物質(zhì)或任何物質(zhì)組合；例如，可用于降低或降低蛋白-蛋白相互作用的物質(zhì)或物質(zhì)組合。在一些實(shí)施方案中，所述試劑是治療劑，諸如用于治療癌癥的治療劑。

抗體：包括至少特異性結(jié)合抗原的表位或其片段的輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區(qū)的多肽配體?？贵w包括完整免疫球蛋白及其本領(lǐng)域眾所周知的變體，諸如fab'、f(ab)'2片段、單鏈fv蛋白(scfv)和二硫化物穩(wěn)定的fv蛋白(dsfv)。scfv蛋白是融合蛋白，其中抗體的輕鏈可變區(qū)和抗體的重鏈可變區(qū)通過接頭結(jié)合，而在dsfv中，鏈已被突變以引入二硫鍵以穩(wěn)定鏈的締合。該術(shù)語(yǔ)還包括遺傳工程改造的形式，諸如嵌合抗體(例如人源化鼠抗體)和異源綴合物抗體(諸如雙特異性抗體)。還參見，piercecatalogandhandbook,1994-1995(piercechemicalco.,rockford,il);kuby,j.,immunology,第3版,w.h.freeman&co.,newyork,1997。

本文公開的抗體特異性結(jié)合限定的靶標(biāo)(或在雙特異性抗體的情況下，多個(gè)靶標(biāo))。因此，特異性結(jié)合靶標(biāo)的抗體是基本上結(jié)合靶標(biāo)(例如表達(dá)靶標(biāo)的細(xì)胞或組織)的抗體。當(dāng)然，認(rèn)識(shí)到在抗體和非靶標(biāo)之間可存在一定程度的非特異性相互作用。

通常，特異性結(jié)合導(dǎo)致抗體與攜帶抗原的蛋白或細(xì)胞之間的締合比在抗體和缺乏抗原的蛋白或細(xì)胞之間的締合強(qiáng)得多。特異性結(jié)合通常導(dǎo)致抗體(每單位時(shí)間)與包括表位的蛋白或表達(dá)靶表位的細(xì)胞或組織結(jié)合的量相比于缺乏該表位的蛋白或細(xì)胞或組織增加大于2倍、諸如增加大于5倍、大于10倍或大于100倍。在此類條件下與蛋白的特異性結(jié)合需要針對(duì)其對(duì)特定蛋白的特異性選擇的抗體。各種免疫測(cè)定形式適用于選擇與特定蛋白特異性免疫反應(yīng)的抗體或其他配體。例如，固相elisa免疫測(cè)定通常用于選擇與蛋白特異性免疫反應(yīng)的單克隆抗體。對(duì)于可用于確定特異性免疫反應(yīng)性的免疫測(cè)定形式和條件的描述，參見harlow&lane,antibodies,alaboratorymanual,coldspringharborpublications,newyork(1988)。

生物樣品：包含生物分子，包括基因組dna、rna(包括mrna和微rna)、核酸、蛋白、肽和/或其組合，的生物樣本。在一些實(shí)例中，生物樣品獲得自受試者。在其他實(shí)例中，生物樣品是細(xì)胞培養(yǎng)物，包括從獲得自受試者的生物樣品生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物。生物樣品包括可用于檢測(cè)受試者中的疾病(例如癌癥)的所有臨床樣品，包括但不限于，細(xì)胞、組織和體液，諸如血液、血液的衍生物和級(jí)分(諸如血清)；以及活檢或外科手術(shù)取出的組織，例如未固定、冷凍或在福爾馬林或石蠟中固定的組織。在具體實(shí)例中，生物樣品獲得自具有或懷疑具有腫瘤的受試者；例如，具有或懷疑具有乳腺癌、卵巢癌、胃癌或子宮癌的受試者。在一些實(shí)施方案中，所述受試者具有或懷疑具有癌。

緩沖液：緩沖溶液通常用于維持生物和化學(xué)體系的正確ph水平。本文公開的許多示例性實(shí)施方案包括使用緩沖溶液?？赡艽嬖谟诰彌_液中的代表性緩沖劑或鹽包括但不限于tris、tricine、hepes、mops、taps、bicine、tapso、tes、pipes、卡可酸鹽、ssc、mes、kcl、nacl、乙酸鉀、乙酸銨、谷氨酸鉀、nh4cl、硫酸銨、mgcl2、乙酸鎂等。一種緩沖溶液是磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)。另一種緩沖溶液是生物素連接酶反應(yīng)緩沖液(0.1mkcl，5.5mmmgcl2，50mmtris·hcl(ph=8.0)，0.05%brij-35，0.1mm二硫蘇糖醇(dtt)，3mmatp和60μm生物素)。緩沖劑的量通常范圍為約5至150mm，通常約10至100mm，更通常約20至50mm，其中在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，緩沖劑將以足以提供在室溫下范圍為約6.0-約9.5的ph、更通常約6.5-約7.4的ph范圍的量存在。可存在于緩沖介質(zhì)中的其他試劑包括螯合劑，諸如edta、egta等。

顯色染色：顯色底物已廣泛用于免疫組織化學(xué)多年，最近用于原位雜交。顯色檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單且成本劃算的檢測(cè)方法。傳統(tǒng)上，顯色底物當(dāng)通過適當(dāng)酶作用時(shí)通過沉淀起作用。也就是說(shuō)，傳統(tǒng)的顯色物質(zhì)在與酶接觸后從可溶性試劑轉(zhuǎn)化為不溶的有色沉淀物。所得有色沉淀物不需要特殊設(shè)備用于處理或顯現(xiàn)。存在成功的ihc或ish顯色底物共享的幾個(gè)品質(zhì)。首先，物質(zhì)應(yīng)該沉淀為有色物質(zhì)，優(yōu)選具有非常高的摩爾吸光度。酶底物應(yīng)當(dāng)具有高溶解度和試劑穩(wěn)定性，但沉淀的色原產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)非常不溶，優(yōu)選在水溶液和醇溶液中非常不溶。酶轉(zhuǎn)換率應(yīng)當(dāng)非常高，以便在短時(shí)間內(nèi)高度擴(kuò)增來(lái)自單一酶的信號(hào)。到目前為止，已經(jīng)鑒定了合理地具有所有這些品質(zhì)的相對(duì)少量的顯色物質(zhì)。參考于2014年2月24日提交的題為quinonemethideprecursorsandusestherefore的美國(guó)公開申請(qǐng)?zhí)?013/0260379和61/943,940，其對(duì)于與顯色染色相關(guān)的公開內(nèi)容以其整體在此通過引用并入本文。幾種市售的顯色檢測(cè)試劑盒可得自ventanamedicalsystems,inc.且在本文提及(aec檢測(cè)試劑盒760-020；增強(qiáng)的堿性磷酸酶紅色檢測(cè)試劑盒760-031；optiviewdabihc檢測(cè)試劑盒760-700；iviewdab檢測(cè)試劑盒760-091；ultraview通用堿性磷酸酶紅色檢測(cè)試劑盒760-501；和ultraview通用dab檢測(cè)試劑盒760-500)。

綴合物：例如通過共價(jià)鍵或非共價(jià)相互作用偶聯(lián)在一起的兩個(gè)或更多個(gè)分子。

綴合、接合、鍵合或連接：將第一分子與第二分子偶聯(lián)。這包括但不限于將一個(gè)分子與另一分子共價(jià)鍵合，將一個(gè)分子與另一分子非共價(jià)鍵合(例如靜電鍵合)(參見例如美國(guó)專利號(hào)6,921,496)，氫鍵鍵合，范德華力，以及此類偶聯(lián)的任何和所有組合。

接觸：置于直接締合中，例如固體、液體或氣體形式。

對(duì)照：用于與測(cè)試樣品比較的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，例如生物樣品，例如獲得自患者(或多個(gè)患者)或細(xì)胞培養(yǎng)物的生物樣品。在一些實(shí)施方案中，未與測(cè)試試劑孵育的細(xì)胞培養(yǎng)物充當(dāng)與測(cè)試試劑孵育的細(xì)胞培養(yǎng)物的對(duì)照。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照是獲得自健康患者(或多個(gè)患者)的樣品(本文也稱為“正?！睂?duì)照)，諸如正常乳腺樣品。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照是歷史對(duì)照或標(biāo)準(zhǔn)值(即，先前測(cè)試的對(duì)照樣品或代表基線或正常值的樣品組)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照是代表獲得自多個(gè)患者樣品的平均值(或值的平均范圍)的標(biāo)準(zhǔn)值。

偶聯(lián)的：直接或間接接合在一起的兩個(gè)或更多個(gè)分子。第一原子或分子可直接偶聯(lián)或間接偶聯(lián)至第二原子或分子。當(dāng)與結(jié)合至抗原的一抗結(jié)合時(shí)，二抗與抗原間接偶聯(lián)。

檢測(cè)：鑒定某物的存在(existence)、發(fā)生、存在(presence)或事實(shí)。一般檢測(cè)方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，并且可以用本文公開的方案和試劑來(lái)補(bǔ)充。例如，本文包括檢測(cè)生物樣品中鄰近于第二靶標(biāo)的第一靶標(biāo)的方法。

ffpe：福爾馬林固定、石蠟包埋的樣品。

半抗原：半抗原是分子，通常是小分子，其可以與抗體特異性組合，但通常除了與載體分子組合外，基本上不能具有免疫原性。許多半抗原是已知的并且經(jīng)常用于分析程序，諸如二硝基苯基、生物素、洋地黃毒苷、熒光素、若丹明或其組合。其他半抗原已由本申請(qǐng)的受讓人ventanamedicalsystems,inc.特別開發(fā)，包括選自以下的半抗原：噁唑類、吡唑類、噻唑類、硝基芳基類、苯并呋喃類、三萜類、脲類、硫脲類、魚藤酮類、香豆素類、環(huán)木脂體類(cyclolignans)及其組合，其中半抗原類的具體半抗原實(shí)例包括苯并呋咱、硝基苯基、4-(2-羥基苯基)-1h-苯并[b][1,4]二氮雜?-2(3h)-酮和3-羥基-2-喹喔啉甲酰胺。多種不同的半抗原可以偶聯(lián)至聚合物載體。此外，化合物、諸如半抗原，可以使用接頭、諸如nhs-peg接頭偶聯(lián)至另一個(gè)分子。

