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天然加工的HLA限制性癌肽絕對(duì)定量方法與流程

文檔序號(hào):11634482閱讀:518來(lái)源:國(guó)知局
本發(fā)明涉及一種天然加工的hla限制性癌肽絕對(duì)定量方法,即,每細(xì)胞提呈肽拷貝數(shù)的測(cè)定。本發(fā)明不僅可用于開發(fā)抗體療法或肽疫苗,而且對(duì)分子免疫監(jiān)測(cè)有很高的價(jià)值,對(duì)識(shí)別免疫治療策略中新肽抗原的過(guò)程有用,如,各個(gè)疫苗、基于抗體的療法或癌癥、感染性和/或自身免疫性疾病中過(guò)繼t細(xì)胞轉(zhuǎn)移方法。發(fā)明領(lǐng)域深入了解人類白細(xì)胞抗原(hla)結(jié)合肽在原發(fā)疾病組織中的表達(dá)水平可大大改進(jìn)開發(fā)癌癥免疫療法以及自身免疫和感染疾病的免疫治療,從而誘發(fā)免疫系統(tǒng)t細(xì)胞對(duì)抗癌癥。該信息與基于抗體療法或肽疫苗相關(guān),特別地,與基于蛋白質(zhì)、dna或rna等分子實(shí)體的任何其他類型的t細(xì)胞疫苗相關(guān)。對(duì)于患者來(lái)源組織,之前沒(méi)有每個(gè)細(xì)胞規(guī)模絕對(duì)拷貝的這種量化數(shù)據(jù)。ep1508047b1中披露了上述避免“反向免疫學(xué)”相關(guān)問(wèn)題的肽的一種識(shí)別方法。如上所述,該方法不能用于所述肽的定量分析。wo2005/076009中披露了運(yùn)用標(biāo)記策略的另一種方法,其中允進(jìn)行一些定量分析,但不能在絕對(duì)的規(guī)模上進(jìn)行。例如,wo03/025576中披露了其他標(biāo)記方法,martin等人在《蛋白質(zhì)組學(xué)》(proteomics2003,3,2208-2220)一文中也進(jìn)行了披露。fortier等人披露了另一種方法(themhcclassipeptiderepertoireismoldedbythetranscriptome,jem,vol.205,no.3,march17,2008595-610)。該方法的缺點(diǎn)是:由于酸洗脫,需要從非mhc結(jié)合肽中剝離出mhc結(jié)合肽。這使用b2m-敲除細(xì)胞株實(shí)施。因此,該方法不能用于原發(fā)患者腫瘤材料。在該方法中,原發(fā)鼠胸腺細(xì)胞與鼠el4細(xì)胞株進(jìn)行了對(duì)比。起始量透過(guò)測(cè)量mhc-i分子進(jìn)行了調(diào)整。僅此一項(xiàng)大大限制了fortier等人披露的方法。另外,沒(méi)有應(yīng)用不同尺寸和來(lái)源的原發(fā)組織所需要的正態(tài)化。相反,使用均衡的起始原料,讓正態(tài)化過(guò)時(shí)。然而,對(duì)于主要(患者)材料正態(tài)化是絕對(duì)必要的。wo2011/128448披露了從大規(guī)模原生組織標(biāo)本中定量識(shí)別相關(guān)hla-結(jié)合肽抗原而無(wú)需標(biāo)記的一種方法。該方法包括提供至少一個(gè)患病初生組織樣本和至少一個(gè)初生健康組織樣本的步驟,初生健康組織優(yōu)選對(duì)應(yīng)于患病組織,從所述樣本中分離mhc肽配體,對(duì)所述mhc配體肽執(zhí)行hplc-ms分析,提取每個(gè)信號(hào)的前體離子信號(hào)強(qiáng)度(面積)(如來(lái)自于分析),確定所述mhc配體肽的序列,和使其他步驟以及數(shù)據(jù)質(zhì)量控制步驟正?;员阆鄬?duì)量化所述mhc肽配體而無(wú)須標(biāo)記。hassan等人(在:hassanc,etal,accuratequantitationofmhc-boundpeptidesbyapplicationofisotopicallylabeledpeptidemhccomplexes,jprot(2014),http://dx.doi.org/10.1016/j.jprot.2014.07.009)中披露一種方法,在這種方法中,在細(xì)胞裂解后(即,正常樣本加工之前)制備和直接加入同位素標(biāo)記肽mhc單體(hpmhc)。使用這種方法,樣本加工期間所有的損失均可計(jì)入,并且可對(duì)特定的mhci類提呈配體進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。該研究查明了免疫純化步驟是樣本預(yù)處理期間極端損失的原因,并為這些損失提供了解決方案。提出的策略可用于獲得表位拷貝數(shù)的可靠視圖,因此,可改進(jìn)疫苗設(shè)計(jì)和免疫治療策略。能否刺激免疫反應(yīng)取決于是否存在被宿主免疫系統(tǒng)視為異物的抗原。發(fā)現(xiàn)存在腫瘤相關(guān)以及疾病抗原增加了運(yùn)用宿主免疫系統(tǒng)干預(yù)腫瘤生長(zhǎng)的可能性。目前,針對(duì)癌癥免疫治療,正在探索利用免疫系統(tǒng)的體液和細(xì)胞進(jìn)行免疫的各種機(jī)制。細(xì)胞免疫反應(yīng)的特定元素能特異性地識(shí)別和破壞腫瘤細(xì)胞。從腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞群或外周血中分離出的細(xì)胞毒性t-細(xì)胞(ctl)表明,這些細(xì)胞在癌癥的天然免疫防御中發(fā)揮了重要作用。尤其是識(shí)別與主要組織兼容性復(fù)合體(mhc)i類分子結(jié)合的肽的cd8陽(yáng)性t細(xì)胞(t-cd8+)。通常8至12個(gè)氨基酸殘基的這些肽源自蛋白質(zhì)或位于細(xì)胞質(zhì)的缺損核糖體產(chǎn)物(drip),在這種反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。人mhc分子也稱為人白細(xì)胞-抗原(hla)。mhc分子有兩類:大部分有細(xì)胞核的細(xì)胞上都可發(fā)現(xiàn)的mhc-i類分子。mhc分子分別由一條α重鏈和β-2-微球蛋白(mhc-i類受體)或一條α和一條β鏈(mhc-ii類受體)組成。其三維構(gòu)造形成一個(gè)結(jié)合槽,用于與肽進(jìn)行非共價(jià)相互作用。mhc-i類分子提呈主要為內(nèi)源性的蛋白、drips和較大肽裂解生成的肽。mhcii類分子主要發(fā)現(xiàn)于專業(yè)抗原提呈細(xì)胞(apc)上,并且主要提呈在內(nèi)吞作用過(guò)程中由apc占據(jù)并且隨后被加工的外源性或跨膜蛋白的肽。肽和mhci類分子的復(fù)合體由負(fù)載相應(yīng)tcr(t細(xì)胞受體)的cd8陽(yáng)性細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別,而肽和mhcii類分子的復(fù)合體由負(fù)載相應(yīng)tcr的cd4陽(yáng)性輔助t細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別。因此,tcr、肽和mhc按照1∶1∶1的化學(xué)計(jì)量呈現(xiàn),這一點(diǎn)已是共識(shí)。對(duì)于觸發(fā)(引發(fā))細(xì)胞免疫反應(yīng)的肽,它必須與mhc分子結(jié)合。這一過(guò)程依賴于mhc分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特異性多態(tài)性。mhc-i類-結(jié)合肽的長(zhǎng)度通常為8-12個(gè)氨基酸殘基,并且在其與mhc分子相應(yīng)結(jié)合溝槽相互作用的序列中通常包含兩個(gè)保守殘基(″錨″)。這樣,每個(gè)mhc等位基因都有一個(gè)″結(jié)合基序″,可控制肽與結(jié)合溝槽特異性結(jié)合的能力。在mhc-i類依賴性免疫反應(yīng)中,肽不僅能與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的某些mhc-i類分子結(jié)合,而且它們還必須能被t細(xì)胞特異性t細(xì)胞受體(tcr)識(shí)別。腫瘤特異性細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞所識(shí)別的抗原,即它們的表位,可以是源自所有蛋白類型的分子,如酶、受體、轉(zhuǎn)錄因子等,它們?cè)谙鄳?yīng)的腫瘤細(xì)胞中被表達(dá),并且與同源未變的細(xì)胞相比,其表達(dá)上調(diào)。目前將腫瘤相關(guān)抗原或疾病相關(guān)抗原分類為以下主要幾組:癌-睪丸抗原:t細(xì)胞能夠識(shí)別的最先確認(rèn)的taa[腫瘤相關(guān)抗原;疾病相關(guān)抗原縮寫為daa]屬于這一類抗原,由于其成員表達(dá)于組織學(xué)相異的人腫瘤中、正常組織中、僅在睪丸的精母細(xì)胞/精原細(xì)胞中、偶爾在胎盤中,因此,它最初被稱為癌-睪丸(ct)抗原。由于睪丸細(xì)胞不表達(dá)hlai類和ii類分子,所以,在正常組織中,這些抗原不能被t細(xì)胞識(shí)別,因此在免疫學(xué)上可考慮為具有腫瘤特異性。ct抗原大家熟知的例子是mage家族成員或ny-eso-1。分化抗原:腫瘤和正常組織(腫瘤源自該組織)都含有taa,大多數(shù)taa發(fā)現(xiàn)于黑色素瘤和正常黑色素細(xì)胞中。許多此類黑色素細(xì)胞譜系相關(guān)蛋白參與黑色素的生物合成,因此這些蛋白不具有腫瘤特異性,但是仍然被廣泛地用于癌癥的免疫治療。例子包括,但不僅限于,黑色素瘤的酪氨酸酶和melan-a/mart-1或前列腺癌的psa。過(guò)量表達(dá)的taa:在組織學(xué)相異的腫瘤中以及許多正常組織中都檢測(cè)到了基因編碼被廣泛表達(dá)的taa,一般表達(dá)水平較低。有可能許多由正常組織加工和潛在提呈的表位低于t細(xì)胞識(shí)別的閾值水平,而它們?cè)谀[瘤細(xì)胞中的過(guò)量表達(dá)能夠透過(guò)打破先前確立的耐受性而引發(fā)抗癌反應(yīng)。這類taa的典型例子為her-2/neu、生存素、端粒酶或wt1。腫瘤特異性抗原:這些獨(dú)特的taa產(chǎn)生于正?;?如β-catenin、cdk4等)的突變。這些分子變化中有一些與致瘤性轉(zhuǎn)化和/或進(jìn)展相關(guān)。腫瘤特異性抗原一般可在不對(duì)正常組織帶來(lái)自體免疫反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的情況下誘導(dǎo)很強(qiáng)的免疫反應(yīng)。