免疫復(fù)合物：抗體與可溶性抗原的結(jié)合形成免疫復(fù)合物?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的常規(guī)方法檢測(cè)免疫復(fù)合物的形成，例如免疫組織化學(xué)、免疫沉淀、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光顯微鏡、elisa、免疫印跡(即western印跡)、磁共振成像、ct掃描、x-射線和親和色譜?？梢允褂帽绢I(lǐng)域眾所周知的方法來(lái)定量所選抗體的免疫結(jié)合特性。

接頭：兩個(gè)組分可以直接通過鍵或間接通過接頭連接在一起。接頭可以是雙官能的，即接頭在每個(gè)末端包括官能團(tuán)，其中官能團(tuán)用于將接頭共價(jià)或非共價(jià)連接至兩個(gè)組分。兩個(gè)官能團(tuán)可以相同，即同雙官能接頭，或不同的，即異雙官能接頭，但更通常為異雙官能的。在采用接頭的情況下，選擇合適的官能團(tuán)以允許附接兩個(gè)組分，同時(shí)不損害組分的官能度。目標(biāo)接頭可以根據(jù)綴合物中的組分而廣泛變化。在許多實(shí)施方案中，當(dāng)存在時(shí)，接頭是生物惰性的。

可以使用接頭將可切割橋組分的可檢測(cè)部分和/或化學(xué)連接基團(tuán)和/或切割位點(diǎn)連接至特異性結(jié)合分子(或?qū)⒉豢汕懈顦蚪M分的化學(xué)連接基團(tuán)連接至特異性結(jié)合部分)。可以選擇不同長(zhǎng)度的接頭。在采用接頭的情況下，可以選擇此類基團(tuán)以允許附接綴合物的兩個(gè)組分，同時(shí)不損害它們的官能度。此類末端官能團(tuán)包括例如但不限于胺類、醇類、硫醇類、酰肼類、羰基反應(yīng)性基團(tuán)(諸如醛類、酸類和酯類)、乙烯基酮類、環(huán)氧化物類、異氰酸酯類、馬來(lái)酰亞胺類)、能夠環(huán)加成反應(yīng)、形成二硫鍵、結(jié)合金屬或光反應(yīng)性基團(tuán)的官能團(tuán)。具體實(shí)例包括伯胺和仲胺類、異羥肟酸類、n-羥基琥珀酰亞胺基酯類、n-羥基琥珀酰亞胺基碳酸酯類、氧基羰基咪唑類、硝基苯基酯類、三氟乙酯類、縮水甘油醚類、乙烯基砜類和馬來(lái)酰亞胺類。這些基團(tuán)便于與特異性結(jié)合部分和其他所需化合物的偶聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，所述接頭為至少約25道爾頓、至少約50道爾頓、至少約100道爾頓或至少約500道爾頓(或更大)。第一類接頭可以是脂族化合物，諸如具有一個(gè)或多個(gè)不飽和位點(diǎn)的脂族烴鏈或烷基鏈。鏈的長(zhǎng)度可以變化，但通常具有約30個(gè)原子的較高實(shí)用限值。已證明大于約30個(gè)碳原子的鏈長(zhǎng)比具有較小鏈長(zhǎng)的化合物的效力更差。因此，脂族鏈接頭通常具有約1個(gè)碳原子至約30個(gè)碳原子的鏈長(zhǎng)。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，如果特定接頭具有大于30個(gè)原子且綴合物仍根據(jù)需要起作用，則此類鏈長(zhǎng)仍然在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

在一些實(shí)施方案中，接頭是用反應(yīng)性基團(tuán)(諸如氨基-或巰基-烴)官能化的直鏈或支鏈烷基鏈，其中在非支鏈中具有多于兩個(gè)碳原子。實(shí)例包括氨基烷基、氨基烯基和氨基炔基?；蛘?，接頭是長(zhǎng)度為10-20個(gè)碳的烷基鏈，并且可以通過si-c直接鍵或通過酯si-oc鍵連接(參見foote的美國(guó)專利號(hào)5,661,028，其通過引用并入本文)。其他接頭是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可得且是已知的(參見例如美國(guó)專利號(hào)5,306,518、4,711,955和5,707,804；其各自通過引用并入本文)。

第二類接頭包括環(huán)氧烷。環(huán)氧烷在本文中通過參考二醇類、諸如乙二醇類來(lái)表示。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，隨著氧原子數(shù)增加，化合物的親水性也可增加。因此，本發(fā)明的接頭通常具有(-och2ch2-)n的式，其中n為約2至約20，但更具體地n為約2至約10，甚至更通常為約4至約8，其可以表示為peg4至peg8。

可用于實(shí)施本發(fā)明的某些公開的實(shí)施方案的接頭，諸如異雙官能聚亞烷基二醇接頭，描述于受讓人的共同未決申請(qǐng)，包括2006年4月28日提交的"nanoparticleconjugates"，美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/413,778；2009年3月13日提交的"antibodyconjugates"，美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?2/381,638；和2010年1月14日提交的“molecularconjugate”，美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?2/687,564，以及美國(guó)專利號(hào)7,695,929；其各自通過引用并入本文。在這些申請(qǐng)中公開的接頭可用于以任何和所有期望的組合連接特異性結(jié)合部分、生物素連接酶、生物素連接酶底物、信號(hào)生成部分和半抗原以形成用于與本發(fā)明的公開實(shí)施方案使用的綴合物。

接頭的其他實(shí)例包括但不限于肽，包括天然和非天然多肽，碳水化合物，環(huán)狀或非環(huán)狀系統(tǒng)，其可能含有雜原子。接頭基團(tuán)還可以包含與金屬結(jié)合的配體，使得金屬離子的存在配位兩個(gè)或更多個(gè)配體以形成復(fù)合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，接頭是一對(duì)彼此具有高親和力的分子。此類高親和力分子包括例如鏈霉抗生物素蛋白和生物素、組氨酸和鎳(ni)以及gst和谷胱甘肽。

具體的示例性接頭包括：乙二醇、聚亞烷基二醇諸如peg2、peg3、peg4、peg5、peg6、peg7、peg8、peg9、peg10、peg11、peg12、peg13、peg14、peg15、peg16、peg17、peg18、peg19、peg20、1,4-二氨基己烷、二甲苯二胺、對(duì)苯二甲酸、3,6-二氧雜辛二酸、乙二胺-n,n-二乙酸、1,1'-亞乙基雙(5-氧代-3-吡咯烷甲酸)、4,4'-乙烯二哌啶、琥珀酰亞胺基-6-肼基-煙酰胺(s-hynic、hynic-nhs)、n-琥珀酰亞胺基-4-甲?；郊姿狨?s-4fb、4-fb-nhs)、馬來(lái)酰亞胺hynic(mhph)、馬來(lái)酰亞胺4fb(mtfb)、琥珀酰亞胺基-[(n-馬來(lái)酰亞胺基丙酰胺基)-八乙二醇]酯(mal-peg8-nhs)、琥珀酰亞胺基-[(n-馬來(lái)酰亞胺基丙酰胺基)-四乙二醇]酯(mal-peg4-nhs)、4-fb-peg4-pfp、疊氮基苯甲酰肼、n-[4-(p-疊氮基水楊基氨基)丁基]-3'-[2'-吡啶基二硫基]丙酰胺)、辛二酸雙磺基琥珀酰亞胺酯、二甲基己二亞氨酯(dimethyladipimidate)、二琥珀酰亞胺基酒石酸酯、n-馬來(lái)酰亞胺丁酰氧基琥珀酰亞胺酯、n-羥基磺基琥珀酰亞胺基-4-疊氮基苯甲酸酯、n-琥珀酰亞胺基[4-疊氮基苯基]-1,3'-二硫代丙酸酯、n-琥珀酰亞胺基[4-碘乙?；鵠氨基苯甲酸酯、戊二醛和琥珀酰亞胺基-4-[n-馬來(lái)酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-甲酸酯、3-(2-吡啶基二硫基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯(spdp)、4-(n-馬來(lái)酰亞胺基甲基)-環(huán)己烷-1-甲酸n-羥基琥珀酰亞胺酯(smcc)等。

可以構(gòu)建融合蛋白，而不是化學(xué)接頭(例如，可以在基因水平上將肽與特異性結(jié)合分子偶聯(lián))。

核酸：經(jīng)由磷酸二酯鍵連接的核苷酸單元(核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、其相關(guān)天然存在的結(jié)構(gòu)變體和合成的非天然存在的類似物)、其相關(guān)天然存在的結(jié)構(gòu)變體和合成的非天然存在的類似物構(gòu)成的聚合物。因此，該術(shù)語(yǔ)包括核苷酸聚合物，其中核苷酸和它們之間的鍵包括非天然存在的合成類似物，諸如例如、但不限于硫代磷酸酯類、氨基磷酸酯類、甲基膦酸酯類、手性甲基膦酸酯類、2-鄰甲基核糖核酸類、肽-核酸(pna)等。此類多核苷酸可以例如使用自動(dòng)化dna合成儀合成。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)核苷酸序列由dna序列(即a、t、g、c)表示時(shí)，這也包括其中“u”替代“t”的rna序列(即a、u、g、c)。

核苷酸：術(shù)語(yǔ)包括但不限于與糖連接的堿基，諸如嘧啶、嘌呤或其合成類似物，或與氨基酸連接的堿基，如肽核酸(pna)中。核苷酸是多核苷酸中的一個(gè)單元。核苷酸序列是指多核苷酸中的堿基序列。

本文中使用常規(guī)符號(hào)來(lái)描述核苷酸序列：?jiǎn)捂満塑账嵝蛄械淖髠?cè)末端是5'末端；雙鏈核苷酸序列的左側(cè)方向被稱為5’-方向。向新生rna轉(zhuǎn)錄物5’至3’添加核苷酸的方向被稱為轉(zhuǎn)錄方向。與mrna具有相同序列的dna鏈被稱為“編碼鏈”；dna鏈上與從該dna轉(zhuǎn)錄的mrna具有相同序列且位于rna轉(zhuǎn)錄物的5’-末端的5’的序列被稱為“上游序列”；dna鏈上與rna具有相同序列且在編碼rna轉(zhuǎn)錄物的3’-末端的3’的序列被稱為“下游序列”。

寡核苷酸：長(zhǎng)度為5至100個(gè)核苷酸堿基的線性多核苷酸序列。

鄰近：是指兩個(gè)分子/靶標(biāo)/表位之間的定性或定量距離；例如，組織樣品中兩個(gè)蛋白之間的距離。在一些實(shí)施方案中，彼此鄰近的分子在彼此的約100nm、約75nm、約50nm、約35nm、約30nm、約25nm、約20nm、約15nm、約10nm、約5nm或以下距離內(nèi)。鄰近也可提供功能關(guān)系。例如，對(duì)于待鍵合至與第二靶標(biāo)締合的組分的與第一靶標(biāo)締合的組分，如果第一靶標(biāo)在第二靶標(biāo)的足夠距離內(nèi)，則兩個(gè)靶標(biāo)(例如兩個(gè)蛋白)可以被認(rèn)為是鄰近的。鄰近的另一功能定義是兩個(gè)蛋白的二聚化。鄰近的另一功能定義與遺傳易位相關(guān)。當(dāng)基因組的兩個(gè)部分彼此相鄰或在彼此的500,000bp內(nèi)、100,000bp內(nèi)、50,000bp內(nèi)、25,000bp內(nèi)、10,000bp內(nèi)或1,000bp內(nèi)時(shí)，它們可認(rèn)為是鄰近的。這與由于易位(移動(dòng)至另一染色體或反轉(zhuǎn))而不鄰近的兩個(gè)部分形成對(duì)比。術(shù)語(yǔ)鄰近還包括作為能夠進(jìn)行生物學(xué)重要相互作用的分子之間的距離的功能含義。例如，具有生物學(xué)意義的蛋白二聚體中的兩個(gè)蛋白之間的距離可以說(shuō)是鄰近的。

樣品：某些公開的實(shí)施方案利用生物樣品。生物樣品通常獲得自目標(biāo)哺乳動(dòng)物受試者，諸如人。所述樣品可以是任何樣品，包括但不限于來(lái)自活檢、尸檢和病理樣本的組織。生物樣品還包括組織切片，例如對(duì)于組織學(xué)目的所取的冷凍切片。生物樣品還包括細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞培養(yǎng)物的部分，例如從取自受試者的生物樣品生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物。

可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法從受試者獲得生物樣品。例如，可以從已經(jīng)歷作為治療形式的腫瘤切除的乳腺癌患者獲得組織樣品。從這些患者可以獲得腫瘤組織和周圍的非癌組織。在一些實(shí)施方案中，從尸體獲得用作對(duì)照的非癌組織樣品。在一些實(shí)施方案中，通過活檢獲得生物樣品?；顧z樣品可以是新鮮的、冷凍的或固定的，諸如福爾馬林固定和石蠟包埋的?？梢酝ㄟ^外科手術(shù)、通過提取(例如通過皮下針或其他類型的針)、通過顯微解剖、通過激光捕獲或通過本領(lǐng)域已知的任何其他方式從患者移取樣品。

特異性結(jié)合部分：特異性結(jié)合對(duì)的成員。特異性結(jié)合對(duì)是分子對(duì)，其特征在于它們彼此結(jié)合以實(shí)質(zhì)上排除與其他分子的結(jié)合(例如，特異性結(jié)合對(duì)可具有為結(jié)合對(duì)的兩個(gè)成員中任一個(gè)與生物樣品中的其他分子的結(jié)合常數(shù)的至少10³倍、10⁴倍或10⁵倍的結(jié)合常數(shù))。用于制備本文公開的示例性綴合物的特異性結(jié)合部分可以是各種不同類型的分子中的任一種，只要其對(duì)靶標(biāo)展現(xiàn)必需的結(jié)合親和力。

特異性結(jié)合部分可以包含小分子或大分子。小分子大小范圍為約50至約10,000道爾頓，更通常約50至約5,000道爾頓，甚至更通常約100至約1000道爾頓。大分子是分子量通常大于約10,000道爾頓的分子。小分子可以是任何分子，通常是能夠與靶標(biāo)以必需親和力結(jié)合的有機(jī)分子。小分子通常包括一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)，其允許其與靶標(biāo)相互作用，例如通過疏水、親水、靜電或共價(jià)相互作用與靶標(biāo)相互作用。當(dāng)靶標(biāo)是蛋白、脂質(zhì)或核酸時(shí)，小分子通常將包括官能團(tuán)，其允許結(jié)構(gòu)相互作用，諸如氫鍵鍵合、疏水-疏水相互作用、靜電相互作用等。小分子配體通常包括胺、酰胺、巰基、羰基、羥基或羧基，且優(yōu)選這些官能團(tuán)中的至少兩個(gè)。

小分子通常包含環(huán)狀和/或雜環(huán)非芳族結(jié)構(gòu)，和/或被一個(gè)或多個(gè)上述官能團(tuán)取代的芳族或多芳族結(jié)構(gòu)。還有用的小分子包括在生物分子間發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)，所述生物分子包括肽類、糖類、脂肪酸類、類固醇類、嘌呤類、嘧啶類、其衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或其組合。

小分子可以衍生自天然存在或合成的化合物，其可以獲得自各種各樣來(lái)源，包括合成或天然化合物的文庫(kù)。例如，許多方法可用于隨機(jī)和定向合成各種各樣的有機(jī)化合物和生物分子，包括制備隨機(jī)化寡核苷酸和寡肽。或者，可以得到或容易地產(chǎn)生細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物的文庫(kù)。此外，天然或合成產(chǎn)生的文庫(kù)和化合物通過常規(guī)的化學(xué)、物理和生物化學(xué)方式容易地修飾，并且可用于產(chǎn)生組合文庫(kù)。已知的小分子可以進(jìn)行定向或隨機(jī)化學(xué)修飾，諸如?；?、烷基化、酯化、酰胺化等，以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。

因此，小分子可以獲得自天然存在或合成的分子文庫(kù)，包括通過組合方式產(chǎn)生的化合物文庫(kù)，即化合物多樣性組合文庫(kù)。當(dāng)獲得自此類文庫(kù)時(shí)，所用的小分子將在方便的結(jié)合親和力測(cè)定中已經(jīng)證明了對(duì)靶標(biāo)的一些所需親和力。組合文庫(kù)以及其生產(chǎn)和篩選方法是本領(lǐng)域已知的，且描述于美國(guó)專利號(hào)5,741,713和5,734,018，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。關(guān)于特異性結(jié)合部分的額外信息由受讓人的美國(guó)專利號(hào)7,695,929(其也通過引用并入本文)提供。特異性結(jié)合部分可以包含大分子。作為大分子特異性結(jié)合部分特別感興趣的是抗體，以及其結(jié)合片段及其衍生物或模擬物。因此，特異性結(jié)合部分可以是單克隆抗體或多克隆抗體。還感興趣的是重組或合成產(chǎn)生的抗體片段或衍生物，諸如單鏈抗體或scfv，或其他抗體衍生物，諸如嵌合抗體或cdr移植的抗體，其中此類重組或合成產(chǎn)生的抗體片段保留上述抗體的結(jié)合特征。本發(fā)明的此類抗體片段、衍生物或模擬物可以使用任何方便的方法，諸如美國(guó)專利號(hào)5,851,829和5,965,371(其公開內(nèi)容通過引用并入本文)中公開的方法，容易地制備。

還適合用作大分子特異性結(jié)合部分是多核酸適體。多核酸適體可以是以與受體或抗體相同的方式更高選擇性結(jié)合蛋白的rna寡核苷酸(conrad等人,methodsenzymol.(1996),267(combinatorialchemistry),336-367)或互補(bǔ)特異性dna靶序列的dna寡聚體。

除了基于抗體的肽/多肽或基于蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域以外，特異性結(jié)合部分還可以是凝集素、可溶性細(xì)胞表面受體或其衍生物、來(lái)自噬菌體展示或核糖體展示或任何類型的組合肽或蛋白文庫(kù)的親和體或任何組合衍生的蛋白或肽?？梢允褂萌魏翁禺愋越Y(jié)合部分的組合。

重要的是，特異性結(jié)合部分將是允許偶聯(lián)至綴合物的第二組分或接頭、而實(shí)質(zhì)上不影響特異性結(jié)合部分與其靶標(biāo)的結(jié)合親和力的部分。

特異性結(jié)合部分的具體實(shí)例包括特異性結(jié)合蛋白(例如，抗體、凝集素、抗生物素蛋白諸如鏈霉抗生物素蛋白和蛋白a)。特異性結(jié)合部分還包括被此類特異性結(jié)合蛋白特異性結(jié)合的分子(或其部分)。

靶標(biāo)：測(cè)定或可以測(cè)定其存在、位置和/或濃度的任何分子。靶分子的實(shí)例包括蛋白和半抗原，諸如共價(jià)鍵合至蛋白的半抗原。通常使用特異性結(jié)合分子和可檢測(cè)標(biāo)記的一種或多種綴合物來(lái)檢測(cè)靶分子。特異性靶標(biāo)的實(shí)例包括蛋白、碳水化合物或核酸分子。靶核酸分子包括尋求其鄰近、重排、擴(kuò)增、缺失、檢測(cè)、定量、定性檢測(cè)或其組合的那些分子。例如，靶標(biāo)可以是核酸分子的限定區(qū)域或特定部分，例如基因組的一部分(諸如基因或含有目標(biāo)基因(或其部分)的dna或rna的區(qū)域)。所述核酸分子不需要是純化形式。各種其他核酸分子也可以與靶核酸分子一起存在。例如，靶核酸分子可以是特異性核酸分子(其可以包括rna或dna)，其至少一部分(諸如基因組序列或cdna序列的一部分)的擴(kuò)增是預(yù)期的。在一些實(shí)例中，靶核酸包括病毒核酸分子或細(xì)菌核酸分子，諸如來(lái)自大腸桿菌或霍亂弧菌的核酸分子。如果需要，靶核酸分子的純化或分離可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，諸如通過使用市售純化試劑盒等進(jìn)行。