另一方面,這些taa在多數(shù)情況下只與其上確認(rèn)了有taa的確切腫瘤相關(guān),并且通常在許多個(gè)體腫瘤之間并不都共享taa。由異常翻譯后修飾產(chǎn)生的taa:此類taa可能由腫瘤中既不具有特異性也不過(guò)量表達(dá)的蛋白產(chǎn)生,但其仍然具有腫瘤相關(guān)性(該相關(guān)性由主要對(duì)腫瘤具有活性的翻譯后加工所致)。此類taa產(chǎn)生于變糖基化模式的改變,導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生針對(duì)muc1的新型表位或在降解過(guò)程中導(dǎo)致諸如蛋白拼接的事件,這可能具有也可能不具有腫瘤特異性。腫瘤病毒蛋白:這些tta是病毒蛋白,可在致癌過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,并且由于它們是外源性蛋白(非人源蛋白),所以能夠激發(fā)t細(xì)胞反應(yīng)。這類蛋白的例子有人乳頭狀瘤16型病毒蛋白、e6和e7,它們?cè)趯m頸癌中表達(dá)。對(duì)于被細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞識(shí)別為腫瘤特異性或相關(guān)性抗原、或疾病特異性或相關(guān)性抗原以及用于治療的蛋白質(zhì),必須具備特殊的條件。該抗原應(yīng)主要由腫瘤細(xì)胞或受感染細(xì)胞表達(dá),而并非完全由正常健康組織表達(dá),或表達(dá)數(shù)量相對(duì)較少,例如:少于因子5、10或更多。在傳染病中有兩種可能性,第一,受感染細(xì)胞表達(dá)一種健康細(xì)胞不表達(dá)的抗原-與感染直接相關(guān)-或受感染細(xì)胞過(guò)量表達(dá)一種只有健康細(xì)胞極少量表達(dá)的抗原-抗原過(guò)量表達(dá)通常存在于健康細(xì)胞的多肽中。更為適宜的情況是,該相應(yīng)抗原不僅出現(xiàn)于一種腫瘤、感染或緊張中,而且濃度(即每個(gè)細(xì)胞的相應(yīng)肽拷貝數(shù)目)高。腫瘤特異性和相關(guān)性抗原以及疾病特異性或相關(guān)性抗原往往是源自直接參與因細(xì)胞周期控制或凋亡抑制中的一項(xiàng)功能而發(fā)生的正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的蛋白。在癌癥的情況下,這些直接導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的蛋白的其他下游靶標(biāo)也可能會(huì)被上調(diào),因此可能間接與腫瘤相關(guān)。這些間接腫瘤相關(guān)抗原也可能是預(yù)防接種方法的靶標(biāo)(singh-jasujah.,emmerichn.p.,rammenseeh.g.,cancerimmunol.immunother.2004mar;453(3):187-95).在這兩種情況中,至關(guān)重要的是,都要存在抗原氨基酸序列的表位,所以這種來(lái)自腫瘤相關(guān)或疾病相關(guān)抗原的肽(″免疫原性肽″)可導(dǎo)致體外或體內(nèi)t細(xì)胞反應(yīng)?;旧?,任何能與mhc分子結(jié)合的肽都可能充當(dāng)一個(gè)t細(xì)胞表位。誘導(dǎo)體外或體內(nèi)t細(xì)胞反應(yīng)的前提是存在具有相應(yīng)tcr的t細(xì)胞,并且不存在對(duì)該特定表位的免疫耐受性。因此,taa和daa是開發(fā)腫瘤疫苗的起點(diǎn)。識(shí)別和表征taa和daa的方法基于對(duì)患者或健康受試者ctl的使用情況,或基于腫瘤與正常組織肽之間差別轉(zhuǎn)錄特性或差別表達(dá)模式的產(chǎn)生。然而,對(duì)腫瘤組織或人腫瘤細(xì)胞株中過(guò)量表達(dá)或選擇性表達(dá)的基因的識(shí)別并不提供在免疫療法中使用這些基因所轉(zhuǎn)錄抗原的準(zhǔn)確信息。這是因?yàn)?,有著相?yīng)tcr的t細(xì)胞必須要存在,而且對(duì)這個(gè)特定表位的免疫耐受性必須不存在或?yàn)樽畹退?,因此,這些抗原的表位只有一部分適合這種應(yīng)用。因此,只選擇那些蛋白過(guò)量表達(dá)或選擇性表達(dá)的肽,并且這些肽是與可找到對(duì)抗性功能性t細(xì)胞的mhc分子結(jié)合在一起被提呈,這一點(diǎn)非常重要。這種功能性t細(xì)胞被定義為在以特異性抗原刺激后能夠克隆地?cái)U(kuò)展并能夠執(zhí)行效應(yīng)子功能(″效應(yīng)子t細(xì)胞″)的t細(xì)胞。輔助t細(xì)胞在編排抗腫瘤免疫的ctl效應(yīng)子功能中發(fā)揮著重要作用。觸發(fā)th1細(xì)胞反應(yīng)的輔助t細(xì)胞表位支持cd8陽(yáng)性殺傷t細(xì)胞的效應(yīng)子功能,其中包括直接作用于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能(該類腫瘤細(xì)胞表面顯示有腫瘤相關(guān)肽/mhc復(fù)合體)。這樣,單獨(dú)形式的或與其他腫瘤相關(guān)肽形成組合物的腫瘤相關(guān)t輔助細(xì)胞肽表位可作為刺激抗腫瘤免疫反應(yīng)疫苗組合物的活性藥物成分。