酪酰胺信號(hào)擴(kuò)增：利用過氧化物酶(諸如辣根過氧化物酶)的催化活性以原位生成靶分子(諸如蛋白或核酸序列)的高密度標(biāo)記的酶介導(dǎo)的檢測(cè)方法。tsa通常涉及三個(gè)基本步驟：(1)特異性結(jié)合成員(例如抗體)與靶標(biāo)結(jié)合，隨后用第二過氧化物酶標(biāo)記的特異性結(jié)合成員二次檢測(cè)特異性結(jié)合成員；(2)通過過氧化物酶活化多個(gè)拷貝的標(biāo)記的酪酰胺衍生物(例如半抗原標(biāo)記的酪酰胺)；和(3)將所得高度反應(yīng)性的酪酰胺自由基與鄰近于過氧化物酶-靶標(biāo)相互作用位點(diǎn)的殘基(例如，蛋白酪氨酸殘基的苯酚部分)共價(jià)偶聯(lián)，導(dǎo)致半抗原鄰近(擴(kuò)散和反應(yīng)性介導(dǎo)的)沉積至靶標(biāo)。在tsa的一些實(shí)例中，涉及更多或更少的步驟；例如，可以相繼重復(fù)tsa方法以增加信號(hào)。進(jìn)行tsa的方法和用于進(jìn)行tsa的商業(yè)試劑盒和試劑是可得的(參見例如，ventana擴(kuò)增試劑盒，目錄號(hào)760-080，具有tsa?的ampmap檢測(cè)試劑盒，目錄號(hào)760-121,ventanamedicalsystems,tucson,az;invitrogen;試劑盒編號(hào)t-20911,invitrogencorp,carlsbad,ca)。在一些實(shí)施方案中，tsa是提供的ptdm的組分?？梢蕴娲厥褂闷渌复呋陌肟乖蛐盘?hào)傳導(dǎo)連接的反應(yīng)性物質(zhì)，因?yàn)樗鼈兛勺兊每捎谩＿m用于tsa的條件以及用于酪酰胺信號(hào)擴(kuò)增的試劑和試劑盒是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的(參見例如，bobrow等人,j.immuno.meth.,125:279-285,1989)。

在足以…的條件下：用于描述允許所需活性的任何環(huán)境的短語(yǔ)。

ii.實(shí)施方案的描述

現(xiàn)在參考圖1-28，本發(fā)明的特征在于用于檢測(cè)(原位)兩個(gè)目標(biāo)靶標(biāo)是否密切鄰近的鄰近測(cè)定方法。本發(fā)明的方法的特征在于共價(jià)鍵形成。本發(fā)明的方法與顯色和熒光檢測(cè)系統(tǒng)相容。本發(fā)明的方法可以手動(dòng)進(jìn)行，或者所述方法可以是自動(dòng)化的(例如，使用自動(dòng)化染色儀器，諸如benchmarkxt,ventanamedicalsystems,inc.,tucson,az)或其組合。例如，測(cè)定可以是自動(dòng)化的，但包括其中用戶添加試劑的一個(gè)或多個(gè)手動(dòng)步驟。不希望將本發(fā)明限于任何理論或機(jī)制，據(jù)信本發(fā)明方法中涉及的全部或大部分組分是易于獲得和便宜的常用化學(xué)試劑。此外，用于測(cè)定中的綴合物的合成也可以是簡(jiǎn)單和/或高產(chǎn)率的(類似于抗體的半抗原標(biāo)記)。

本發(fā)明的方法還可用于進(jìn)行多重測(cè)定，其中在同一載片上檢測(cè)多于一個(gè)鄰近事件(例如，兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)等)。在還有其他實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)鄰近測(cè)定法可以與單一測(cè)定法(例如，與er、pr、ki-67蛋白或her2dish基因測(cè)定法復(fù)用的her2-her3二聚體的鄰近測(cè)定法)復(fù)用。

本發(fā)明的方法的特征在于使用與可切割橋組分綴合的特異性結(jié)合部分(例如抗體)(綴合物a)以及與不可切割橋組分綴合的其他特異性結(jié)合部分(例如，抗體)(綴合物b)?？汕懈顦蚪M分在其末端處或附近包含可檢測(cè)部分(例如半抗原)，以及切割位點(diǎn)和化學(xué)連接基團(tuán)。不可切割橋組分在其末端處或附近包含化學(xué)連接基團(tuán)。圖3顯示特異性識(shí)別且結(jié)合至與目標(biāo)靶標(biāo)結(jié)合的一抗的示例性綴合物(綴合物a、綴合物b)。或者，綴合物可以直接結(jié)合至目標(biāo)靶標(biāo)。例如，綴合物可以使用一抗制備。類似地，綴合物可以包括在三級(jí)或四級(jí)檢測(cè)疊層中。示例性綴合物可以包括抗物質(zhì)抗體或抗半抗原抗體。綴合物進(jìn)行外部刺激(例如，催化劑或其他機(jī)制諸如uv光、脫保護(hù)條件等)，其中如果兩個(gè)綴合物(綴合物a、綴合物b)密切接近，則在兩個(gè)抗體綴合的橋組分之間經(jīng)由化學(xué)連接基團(tuán)形成共價(jià)鍵。隨后，可切割橋組分經(jīng)由切割位點(diǎn)被切割，使得鍵合的橋組分僅與具有不可切割橋組分的抗體連接。在洗滌步驟之后，可以經(jīng)由檢測(cè)系統(tǒng)諸如免疫組織化學(xué)系統(tǒng)或熒光系統(tǒng)(或其他適當(dāng)?shù)臋z測(cè)系統(tǒng))檢測(cè)可檢測(cè)部分。如果綴合物(綴合物a、綴合物b)不密切鄰近，則在兩個(gè)橋組分之間不形成共價(jià)鍵；當(dāng)切割反應(yīng)發(fā)生時(shí)，可切割橋組分(具有可檢測(cè)部分)從結(jié)合部分切割，并且在洗滌步驟之后不能經(jīng)由檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)。因此，可檢測(cè)部分的檢測(cè)表明兩個(gè)目標(biāo)靶標(biāo)的鄰近。

在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分的檢測(cè)表明靶標(biāo)相距不超過40nm。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分的檢測(cè)表明靶標(biāo)相距不超過35nm。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分的檢測(cè)表明靶標(biāo)相距不超過30nm。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分的檢測(cè)表明靶標(biāo)相距不超過25nm。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分的檢測(cè)表明靶標(biāo)相距不超過15nm。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分的檢測(cè)表明靶標(biāo)相距不超過10nm。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分的檢測(cè)表明靶標(biāo)相距不超過5nm。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分的檢測(cè)表明靶標(biāo)相距不超過2nm。本發(fā)明的一個(gè)方面是使用鄰近測(cè)定可檢測(cè)的距離可以針對(duì)特定的一組靶標(biāo)而定制。例如，通過改變接頭或橋長(zhǎng)度，通過改變檢測(cè)疊層方法(例如綴合物是一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)檢測(cè)分子)，或通過在檢測(cè)疊層內(nèi)使用半抗原-酪酰胺擴(kuò)增步驟，可針對(duì)特定應(yīng)用根據(jù)需要改變使用本文的方法和試劑可檢測(cè)的距離。

本發(fā)明中使用的化學(xué)品(例如，用于兩個(gè)橋組分之間的共價(jià)鍵形成)是生物正交的(例如，非擾動(dòng)或不被生物系統(tǒng)擾亂)。也就是說(shuō)，在綴合物之間形成共價(jià)鍵的條件不是天然的，因此不會(huì)自發(fā)地或非特異性地發(fā)生。本發(fā)明不限于本文所述的化學(xué)品(參見patterson等人,acschemicalbiology2014,9,592-605中的生物正交反應(yīng)的其他實(shí)例，還參見xiang等人,angew.chem.int.ed.2014,53,2190-2193)。

在一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，檢測(cè)鄰近于樣品中的第二靶標(biāo)定位的第一靶標(biāo)的方法包括用包含可切割橋組分的第一綴合物標(biāo)記第一靶標(biāo)，所述可切割橋組分包含切割位點(diǎn)、可檢測(cè)部分和第一化學(xué)連接基團(tuán)，用包含不可切割橋組分的第二綴合物標(biāo)記第二靶標(biāo)，所述不可切割橋組分包含第二化學(xué)連接基團(tuán)，活化所述第一化學(xué)連接基團(tuán)或所述第二化學(xué)連接基團(tuán)，所以可以形成其中第一靶標(biāo)和第二靶標(biāo)鄰近的共價(jià)鍵；從第一靶位點(diǎn)切割可檢測(cè)部分；洗滌樣品以除去未結(jié)合的可檢測(cè)部分；且檢測(cè)可見的可檢測(cè)部分。

綴合物a和可切割橋組分

分子諸如抗體用至少一個(gè)可切割橋組分修飾。圖1a和圖1b顯示可切割橋組分的示意性結(jié)構(gòu)?？汕懈顦蚪M分包含切割位點(diǎn)、可檢測(cè)部分/半抗原和化學(xué)連接基團(tuán)(cl)。切割位點(diǎn)被定位為比可檢測(cè)部分/半抗原或化學(xué)連接基團(tuán)更鄰近于抗體?；瘜W(xué)連接基團(tuán)被定位于可切割橋組分的末端處或附近。