了解hla-i或ii類提呈肽的準(zhǔn)確拷貝數(shù)在基礎(chǔ)與臨床免疫學(xué)中非常重要。目前,拷貝數(shù)最好的確定方法是基于質(zhì)譜法,采用單反應(yīng)監(jiān)測(cè)(srm)結(jié)合已知量的同位素標(biāo)記肽。然而,這些方法仍不足夠精確以被有效地用在上述方法中。因此,鑒于上述情況,本發(fā)明的目的是提供一種hla-i或ii類提呈配體拷貝數(shù)的絕對(duì)判定方法,其精確、高效、易于處理,并且還可在″高通量″水平上進(jìn)行。技術(shù)人員在研究本發(fā)明的以下說(shuō)明時(shí),本發(fā)明的其他目標(biāo)和優(yōu)勢(shì)將變得明了。在本發(fā)明的第一個(gè)方面,本發(fā)明的目的透過(guò)一種方法解決,即細(xì)胞上至少一種mhc肽配體的絕對(duì)定量方法,所述方法包括a)制備提呈來(lái)自包含細(xì)胞的生物樣本的所述至少一種mhc肽配體的細(xì)胞,b)測(cè)定步驟a)所述制備的細(xì)胞數(shù),c)添加已知量待量化的所述至少一種肽-mhc配體和/或肽-mhc配體復(fù)合物至步驟a)所述制備品(″加樣i″),d)分離來(lái)自步驟c)所述制備品的至少一種mhc肽配體,以獲得肽洗脫物,e)添加已知量待量化的所述至少一種mhc肽配體至所述肽洗脫物(″加樣ii″),f)在所述至少一種mhc肽配體上進(jìn)行質(zhì)譜分析,以產(chǎn)生至少一個(gè)aa)用于步驟d)中分離效率的信號(hào),bb)步驟e)中添加的已知量的所述至少一種mhc肽配體的信號(hào),以及cc)來(lái)自步驟a)所述制備細(xì)胞的所述至少一種mhc肽配體的信號(hào),和;g)定量基于步驟f)中獲得的信號(hào)與以下步驟中獲得的信號(hào)比較的所述至少一種mhc肽配體aa)獲得的細(xì)胞計(jì)數(shù),bb)步驟c)中添加的待量化的已知量所述至少一種肽-mhc配體和/或肽-mhc配體復(fù)合物,和cc)步驟e)中添加的待量化的已知量所述至少一種mhc肽配體,其中,至少部分實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞上至少一種mhc肽配體的絕對(duì)定量。在根據(jù)本發(fā)明的一種方法中,其中幾種樣本進(jìn)行了并行分析,如果分離效率已經(jīng)確定可省略上述步驟c),這是因?yàn)橐粋€(gè)樣本的效率可用來(lái)估計(jì)第二個(gè)mhc肽配體和/或mhc肽配體復(fù)合物的分離效率(即,可以作為一個(gè)交叉參考值)。優(yōu)選方法進(jìn)一步使用從e)中內(nèi)部校準(zhǔn)獲得的信號(hào)(加樣ii)作為從至少一種mhc肽配體分離獲得的信號(hào)的常數(shù)和保存(對(duì)照)參照物(透過(guò)計(jì)算這兩信號(hào)之間的比例)。此比例與確定的校準(zhǔn)曲線相比較,其中還包括在非常相同量的內(nèi)部校準(zhǔn)物,優(yōu)選透過(guò)使用此類內(nèi)部校準(zhǔn)的相同等分試樣。那么,校準(zhǔn)曲線描述了這些比率和肽量之間的關(guān)系。參見(jiàn)圖3及圖例。令人驚訝的是,在本發(fā)明的背景下,發(fā)明人發(fā)現(xiàn),透過(guò)組合上述分析步驟,與幾種不同的非癌組織或未感染組織和器官相比癌癥或其他受感染組織的mhc-(優(yōu)選hla限制)肽水平直接絕對(duì)定量首次成為可能。在本發(fā)明的背景中,″加樣″是指加入已知量或濃度的至少一種,例如,未結(jié)合(″游離″)待量化mhc肽配體至一種樣品,如,制備品(這里指定為″加樣i″)或肽洗脫物(這里指定為″加樣ii″)。加入肽的量/濃度容易調(diào)節(jié),并至少部分依賴于有待加樣的樣本以及用于分析的方法。根據(jù)本發(fā)明所述的一種方法為優(yōu)選,其中至少一種mhc肽配體選自一種腫瘤相關(guān)肽(taa)或疾病相關(guān)肽(daa)。根據(jù)本發(fā)明所述的一種方法為更進(jìn)一步優(yōu)選,其中所述包括細(xì)胞的生物樣本選自一份組織樣本、血液樣本、腫瘤樣本或一份受感染組織樣本。在本發(fā)明的情況下,直接源自受試者(例如:患者)的樣本被稱為「原發(fā)」樣本,例如:原發(fā)組織或腫瘤樣本,而細(xì)胞株樣本為例如:已建立的腫瘤細(xì)胞系。樣品可以是新鮮的也可以是保存的(如:冷凍或制備),只要它們適用于根據(jù)本發(fā)明所述的方法即可。優(yōu)選為一種不含永久細(xì)胞系的生物樣本。作為一種優(yōu)選實(shí)例,可使用與cnbr活化的瓊脂糖凝膠耦合之后經(jīng)酸處理和超濾的hla-a、hla-b、hla-c特異性抗體w6/32或hla-a*02特異性抗體bb7.2以固體組織的免疫沉淀法獲得匯集自激凍(原發(fā))組織樣本的hla肽。對(duì)于不同的hla等位基因,本領(lǐng)域已知的其他特異性抗體可用作為,例如:a*03的gap-a,b等位基因的b1.23.2。存在相應(yīng)的方法來(lái)獲得本領(lǐng)域已知的其他哺乳動(dòng)物的mhc-i類肽。根據(jù)本發(fā)明所述的方法也可用于傳染性疾病,例如:病毒或細(xì)菌感染,如:登革熱、埃博拉病毒、馬爾堡病毒,結(jié)核病(tb)、腦膜炎或梅毒,優(yōu)選情況是,該方法用于抗生素耐藥菌株的傳染性生物體、自身免疫性疾病,如:關(guān)節(jié)炎、寄生蟲感染,瘧疾和其他疾病,如:ms和morbus帕金森,只要靶向基團(tuán)是mhc-i類結(jié)合肽。自身免疫性疾病的實(shí)例(包括未正式宣布為自身免疫性疾病的疾病)有慢性阻塞性肺疾病、強(qiáng)直性脊柱炎、克羅恩病(兩種特發(fā)性炎癥性腸道疾病[″ibd″]中的一種)、皮肌炎、i型糖尿病、子宮內(nèi)膜異位癥、goodpasture氏征候群、graves氏病、格林-巴利征候群(gbs)、橋本氏病、化膿性汗腺炎、川崎病、iga腎病、原發(fā)性血小板減少性紫癜、間質(zhì)性膀胱炎、紅斑狼瘡、混合性結(jié)締組織病、硬斑病、重癥肌無(wú)力、嗜睡癥、神經(jīng)性肌強(qiáng)直、尋常型天皰瘡、惡性貧血、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性肌炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、精神分裂癥、硬皮病、干燥征候群、僵人征候群、顳動(dòng)脈炎(巨細(xì)胞動(dòng)脈炎)、潰瘍性結(jié)腸炎(特發(fā)性炎癥性腸病[″ibd″]兩種類型之一)、脈管炎、白癜風(fēng)以及韋格納肉芽腫。本發(fā)明不局限于人類疾病,但可用于哺乳動(dòng)物,如:牛、豬、馬、貓、狗,嚙齒類動(dòng)物,如:大鼠、小鼠、山羊和其他家畜。在本發(fā)明所述方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案中,細(xì)胞制備至少部分地包括組織的酶消化和/或細(xì)胞裂解。根據(jù)本發(fā)明所述的方法為優(yōu)選,其中所述細(xì)胞計(jì)數(shù)使用選自計(jì)數(shù)細(xì)胞核、亮度dna測(cè)定法、熒光dna測(cè)定法(例如,使用技術(shù))以及定量pcr的一種方法進(jìn)行測(cè)定。此外,根據(jù)本發(fā)明所述的方法為優(yōu)選,進(jìn)一步包括測(cè)定在步驟a)所述制備品中至少一種類型hla分子的量。測(cè)定含量可使用本領(lǐng)域中常用的方法,例如涉及特異性抗體(如elisa、凝膠、細(xì)胞分選和/或?qū)游?的方法來(lái)完成。根據(jù)本發(fā)明所述的一種方法為進(jìn)一步優(yōu)選,其中添加的至少一種mhc復(fù)合物和/或添加的至少一種mhc肽配體被標(biāo)記,優(yōu)選為差異性標(biāo)記。各標(biāo)記物為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知,且包括同位素標(biāo)記、放射性和非放射性標(biāo)記、酶、和優(yōu)選不同質(zhì)量的其他基團(tuán)。優(yōu)選情況是,標(biāo)記特異性針對(duì)待定量的特定肽。最優(yōu)選的情況是雙標(biāo)記taa/tumap,例如,在相同的實(shí)驗(yàn)中需要兩種差異化標(biāo)記進(jìn)樣的情況(參見(jiàn)下文的實(shí)施例)。根據(jù)本發(fā)明所述的一種方法為首選,其中分離包括層析,如:親和層析。因此,孤立的mhc/hla配體根據(jù)其疏水性可用反相色譜(例如:nanoacquityuplc系統(tǒng),waters)分離,之后在orbitrap雜交質(zhì)譜(thermoelectron)中檢測(cè)。每個(gè)樣本透過(guò)采集復(fù)制lcms(舉例)操作結(jié)果而進(jìn)行優(yōu)選分析。然后,lcms數(shù)據(jù)透過(guò)分析串聯(lián)質(zhì)譜(ms/ms)數(shù)據(jù)而進(jìn)行處理。有針對(duì)性方法記錄、著眼于待量化肽m/z值的串聯(lián)ms譜優(yōu)選透過(guò)一種提取預(yù)定義過(guò)渡預(yù)選碎片離子強(qiáng)度的軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。此類軟件的一個(gè)實(shí)例為skyline(macleanbetal.skyline:anopensourcedocumenteditorforcreatingandanalyzingtargetedproteomicsexperiments.bioinformatics.2010apr1;26(7):966-8.,http://dx.doi.org/10.1093/bioinformatics/btq054),分析數(shù)據(jù)獨(dú)立采集(dia)實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)進(jìn)行并行反應(yīng)監(jiān)測(cè)的應(yīng)用程序(prm-靶向ms/ms)。此軟件可為了特定目的而用于共洗脫同位素標(biāo)記肽相關(guān)事項(xiàng),也可用于提取單個(gè)過(guò)渡強(qiáng)度以便進(jìn)一步處理。根據(jù)用于純化的共同等位基因特異性抗體(如果有的話)、或者根據(jù)透過(guò)錨氨基酸模式將序列分配給共同hla等位基因的情況,可以比較不同樣本之間限于相同hla等位基因的肽組別。由于統(tǒng)計(jì)的原因,根據(jù)本發(fā)明所述的一種方法為優(yōu)選,其中對(duì)于每個(gè)至少一種mhc配體肽進(jìn)行至少兩次重復(fù)質(zhì)譜運(yùn)行。