在一些實(shí)施方案中，所述抗體用至少兩個(gè)可切割橋組分修飾。在一些實(shí)施方案中，所述抗體用至少三個(gè)可切割橋組分修飾。在一些實(shí)施方案中，所述抗體用至少四個(gè)可切割橋組分修飾。在一些實(shí)施方案中，所述抗體用至少五個(gè)可切割橋組分修飾。在一些實(shí)施方案中，所述抗體用至少十個(gè)(或更多個(gè))可切割橋組分修飾。

可切割橋組分的化學(xué)連接基團(tuán)(以及不可切割橋組分的化學(xué)連接基團(tuán))是生物正交的，例如惰性的，并且在生理?xiàng)l件下是穩(wěn)定的。然而，在適當(dāng)?shù)臈l件(外部刺激)下，兩個(gè)組分的化學(xué)連接基團(tuán)容易形成共價(jià)鍵。

通常，在外部刺激后，可切割橋組分的化學(xué)連接基團(tuán)和不可切割橋組分的化學(xué)連接基團(tuán)可在少于3小時(shí)內(nèi)形成共價(jià)鍵。在一些實(shí)施方案中，在外部刺激后，化學(xué)連接基團(tuán)可在少于兩小時(shí)內(nèi)形成共價(jià)鍵。在一些實(shí)施方案中，在外部刺激后，化學(xué)連接基團(tuán)可在少于一小時(shí)內(nèi)形成共價(jià)鍵。在一些實(shí)施方案中，在外部刺激后，化學(xué)連接基團(tuán)可在少于30分鐘內(nèi)形成共價(jià)鍵。

化學(xué)連接基團(tuán)(cl)的非限制性實(shí)例顯示于圖2中。例如，化學(xué)連接基團(tuán)可以包含疊氮化物()、硫醚(參見式(i))、含氮(例如四唑)環(huán)(參見式(ii))、炔基(rc≡ch)、烯基(rc=ch2)、鹵素基團(tuán)(例如，-cl、-br、-i)或任何其他適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)連接基團(tuán)。圖2還顯示可引發(fā)兩個(gè)潛在化學(xué)連接基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵(如圖的右側(cè)所示)的條件(例如cu(i)、光、肼)。

在其他實(shí)施方案中，可以酶促引發(fā)化學(xué)連接。例如，酪酰胺或醌甲基化物前體可用作化學(xué)連接基團(tuán)，其與鄰近酶相互作用以形成反應(yīng)性物質(zhì)。反應(yīng)性物質(zhì)與可用的反應(yīng)性部分(例如胺或硫醇基團(tuán))形成鍵，以在酪酰胺和可用的反應(yīng)性基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵。

可切割橋組分的切割位點(diǎn)可以包含任何適當(dāng)?shù)那懈钗稽c(diǎn)。通常已知的切割位點(diǎn)包括但不限于二硫鍵、二醇、硝基苯基衍生物等。二硫鍵切割位點(diǎn)(s-s)顯示于圖4的示意圖(上圖)中?？梢岳缤ㄟ^二硫蘇糖醇(dtt)、β-巰基乙醇(bme)、三(2-羧乙基)膦(tcep)等或其組合來(lái)切割二硫鍵切割位點(diǎn)。二醇，特別是鄰位二醇，切割位點(diǎn)可以例如(通過naio4)來(lái)切割。類似地，鄰位羥胺也可以類似地切割。硝基苯基衍生物切割位點(diǎn)可以例如通過紫外光照射來(lái)切割。本發(fā)明不限于上述切割位點(diǎn)和切割誘導(dǎo)劑/催化劑。

可檢測(cè)部分(例如，半抗原)可以是任何適當(dāng)?shù)男》肿臃莾?nèi)源化合物、肽標(biāo)簽、寡核苷酸等。圖4中所示的分子的特征在于包含人流感血凝素(ha-標(biāo)簽)肽(ypydvpdya,seqidno:1)的可檢測(cè)部分。此處，ha肽還充當(dāng)支架以連接切割位點(diǎn)(二硫鍵)和化學(xué)連接基團(tuán)(疊氮化物(n3))，cl-a。配偶體抗體用末端炔基作為不可切割的cl-b修飾以提供綴合物b。

其他分子可以用作可檢測(cè)部分。例如，通常使用的肽半抗原包括flag標(biāo)簽(dykddddk,seqidno:2)、myc標(biāo)簽(eqkliseedl,seqidno:3)、v5標(biāo)簽(gkpipnpllgldst,seqidno:4)、e-標(biāo)簽(gapvpypdplepr,seqidno:5)和vsv標(biāo)簽(ytdiemnrlgk,seqidno:6)。

不希望將本發(fā)明限于任何理論或機(jī)制，肽可以用作可檢測(cè)部分/半抗原，因?yàn)樗鼈兪鞘惺鄣牟⑶疫€可以充當(dāng)三官能分子中的支架。圖5顯示用賴氨酸作為支架的可切割橋組分(三官能分子)的另一個(gè)實(shí)例。

圖7顯示包含抗體和可切割橋組分的綴合物(綴合物a)的合成。將spdp-dpeg8-nhs酯(quantabiodesign,ltd.,plaincity,oh)(參見式(iii))與山羊抗兔抗體綴合。

例如，使用20-30當(dāng)量的spdp-peg8-nhs酯，并將反應(yīng)物在室溫下保持至少2小時(shí)，并使用zeba旋轉(zhuǎn)柱(thermofisherscientificinc.,rockford,il)純化修飾的抗體，并用pbs(ph=7.2))洗脫。然后用~10當(dāng)量的肽cys-ha-n3(bio-synthesisinc,lewisville,tx)(參見式(iv))(其包含血凝素(ha)可檢測(cè)部分和疊氮化物化學(xué)連接基團(tuán))處理修飾的抗體，并在室溫下孵育過夜。

通過使用superdex20010/300gl柱在akta純化儀(gehealthcarebio-sciences,pittsburgh,pa)上的大小排阻色譜法純化最終綴合物gar-peg8-ss-ha-n3(綴合物a)并用pbs(0.1m,ph=7.2)洗脫。典型的色譜圖顯示于圖8中。洗脫結(jié)束時(shí)的峰表明作為與spdp標(biāo)記的抗體的cys-肽綴合的結(jié)果存在2-吡啶硫酮(e343nm~8000cm^-1m^-1)。圖7的該綴合物a包含二硫化物可切割鍵、ha-標(biāo)簽可檢測(cè)部分和疊氮化物化學(xué)連接基團(tuán)。

存在各種構(gòu)建修飾的特異性結(jié)合分子(綴合物a、b)的方法，并且本發(fā)明不限于本文所述的那些。在一些實(shí)施方案中，在肽與抗體綴合后形成可切割接頭(切割位點(diǎn))(參見圖7，其中肽與spdp修飾的抗體綴合)?；蛘撸梢杂靡呀?jīng)含有所有三種官能團(tuán)(可切割接頭/切割位點(diǎn)、化學(xué)連接基團(tuán)、可檢測(cè)部分)的分子直接修飾抗體(例如參見圖5)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以使用替代合成機(jī)制，其中在各個(gè)或同時(shí)階段將官能團(tuán)添加至分子。

綴合物b和不可切割橋組分

分子諸如抗體用不可切割橋組分修飾。圖1c顯示不可切割橋組分(三官能分子)的示意性結(jié)構(gòu)。不可切割橋組分在其末端處或附近包含化學(xué)連接基團(tuán)(cl)。

在一些實(shí)施方案中，所述抗體用至少兩個(gè)不可切割橋組分修飾。在一些實(shí)施方案中，所述抗體用至少三個(gè)不可切割橋組分修飾。在一些實(shí)施方案中，所述抗體用至少四個(gè)不可切割橋組分修飾。在一些實(shí)施方案中，所述抗體用至少五個(gè)不可切割橋組分修飾。在一些實(shí)施方案中，所述抗體用至少十個(gè)(或更多個(gè))不可切割橋組分修飾。

如前所討論，不可切割橋組分的化學(xué)連接基團(tuán)(以及可切割橋組分的化學(xué)連接基團(tuán))是生物正交的，例如惰性的，并且在生理?xiàng)l件下是穩(wěn)定的。然而，在適當(dāng)?shù)臈l件(外部刺激)下，兩個(gè)橋組分的化學(xué)連接基團(tuán)容易形成共價(jià)鍵。

如前所討論，化學(xué)連接基團(tuán)(cl)的非限制性實(shí)例顯示于圖2中。例如，化學(xué)連接基團(tuán)可以包含疊氮化物()、硫醚(參見上文，式(i))、四唑環(huán)(參見上文，式(ii))、炔基(rc≡ch)、鹵素基團(tuán)(例如，-cl、-br、-i)、烯基(rc=ch2)或任何其他適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)連接基團(tuán)。圖2還顯示可引發(fā)兩個(gè)潛在化學(xué)連接基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵(如圖的右側(cè)所示)的條件(例如cu(i)、光、肼)。圖4中的實(shí)例(下圖)顯示用包含末端炔基作為化學(xué)連接基團(tuán)(cl-b)的不可切割連接組分修飾的抗體。

本文描述了綴合物b(包含抗體和不可切割橋組分)的合成的非限制性實(shí)例：pbs中的山羊抗小鼠(gam)或山羊抗兔(gar)用15至30當(dāng)量的炔-peg4-nhs酯(clickchemistrytools,scottsdale,az)(參見式(v))處理，并在室溫下孵育至少2小時(shí)。

使用zeba旋轉(zhuǎn)柱純化修飾的抗體，在pbs(0.1m,ph=7.2)中洗脫，以提供gam-peg4-cch或gar-peg4-cch。

如前所討論，可以提供任何適當(dāng)?shù)耐獠看碳ひ詫?shí)現(xiàn)綴合物的化學(xué)連接基團(tuán)之間的共價(jià)鍵。例如，在一些實(shí)施方案中，圖4中顯示的綴合物用銅(i)處理，所述銅(i)催化炔烴的huisgen1,3-偶極環(huán)加成為疊氮化物以形成1,4-二取代的-1,2,3-三唑。在一些實(shí)施方案中，在涉及cu(i)的反應(yīng)中使用配體。一個(gè)實(shí)例是三(3-羥丙基三唑基甲基)胺(thpta)(sigma-aldrich或clickchemistrytools)(參見式(vi))。