因此,本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及根據(jù)本發(fā)明的一種方法,還包括選擇過(guò)量提呈、過(guò)量表達(dá)的和/或腫瘤特異性的mhc肽配體進(jìn)行分析。本發(fā)明的又一個(gè)方面涉及根據(jù)本發(fā)明的一種方法,其中所述方法能夠在高通量的基礎(chǔ)上正在執(zhí)行或執(zhí)行,優(yōu)選至多個(gè)肽配體可以并行進(jìn)行分析。在本發(fā)明所述方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案中,按所附權(quán)利要求中所示順序或上述順序?qū)嵤┧龇椒ǖ牟襟E。在本發(fā)明所述的另一優(yōu)選方法中,所述方法包括上述和此處所述的步驟。在本發(fā)明所述方法的另一方面,所述方法與個(gè)性化治療和診斷相關(guān)。對(duì)于這一點(diǎn),分析的所述樣本源自個(gè)體或有如本文所述相同病癥的一群個(gè)體。此外,基于量化的所述mhc肽配體,個(gè)性化mhc配體特點(diǎn),優(yōu)選為個(gè)性化量化疾病特定mhc配體特點(diǎn),可用本文所述的本發(fā)明方法生成。最優(yōu)選情況為,在體外實(shí)施本發(fā)明中所述的方法。在本發(fā)明所述方法的另一優(yōu)選方面,所述方法進(jìn)一步包括透過(guò)所述方法用合成器或手動(dòng)定量而合成,優(yōu)選為化學(xué)合成所述至少一個(gè)mhc配體肽的步驟。因此,本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及到制備一種免疫活性肽的一種方法,其中,根據(jù)所披露的方法可量化一種肽,并且所述肽可在體外或體內(nèi)進(jìn)行化學(xué)合成。肽可用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法透過(guò)對(duì)氨基酸進(jìn)行化學(xué)聯(lián)接而制備。肽可在體外制備,例如,在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中制備,以及使用細(xì)胞在體內(nèi)制備。肽可按照披露的方法制備,例如:lewandrowski等人的ep2111867發(fā)明中的方法。另一方面涉及根據(jù)本發(fā)明所述的方法,其中,實(shí)施另一步驟,其中,檢測(cè)t淋巴細(xì)胞的存在。使用這種方法,可特定檢測(cè)針對(duì)分離和確定肽的t淋巴細(xì)胞在多大程度上預(yù)先存在于患者中。透過(guò)實(shí)施此步驟,可將t淋巴細(xì)胞已經(jīng)預(yù)先存在于患者時(shí)的那些肽用作一種疫苗。然后,肽可用來(lái)啟動(dòng)這些特異性t淋巴細(xì)胞。另一方面涉及根據(jù)本發(fā)明所述的方法,其中,透過(guò)用抗原提呈分子和抗原肽的重組復(fù)合物標(biāo)記白細(xì)胞而檢測(cè)預(yù)先存在的特定t淋巴細(xì)胞。在本發(fā)明所述方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案中,所述方法進(jìn)一步排除了使用基因敲除細(xì)胞、細(xì)胞株或動(dòng)物。本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選可選步驟為:根據(jù)摻入所定數(shù)量樣本的加標(biāo)分子而進(jìn)行的自動(dòng)質(zhì)量控制。運(yùn)用根據(jù)本發(fā)明所述的方法,可進(jìn)一步確定患者特定肽,即,可將用作疫苗的肽與患者精確匹配,從而誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)。本發(fā)明的另外方面則涉及一種藥物組合物,包括根據(jù)本發(fā)明所述的方法量化的確定量的一種或多種taa和/或daa肽。例如,組合物可應(yīng)用于腸外、皮下、皮內(nèi)或肌肉內(nèi),也可口服,這取決于劑型和目標(biāo)疾病。為了達(dá)到這樣的目的,肽在藥用載體中溶解或懸浮,優(yōu)選為水載體;組合物可進(jìn)一步包括添加劑,例如緩沖劑、粘合劑等。肽也可與免疫刺激物質(zhì)共同給藥,例如:細(xì)胞因子。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面,肽可用于治療腫瘤性疾病以及制備一種治療腫瘤疾病的藥物。要治療的腫瘤疾病包括實(shí)體瘤,如腎、乳腺、胰腺、胃、睪丸和/或皮膚癌或血液癌癥,如:aml。該腫瘤疾病清單僅為示例,并不用于限制應(yīng)用領(lǐng)域。肽可以進(jìn)一步用于評(píng)估腫瘤疾病的療程。肽還可用于監(jiān)測(cè)其他免疫接種的治療或某些治療。因此,肽不僅可用于治療,還可用于診斷。本發(fā)明的另一方面涉及使用量化的肽生成抗體。多克隆抗體可用一般方式獲得,方法是透過(guò)注射肽對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫接種隨后純化免疫球蛋白。單克隆抗體可根據(jù)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)化方案產(chǎn)生。本發(fā)明與基于抗體的方法特別相關(guān),因?yàn)榘屑?xì)胞細(xì)胞表面上的靶拷貝數(shù)可確定和/或反映該靶是否可以由抗體解決問(wèn)題,如果可以,可使用哪些效應(yīng)功能,例如共軛藥物、毒素、雙特異性抗體招募t細(xì)胞或其他效應(yīng)細(xì)胞。其他方面涉及在所謂的支架形成分子中的使用,如核酸適體(靶-結(jié)合寡核酸或肽分子)和/或可溶性t細(xì)胞受體(tcr)。在這里,類似于抗體,拷貝數(shù)量決定所需的親合力和效應(yīng)功能。對(duì)于所述支架分子。能否刺激免疫反應(yīng)取決于是否存在被宿主免疫系統(tǒng)視為異物的抗原。發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)抗原增加了運(yùn)用宿主免疫系統(tǒng)干預(yù)腫瘤生長(zhǎng)的可能性。對(duì)于癌癥免疫療法,目前正在探索控制免疫系統(tǒng)中的體液和細(xì)胞免疫的各種機(jī)制。細(xì)胞免疫反應(yīng)的特定元素能特異性地識(shí)別和破壞腫瘤細(xì)胞。從腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞群或外周血中分離出的細(xì)胞毒性t-細(xì)胞(ctl)表明,這些細(xì)胞在癌癥的天然免疫防御中發(fā)揮了重要作用。特別是cd8陽(yáng)性t細(xì)胞在這種反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,它能識(shí)別源自蛋白或位于細(xì)胞質(zhì)的缺損核糖體產(chǎn)物(drip)的通常8至12個(gè)氨基酸殘基,由主要組織兼容性復(fù)合體(mhc)i類分子所載的肽。人mhc分子也稱為人白細(xì)胞-抗原(hla)。mhc-i類分子,在細(xì)胞核提呈因主要內(nèi)源性、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核蛋白質(zhì)、drips和較大肽,蛋白裂解產(chǎn)生的肽的大多數(shù)有核細(xì)胞上都能發(fā)現(xiàn)。然而,源自內(nèi)體結(jié)構(gòu)或外源性來(lái)源的肽也經(jīng)常在mhc-i類分子上發(fā)現(xiàn)。這種i-類分子非經(jīng)典提呈方式在文獻(xiàn)中被稱為交叉提呈。對(duì)于被細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞識(shí)別為腫瘤特異性抗原或相關(guān)性抗原以及用于治療的蛋白質(zhì),必須具備特殊的條件。該抗原應(yīng)主要由腫瘤細(xì)胞表達(dá),而正常健康組織根本不表達(dá)或表達(dá)數(shù)量較少。更為適宜的情況是,該相應(yīng)抗原不僅出現(xiàn)于一種腫瘤中,而且濃度(即每個(gè)細(xì)胞的相應(yīng)肽拷貝數(shù)目)高。腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)抗原通常是源于由于細(xì)胞周期調(diào)控或凋亡等功能在正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞中直接受累的蛋白。另外,這些直接導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的蛋白的下游靶標(biāo)也可能會(huì)被上調(diào),因此間接與腫瘤相關(guān)。這些間接腫瘤相關(guān)抗原也可能是預(yù)防接種方法的靶標(biāo)。至關(guān)重要的是,在這兩種情況中,都存在抗原氨基酸序列的表位,所以這種來(lái)自腫瘤相關(guān)或疾病相關(guān)抗原的肽(″免疫原性肽″)可導(dǎo)致體外或體內(nèi)t細(xì)胞反應(yīng)。基本上,任何能與mhc分子結(jié)合的肽都可能充當(dāng)一個(gè)t細(xì)胞表位。誘導(dǎo)體外或體內(nèi)t細(xì)胞反應(yīng)的前提是存在具有相應(yīng)tcr的t細(xì)胞并且不存在對(duì)該特定表位的免疫耐受性。因此,taa是腫瘤疫苗研制的起點(diǎn)。識(shí)別和表征taa的方法基于對(duì)患者或健康受試者ctl的使用情況,或基于腫瘤與正常組織肽之間差別轉(zhuǎn)錄特性或差別表達(dá)模式的產(chǎn)生(lemmeletal.450-54;weinschenketal.5818-27)。然而,對(duì)腫瘤組織或人腫瘤細(xì)胞株中過(guò)量表達(dá)或選擇性表達(dá)的基因的識(shí)別并不提供在免疫療法中使用這些基因所轉(zhuǎn)錄抗原的準(zhǔn)確信息。這是因?yàn)?,有著相?yīng)tcr的t細(xì)胞必須要存在而且對(duì)這個(gè)特定表位的免疫耐受性必須不存在或?yàn)樽畹退?,因此,這些抗原的表位只有一部分適合這種應(yīng)用。因此,只選擇那些蛋白過(guò)量表達(dá)或選擇性表達(dá)的肽,并且這些肽是與可找到對(duì)抗性功能性t細(xì)胞的mhc分子結(jié)合在一起被提呈,這一點(diǎn)非常重要。這種功能性t細(xì)胞被定義為在以特異性抗原刺激后能夠克隆地?cái)U(kuò)展并能夠執(zhí)行效應(yīng)子功能(″效應(yīng)子t細(xì)胞″)的t細(xì)胞??