本發(fā)明的抗體被選擇為不彼此結(jié)合或彼此聚集，以便防止背景信號(hào)。

不希望將本發(fā)明限于任何理論或機(jī)制，可切割接頭的設(shè)計(jì)允許分離測(cè)定的兩個(gè)主要步驟：化學(xué)連接基團(tuán)在生理?xiàng)l件下是穩(wěn)定的并且僅在適當(dāng)?shù)耐獠看碳ず笈c不可切割接頭的配偶體化學(xué)連接基團(tuán)反應(yīng)。并且，切割位點(diǎn)允許在隨后和分開的步驟期間切割可切割接頭。

可檢測(cè)部分

盡管不是詳盡的，但wo2012024185(其以其整體通過引用并入本文)提供了關(guān)于目前可用的色原和半抗原的公開內(nèi)容。可檢測(cè)標(biāo)記的實(shí)施方案包括半抗原，諸如吡唑類，特別是硝基吡唑類；硝基苯基化合物；苯并呋咱類；三萜類；脲類和硫脲類，特別是苯基脲類，甚至更特別是苯基硫脲類；魚藤酮和魚藤酮衍生物，本文也稱為魚藤酮類；噁唑和噻唑類，特別是噁唑和噻唑磺酰胺類；香豆素和香豆素衍生物；環(huán)木脂體類，例如鬼臼毒素和鬼臼毒素衍生物；及其組合。半抗原及其制備和使用方法的實(shí)施方案公開于美國(guó)專利號(hào)7,695,929，其以其整體通過引用并入本文。

示例性的半抗原包括但不限于bd(苯并二氮雜?)、bf(苯并呋咱)、dabsyl(4-(二甲基氨基)偶氮苯-4'-磺酰胺)、dcc(7-(二乙基氨基)香豆素-3-甲酸)、dig(洋地黃毒苷)、dnp(二硝基苯基)、hq(3-羥基-2-喹喔啉甲酰胺)、nca(硝基肉桂酸)、np(硝基吡唑)、ppt(鬼臼毒素)、rhod(若丹明)、rot(魚藤酮)和ts(噻唑磺酰胺)。其他合適的半抗原包括生物素和熒光素衍生物(fitc(異硫氰酸熒光素))、tamra(四甲基若丹明)、德克薩斯紅等)。

合適的發(fā)色團(tuán)包括香豆素和香豆素衍生物。示例性的基于香豆素的發(fā)色團(tuán)包括dcc和2,3,6,7-四氫-11-氧代-1h,5h,11h-[1]苯并吡喃并[6,7,8-ij]喹嗪-10-甲酸。適合使用的另一類顯色部分包括含重氮色原體，諸如具有約436nm的λmax的dabsyl和具有約427nm的λmax的酒石黃。

在還有其他實(shí)施方案中，發(fā)色團(tuán)可以是三芳基甲烷化合物。示例性的三芳基甲烷發(fā)色團(tuán)提供如下：

。

示例性的環(huán)狀發(fā)色團(tuán)包括但不限于：

其他若丹明衍生物，諸如四甲基若丹明類(包括tmr、tamra和反應(yīng)性異硫氰酸酯衍生物)和二芳基若丹明衍生物，諸如qsy7、qsy9和qsy21染料。

其他示例性的可檢測(cè)標(biāo)記包括試鹵靈，dab；aec；cn；bcip/nbt；快紅；快藍(lán)；洋紅；nbt；alkgold；級(jí)聯(lián)藍(lán)色乙?；B氮化物；dapoxyl磺酸/羧酸琥珀酰亞胺酯；dy-405；alexafluor405琥珀酰亞胺酯；級(jí)聯(lián)黃琥珀酰亞胺酯；吡啶并噁唑琥珀酰亞胺酯(pympo)；太平洋藍(lán)琥珀酰亞胺酯；dy-415；7-羥基香豆素-3-羧酸琥珀酰亞胺酯；dyq-425；6-fam亞磷酰胺；熒光黃；碘乙酰胺；alexafluor430琥珀酰亞胺酯；dabcyl琥珀酰亞胺酯；nbd氯化物/氟化物；qsy35琥珀酰亞胺酯；dy-485xl；cy2琥珀酰亞胺酯；dy-490；俄勒岡綠488羧酸琥珀酰亞胺酯；alexafluor488琥珀酰亞胺酯；bodipy493/503c3琥珀酰亞胺酯；dy-480xl；bodipyflc3琥珀酰亞胺酯；bodipyflc5琥珀酰亞胺酯；bodipyfl-x琥珀酰亞胺酯；dyq-505；俄勒岡綠514羧酸琥珀酰亞胺酯；dy-510xl；dy-481xl；6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯(joe)；dy-520xl；dy-521xl；bodipyr6gc3琥珀酰亞胺酯；赤蘚紅異硫氰酸酯；5-羧基-2',4',5',7'-四溴砜熒光素琥珀酰亞胺酯；alexafluor532琥珀酰亞胺酯；6-羧基-2',4,4',5'7,7'-六氯熒光素琥珀酰亞胺酯(hex)；bodipy530/550c3琥珀酰亞胺酯；dy-530；bodipytmr-x琥珀酰亞胺酯；dy-555；dyq-1；dy-556；cy3琥珀酰亞胺酯；dy-547；dy-549；dy-550；alexafluor555琥珀酰亞胺酯；alexafluor546琥珀酰亞胺酯；dy-548；bodipy558/568c3琥珀酰亞胺酯；若丹明紅-x琥珀酰亞胺酯；qsy7琥珀酰亞胺酯；bodipy564/570c3琥珀酰亞胺酯；bodipy576/589c3琥珀酰亞胺酯；羧基-γ-若丹明(rox)；琥珀酰亞胺酯；alexafluor568琥珀酰亞胺酯；dy-590；bodipy581/591c3琥珀酰亞胺酯；dy-591；bodipytr-x琥珀酰亞胺酯；alexafluor594琥珀酰亞胺酯；dy-594；羧基萘熒光素琥珀酰亞胺酯；dy-605；dy-610；alexafluor610琥珀酰亞胺酯；dy-615；bodipy630/650-x琥珀酰亞胺酯；食用色素亮藍(lán)(erioglaucine)；alexafluor633琥珀酰亞胺酯；alexafluor635琥珀酰亞胺酯,；dy-634；dy-630；dy-631；dy-632；dy-633；dyq-2；dy-636；bodipy650/665-x琥珀酰亞胺酯；dy-635；cy5琥珀酰亞胺酯；alexafluor647琥珀酰亞胺酯；dy-647；dy-648；dy-650；dy-654；dy-652；dy-649；dy-651；dyq-660；dyq-661；alexafluor660琥珀酰亞胺酯；cy5.5琥珀酰亞胺酯；dy-677；dy-675；dy-676；dy-678；alexafluor680琥珀酰亞胺酯；dy-679；dy-680；dy-682；dy-681；dyq-3；dyq-700；alexafluor700琥珀酰亞胺酯；dy-703；dy-701；dy-704；dy-700；dy-730；dy-731；dy-732；dy-734；dy-750；cy7琥珀酰亞胺酯；dy-749；dyq-4；和cy7.5琥珀酰亞胺酯。

實(shí)施例1

實(shí)施例1描述了用于本發(fā)明測(cè)定中的抗體的非限制性實(shí)例。

試劑抗ha抗體：來(lái)自sigma-aldrich(b9183-100ug)的小鼠單克隆抗ha-生物素抗體(克隆ha-7)

鄰近測(cè)定中使用的一抗：抗e-鈣粘蛋白兔單克隆抗體、克隆ep700y(ventana760-4440)、抗e-鈣粘蛋白小鼠單克隆抗體克隆36(ventana790-4497)、抗β-聯(lián)蛋白小鼠單克隆抗體克隆14(ventana760-4242)、抗-p120聯(lián)蛋白小鼠單克隆抗體克隆98(ventana790-4517)、抗her-2/neu兔單克隆抗體克隆4b5(ventana790-2991)、抗pr兔單克隆抗體克隆1e2(ventana790-2223)、抗cd21兔單克隆抗體克隆ep3093(ventana760-4438)、抗cd21小鼠單克隆抗體克隆2g9(ventana760-4245)、抗pms2兔mab克隆epr3947(ventana760-4531)、抗mlh1小鼠mab克隆m1(ventana790-4535)、抗cd19小鼠單克隆抗體克隆le-cd19(genetex,inc.irvine,ca)、抗磷酸酪氨酸小鼠mab克隆p-tyr-100和抗泛素小鼠mab克隆p4d1(cellsignalingtechnology,inc.,danvers,ma)。

實(shí)施例2

實(shí)施例2描述了使用ihc檢測(cè)圖7中的分子(gar-peg8-ss-ha-n3)中作為可檢測(cè)部分/半抗原的ha肽的存在。通過使用抗ki-67(30-9)兔單克隆抗體(ventana790-4286)作為一抗和gar-peg8-ss-ha-n3作為二抗，隨后xha-生物素、sa-hrp和dab染色，證實(shí)扁桃體組織中ki67的檢測(cè)(參見圖9)。實(shí)現(xiàn)了靶標(biāo)的強(qiáng)烈和特異性染色，因此證實(shí)ha標(biāo)簽作為gar綴合物中的半抗原的存在。

實(shí)施例3

實(shí)施例3描述了用于確定從組織完全ha標(biāo)簽切割的條件的實(shí)驗(yàn)：

由于鄰近測(cè)定的讀出值在該具體實(shí)例中基于作為半抗原的ha標(biāo)簽的檢測(cè)，所以從與非鄰近蛋白結(jié)合的抗體完全切割ha標(biāo)簽的能力對(duì)于測(cè)定的整體成功是重要的。殘余的未切割的ha標(biāo)簽可產(chǎn)生背景信號(hào)。這對(duì)于低表達(dá)鄰近事件或當(dāng)采用擴(kuò)增方案時(shí)是重要的問題。根據(jù)本實(shí)施例，使用二硫化物作為可切割接頭，因此使用還原劑(例如dtt或tcep)進(jìn)行切割。為了確定足以實(shí)現(xiàn)完全切割的條件，檢查了已知豐富的靶標(biāo)諸如扁桃體中的ki67和皮膚中的e-鈣粘蛋白的檢測(cè)與酪酰胺(tyramide)-半抗原(例如hq)擴(kuò)增的組合。在實(shí)現(xiàn)完全切割(切割后無(wú)染色)的情況下，將條件鑒定為足夠的。因?yàn)榫Y合物結(jié)構(gòu)未被修飾，所以這些條件被理解為適用于使用該特定綴合物的大多數(shù)測(cè)定法。圖11顯示用于確定完全切割的條件的方案。

如圖12a-圖12d以及圖13a和圖13b中所示，用用于ki-67的75mmdtt和用于e-鈣粘蛋白的50mmdtt處理后，切割是完全的(dtt濃度是添加至每個(gè)載片的100μl溶液，而不是組織上的有效濃度，其通常為添加的濃度的1/3或1/4)。因此，20至25mmdtt有效濃度與24分鐘孵育時(shí)間被確定為對(duì)于當(dāng)前的測(cè)定形式是足夠的。

實(shí)施例4

驗(yàn)證gam-peg4-cch中乙炔基的存在

現(xiàn)在參考圖14，通過用生物素-peg7-n3(quantabiodesign)進(jìn)行原位點(diǎn)擊反應(yīng)(clickreaction)證實(shí)gam-peg4-cch的綴合物中反應(yīng)性乙炔基的存在。具體地，ffpe扁桃體切片首先用ezprep溶液(ventana)脫蠟，并用反應(yīng)緩沖液洗滌。將小鼠抗cd20一抗(克隆l26,ventana760-2531)添加至該切片，并在37℃下孵育16分鐘。用反應(yīng)緩沖液洗滌后，添加100μl10μg/mlgam-peg4-cch，并在37℃下孵育16分鐘，隨后徹底洗滌。然后以兩種不同配體(thpta)濃度向該切片添加100μl的1mm生物素-peg7-n3、0.6mmcuso4、20mm抗壞血酸鈉。在室溫下孵育32分鐘后，將載片充分洗滌。通過使用sa-hrp和dab色原體實(shí)現(xiàn)生物素的檢測(cè)。如下圖中所示，僅當(dāng)添加cu時(shí)才能實(shí)現(xiàn)cd20的特異性檢測(cè)。當(dāng)省略cu時(shí)，完全沒有染色。結(jié)果強(qiáng)烈地表明在gam綴合物中存在反應(yīng)性乙炔官能團(tuán)。圖14a-圖14c是顯示扁桃體切片中cd20的檢測(cè)的顯微照片，其顯示cu(i)/l比率和伴隨染色的效果。圖14a顯示1:5的cu(i)/比率，圖14b顯示1:3的cu(i)/l比率，且圖14c顯示不添加cu(i)的對(duì)照。使用gam-peg4-cch的綴合物中的反應(yīng)性乙炔基(參見實(shí)施例3)。當(dāng)添加cu(i)時(shí)，實(shí)現(xiàn)了cd20的特異性檢測(cè)。當(dāng)省略cu時(shí)，沒有觀察到染色。這表明在gam綴合物中存在反應(yīng)性乙炔官能團(tuán)。

實(shí)施例5

實(shí)施例5描述了使用本發(fā)明的方法的實(shí)驗(yàn)。

用于鄰近測(cè)定的實(shí)驗(yàn)程序

除非另有說(shuō)明，否則所有未明確描述為別處來(lái)源的抗體和ihc試劑都來(lái)自ventanamedicalsystems,inc.(tucson,az;“ventana”)。在ventanabenchmarkxt自動(dòng)化載片處理系統(tǒng)(ventana)上進(jìn)行ihc染色。對(duì)于所有ihc染色，ffpe切片首先用ezprep溶液(ventana)脫蠟，并用反應(yīng)緩沖液洗滌。在cellconditioning1(ventana)中進(jìn)行抗原修復(fù)(100℃；92分鐘)，并再次用1x反應(yīng)緩沖液(ventana)洗滌。將針對(duì)目標(biāo)靶標(biāo)的一抗應(yīng)用于載片并在37℃下孵育32分鐘(參見測(cè)試的抗體對(duì)的結(jié)果)。用反應(yīng)緩沖液徹底洗滌后，將gar-peg8-ss-ha-n3和gam-peg4-cch的二抗綴合物(100μl，各10μg/ml)添加至載片，并在37℃下孵育32分鐘。將載片在反應(yīng)緩沖液和水中洗滌，然后將一滴100μlhepes緩沖液(0.15m,ph7.4)添加至載片。為了起始疊氮化物-乙炔點(diǎn)擊反應(yīng)，將100μl的cu(i)催化劑溶液添加至載片上。cu(i)溶液的一種工作實(shí)例含有0.6mmcuso4、3mmthpta、10mmhepes(ph=7.4)、40%dmso(v/v)和4mm抗壞血酸鈉(新鮮制備并在臨添加至載片前添加至cuso4)。使點(diǎn)擊反應(yīng)進(jìn)行32分鐘，并將載片在反應(yīng)緩沖液中徹底洗滌。接下來(lái)，將100μl50-75mmdtt(二硫蘇糖醇)或tcep(三(2-羧乙基)膦)溶液(sigma-aldrich)添加至載片并孵育24分鐘。dtt或tcep溶液的濃度取決于靶標(biāo)的豐度。高表達(dá)的靶標(biāo)需要更高的dtt或tcep濃度，以確保gar-peg8-ss-ha-n3中二硫鍵的完全切割。洗滌后，通過添加抗ha抗體探測(cè)由于鄰近誘導(dǎo)的半抗原轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致的ha標(biāo)簽的存在。在此處所示的實(shí)施例中，使用用生物素標(biāo)記的小鼠單克隆抗ha抗體(克隆ha-7)(sigma-aldrich,b9183)。將100微升2μg/ml的抗ha生物素添加至每個(gè)載片，隨后洗滌并添加100μl鏈霉抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶(sa-hrp)綴合物(ventana)。對(duì)于使用二氨基聯(lián)苯胺(dab)的基于顯色的檢測(cè)，使用來(lái)自u(píng)ltraviewdab檢測(cè)試劑盒(ventana)的dab、h2o2和銅的即用溶液，隨后用蘇木精ii和bluing(ventana)進(jìn)行復(fù)染。或者，在添加sa-hrp后，用花菁5-酪酰胺綴合物(cy5-tyr)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。使用來(lái)自perkinelmer(waltham,ma)的tsa?pluscyanine5系統(tǒng)試劑盒。將100微升1xplus擴(kuò)增稀釋液中的1:50花菁5-酪酰胺添加至每個(gè)載片并孵育16分鐘。用vectashieldhardset封固介質(zhì)用dapi(h-1500,vectorlaboratories,inc.burlingame,ca)封固載片。使用olympucbx3-cbh顯微鏡獲取熒光圖像。

為了增強(qiáng)檢測(cè)，使用optiview擴(kuò)增試劑盒(ventana860-099)采用酪酰胺信號(hào)擴(kuò)增方案，所述擴(kuò)增試劑盒使用與酪酰胺偶聯(lián)的非內(nèi)源性半抗原3-羥基-2-喹喔啉(hq)。在8分鐘tsa反應(yīng)和去除過量試劑后，添加與hrp綴合的抗hq抗體并孵育16分鐘。最后，以12分鐘反應(yīng)使用ultraviewdab檢測(cè)試劑盒(ventana)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。通過標(biāo)準(zhǔn)明場(chǎng)顯微鏡檢查dab染色。圖10顯示如上所述的ihc程序的主要步驟的流程圖。

結(jié)果

e-鈣粘蛋白/β-聯(lián)蛋白/p120-聯(lián)蛋白復(fù)合物的檢測(cè)

e-鈣粘蛋白(e-cad)/β-聯(lián)蛋白(β-cat)/p120-聯(lián)蛋白(p120)的復(fù)合物(naturereviewsmolecularcellbiology,2005,6,622-634)提供了一種容易獲取的用于表明鄰近測(cè)定的模型。基于一抗的可用性，測(cè)試了三對(duì)靶標(biāo)：e-cad/β-cat、e-cad/p120和e-cadms/rb一抗。還使用兩種類型的陰性對(duì)照：省略一抗之一或省略cu(i)催化劑。此外，在扁桃體和皮膚組織切片上進(jìn)行測(cè)定，以檢查測(cè)定的通用性。結(jié)果顯示于圖16-圖19?，F(xiàn)在參考圖16a-圖16d，其顯示這樣的顯微照片，其中顯示用市售的半抗原-酪酰胺擴(kuò)增(ventanaoptiview擴(kuò)增試劑盒)檢測(cè)正常扁桃體組織切片中的e-鈣粘蛋白(e-cad)/β-聯(lián)蛋白(β-cat)。圖16a顯示省略小鼠抗β-cat的測(cè)定，圖16b顯示省略兔抗e-cad的測(cè)定，圖16c顯示用cu(i)的兔抗e-cad和小鼠抗β-cat鄰近測(cè)定，且圖16d顯示排除cu(i)的兔抗e-cad和小鼠抗β-cat鄰近測(cè)定。

現(xiàn)在參考圖17a-圖17d，其顯示這樣的顯微照片，其中圖17a顯示用于使用cu(i)和ventanaoptiviewdab以及ventana擴(kuò)增試劑盒測(cè)定正常扁桃體切片載片中的e-鈣粘蛋白(e-cad)和p120-聯(lián)蛋白(p120)的鄰近的測(cè)定，且圖17b顯示不包括cu(i)的陰性對(duì)照。圖17c-圖17d是切片的顯微照片，其中用如本文所述的鄰近測(cè)定(圖17c)和排除cu(i)的鄰近測(cè)定(圖17d)使用結(jié)合正常扁桃體組織切片中的蛋白的不同表位的小鼠抗ecad和兔抗ecad一抗檢測(cè)e-鈣粘蛋白。參考圖18a-圖18d，其顯示這樣的顯微照片，其中顯示用擴(kuò)增檢測(cè)用ventanaoptiviewdab染色的正常皮膚組織切片中的e-鈣粘蛋白(e-cad)/β-聯(lián)蛋白(β-cat)。圖18a顯示e-cad和β-cat之間的鄰近測(cè)定，且圖18b是其中排除cu(i)的對(duì)照。圖18c還顯示不同皮膚切片中的e-cad和β-cat之間的鄰近測(cè)定，且圖18d是其中排除cu(i)催化劑的相應(yīng)陰性對(duì)照。

圖19a-圖19c是顯示使用cy5-tyr的正常扁桃體切片中的ecad/β-cat的基于熒光團(tuán)-酪酰胺的檢測(cè)的顯微照片(藍(lán)色=dapi，紅色=用于ecad/β-cat的cy5)。

在所有測(cè)定中，只有當(dāng)存在所有必需組分(一抗和cu(i)催化劑兩者)時(shí)，才實(shí)現(xiàn)陽(yáng)性染色。如果省略一抗之一或cu(i)催化劑，則不能獲得陽(yáng)性染色。這些結(jié)果清楚地表明該測(cè)定對(duì)于ffpe組織的可行性和特異性。此外，可以通過顯色或熒光信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，這表明方法的靈活性。

cd19/cd21復(fù)合物的檢測(cè)

為了進(jìn)一步表明該方法的通用性，進(jìn)行扁桃體中的cd19/cd21復(fù)合物的檢測(cè)。cd19是從前b細(xì)胞至漿細(xì)胞階段表達(dá)的b細(xì)胞特異性跨膜糖蛋白。在成熟b細(xì)胞上，cd19與三種不同的分子締合以形成包含cd21(補(bǔ)體受體2型)、cd81(抗原加工轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1)和leu13(干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白1)的四聚體復(fù)合物(naturereviewsimmunology2,354-363,2002)。結(jié)果顯示于圖20a-圖20d中，其為圖20a中顯示用擴(kuò)增的用ventanaoptiviewdab染色的正常扁桃體組織切片中的cd19/cd21的鄰近測(cè)定的顯微照片。圖20b是圖20a的對(duì)照，其中排除cu(i)。圖20c顯示在正常扁桃體組織中通過使用小鼠抗cd21和兔抗cd21一抗檢測(cè)cd21，且圖20d是圖20c的對(duì)照，其中排除cu(i)。再次，僅當(dāng)應(yīng)用所有必需的抗體和cu(i)催化劑時(shí)才能實(shí)現(xiàn)特異性染色。

實(shí)施例6

實(shí)施例6描述了使用本發(fā)明的方法的實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明可用于檢測(cè)各種翻譯后修飾狀態(tài)，諸如磷酸化、糖基化、泛素化、亞硝基化、甲基化、乙酰化、脂化和/或等。實(shí)施例4描述了使用本發(fā)明的方法以檢測(cè)蛋白磷酸化和泛素化的實(shí)驗(yàn)。

her2磷酸化的檢測(cè)結(jié)果是calu3異種移植物，其顯示于圖21a-圖21c中。僅當(dāng)應(yīng)用抗her2和抗酪氨酸磷酸化抗體(p-tyr)時(shí)才檢測(cè)到信號(hào)，并且當(dāng)省略抗p-tyr或cu(i)催化劑時(shí)則檢測(cè)不到信號(hào)。

不希望將本發(fā)明限于任何理論或機(jī)制，據(jù)信不可能產(chǎn)生特異性抗體以檢測(cè)具有泛素修飾的特異性蛋白。與其中具有磷酸化氨基酸殘基的肽可以容易地用作免疫原以產(chǎn)生抗體的磷酸化蛋白的檢測(cè)不同，泛素是8.5kda蛋白，因此使得非常難以產(chǎn)生特異性泛素化蛋白的抗體。然而，針對(duì)泛素本身的抗體廣泛可用(例如通過使用全長(zhǎng)泛素作為免疫原產(chǎn)生)，其可以與針對(duì)特定目標(biāo)蛋白的抗體配對(duì)，以提供用于使用本發(fā)明中的鄰近測(cè)定方法檢測(cè)泛素化蛋白的方法。

圖22-圖27涉及用于檢測(cè)泛素化蛋白(例如pr、her2)的測(cè)定法。如圖22中所示，對(duì)蛋白本身特異性的抗體與對(duì)泛素特異性的抗體組合使用。如果兩個(gè)靶標(biāo)非常鄰近(例如蛋白被泛素化)，則可以形成橋組分之間的共價(jià)鍵(在外部刺激(例如催化劑等)后)。然后可以從一抗切割橋組分，并且隨后可以使用檢測(cè)系統(tǒng)(例如，顯色檢測(cè)系統(tǒng))檢測(cè)共價(jià)鍵合的橋組分。對(duì)于圖23-圖26中的測(cè)定，使用小鼠抗泛素(克隆p4d1)mab作為泛抗泛素抗體(cellsignalingtechnology)，且使用兔抗pr(克隆1e2，ventana目錄號(hào)790-2223)作為抗pr抗體。

如圖23-圖26中所示，僅應(yīng)用所有必需的抗體和cu(i)才檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)。有趣的是，信號(hào)似乎是異質(zhì)的，這表明當(dāng)前的原位鄰近測(cè)定法相對(duì)于“研磨和結(jié)合”方法(諸如western印跡)(其中會(huì)丟失異質(zhì)性信息)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。此外，在每個(gè)細(xì)胞中沒有觀察到陽(yáng)性染色，這表明目前方法的極高的距離嚴(yán)格性，因?yàn)閜r和泛素的核共定位(如標(biāo)準(zhǔn)ihc中所示)不足以產(chǎn)生鄰近信號(hào)。此外，染色均位于細(xì)胞核中，這與靶標(biāo)的天然表達(dá)模式一致。對(duì)于圖27中的測(cè)定，使用兔抗her2(克隆4b5，ventana目錄號(hào)790-2991)作為抗her2抗體。并且僅在calu3異種移植物中觀察到陽(yáng)性信號(hào)，其中her2表達(dá)是陽(yáng)性的。

實(shí)施例7

實(shí)施例7描述使用本發(fā)明的鄰近測(cè)定法檢測(cè)mlh1-pms2異源二聚體。圖28a顯示使用兔抗pms2mab(克隆epr3947，ventana760-4531)的hela細(xì)胞異種移植物中pms2的ihc的結(jié)果。預(yù)期的核染色是可見的。圖28b顯示使用兔抗mlh1mab(克隆m1，ventana790-4535)的hela細(xì)胞異種移植物中mlh1的ihc的結(jié)果。證實(shí)預(yù)期的核染色。圖28c顯示使用添加cu(i)催化劑的當(dāng)前方法的mlh1-pms2異源二聚體的鄰近測(cè)定的結(jié)果。注意信號(hào)的核定位和異質(zhì)性。圖28d顯示使用當(dāng)前方法、但沒有添加cu(i)催化劑的mlh1-pms2異源二聚體的鄰近測(cè)定的結(jié)果。結(jié)果進(jìn)一步表明了本發(fā)明的特異性和通用性。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“約”是指±所提及數(shù)字的10％。除了本文描述的那些改變以外，本發(fā)明的各種改變對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，從前面的描述是顯而易見的。此類修改也意欲落入所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。本申請(qǐng)中引用的每個(gè)參考文獻(xiàn)都以其整體通過引用并入本文。

盡管已經(jīng)顯示并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見的是，可以對(duì)其進(jìn)行修改，其不超出所附權(quán)利要求的范圍。因此，本發(fā)明的范圍僅由所附權(quán)利要求限制。權(quán)利要求中記載的參考標(biāo)記是示例性的，并且僅為了易于由專利局審查，并且不以任何方式限制。在一些實(shí)施方案中，本專利申請(qǐng)中給出的附圖按比例繪制，包括角度、尺寸比等。在一些實(shí)施方案中，附圖僅是代表性的，并且權(quán)利要求不受附圖的尺寸所限制。在一些實(shí)施方案中，本文使用短語(yǔ)“包含”描述的本發(fā)明的描述包括可以被描述為“由...組成”的實(shí)施方案，并且因此符合用于使用短語(yǔ)“由...組成”來(lái)請(qǐng)求保護(hù)本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的書面描述要求。

在下面權(quán)利要求中列舉的參考標(biāo)記僅用于容易地審查本專利申請(qǐng)，并且是示例性的，并且不意欲以任何方式將權(quán)利要求的范圍限制為具有附圖中相應(yīng)參考標(biāo)記的特定特征。

序列表

<110>ventanamedicalsystems,inc.

<120>使用化學(xué)連接和半抗原轉(zhuǎn)移的鄰近測(cè)定法

<130>p32348-wo

<150>us62/084452

<151>2014-11-25

<150>us62/116962

<151>2015-02-17

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>9

<212>prt

<213>智人

<400>1

tyrprotyraspvalproasptyrala

15

<210>2

<211>8

<212>prt

<213>智人

<400>2

asptyrlysaspaspaspasplys

15

<210>3

<211>10

<212>prt

<213>智人

<400>3

gluglnlysleuileserglugluaspleu

1510

<210>4

<211>14

<212>prt

<213>智人

<400>4

glylysproileproasnproleuleuglyleuaspserthr

1510

<210>5

<211>13

<212>prt

<213>智人

<400>5

glyalaprovalprotyrproaspproleugluproarg

1510

<210>6

<211>11

<212>prt

<213>智人

<400>6

tyrthraspileglumetasnargleuglylys

1510