紤]到治療癌癥相關(guān)的嚴(yán)重副作用和費(fèi)用,迫切需要更好的預(yù)后和診斷方法。本文所用″肽″這一術(shù)語(yǔ),系指一系列氨基酸殘基,通常透過(guò)相鄰氨基酸的α-氨基和羰基之間的肽鍵來(lái)連接。這些肽的長(zhǎng)度優(yōu)選為9個(gè)氨基酸,但長(zhǎng)度可短至8個(gè)氨基酸,以及可長(zhǎng)至10、11、12、13或14個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。本文使用的術(shù)語(yǔ)″寡肽″是指一系列氨基酸殘基,通常透過(guò)相鄰氨基酸的α-氨基和羰基之間的肽鍵來(lái)連接。寡肽的長(zhǎng)度對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)并不十分關(guān)鍵,只要在寡肽中保持正確的表位即可。通常,寡肽長(zhǎng)度約小于30個(gè)氨基酸殘基,約長(zhǎng)于14個(gè)氨基酸?!宥嚯摹暹@一術(shù)語(yǔ)是指一系列氨基酸殘基,通常透過(guò)相鄰氨基酸的α-氨基和羰基之間的肽鍵來(lái)連接。多肽的長(zhǎng)度對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)并不十分關(guān)鍵,只要保持正確的表位即可。與術(shù)語(yǔ)肽或寡肽相對(duì),″多肽″這一術(shù)語(yǔ)是指包含多于約30個(gè)氨基酸殘基的分子。肽、寡肽、蛋白質(zhì)或編碼此類分子的核苷酸如果能誘導(dǎo)免疫反應(yīng),則具有″免疫原性″(因此是本發(fā)明中的一種″免疫原″)。在本發(fā)明的情況下,免疫原性的更具體定義是誘導(dǎo)t細(xì)胞反應(yīng)的能力。因此,″免疫原性″是一種能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的分子,并且在本發(fā)明的情況下,是一種能誘導(dǎo)t細(xì)胞反應(yīng)的分子。t細(xì)胞″表位″要求的是一種結(jié)合至mhci類受體上的短肽,從而形成一種三元復(fù)合體(mhci類α鏈、β-2-微球蛋白和肽),其可以透過(guò)t細(xì)胞負(fù)載匹配t細(xì)胞受體與具有適當(dāng)親和力的mhc/肽復(fù)合物結(jié)合來(lái)識(shí)別。結(jié)合至mhci類分子的肽的典型長(zhǎng)度為8-14個(gè)氨基酸,最典型的長(zhǎng)度為9個(gè)氨基酸。在當(dāng)前的描述中,以癌癥為例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。然而,只要各自的免疫應(yīng)答是涉及mhci類分子的應(yīng)答,則本發(fā)明的方法也可以應(yīng)用于感染性疾病、自身免疫性疾病和寄生蟲感染。下列實(shí)施例將進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明,但是,不僅限于此。在隨附的圖和序列表中,圖1:顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)方法的一般示意圖概述。圖2:顯示了tumap混合物與表1每tumap10fmol的比較ms分析。每個(gè)肽導(dǎo)致不同的ms信號(hào),顯示肽依賴性檢測(cè)能力。肽5未在表1中列出,即表1中序列1-4對(duì)應(yīng)于圖2中的第1-4項(xiàng),表1中序列5-11對(duì)應(yīng)于圖1中第6-12項(xiàng)。此外,圖2中的肽19、21和22未在表2中列出,即圖2中序列13-18對(duì)應(yīng)于表2中的第12-17項(xiàng),圖2中序列20對(duì)應(yīng)于表2中的第18項(xiàng),圖2中序列23-28對(duì)應(yīng)于表2中的第19-24項(xiàng)。圖3:顯示了內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)方法的原則。校準(zhǔn)曲線由tumap同位素標(biāo)記版本(淺灰色示出)的滴定生成。對(duì)于所有的ms測(cè)量值,tumap內(nèi)標(biāo)肽(暗灰色示出)另一同位素標(biāo)記版本的恒定量摻入ms樣本。校準(zhǔn)曲線函數(shù)根據(jù)ms信號(hào)的比值用邏輯回歸法來(lái)計(jì)算。lloq用目視檢查法確定,并考慮與線性的偏差?!宥繕颖尽?以綠色示出)表示選擇用于tumap數(shù)量絕對(duì)定量的腫瘤樣本中測(cè)得的信號(hào)強(qiáng)度。圖4:顯示了選擇用于絕對(duì)定量的hla-a*02tumap的校準(zhǔn)曲線。每個(gè)圖表中包括了用于每個(gè)細(xì)胞絕對(duì)tumap數(shù)量(″定量樣本″)分析的腫瘤組織樣本中各tumap的ms結(jié)果。圖5:顯示了選擇用于絕對(duì)定量的hla-a*02tumap的其他校準(zhǔn)曲線。每個(gè)圖表中包括了用于每個(gè)細(xì)胞絕對(duì)tumap數(shù)量(″定量樣本″)分析的腫瘤組織樣本中各tumap的ms結(jié)果。圖6:顯示了選擇用于絕對(duì)定量的hla-a*24tumap的校準(zhǔn)曲線。每個(gè)圖表中包括了用于每個(gè)細(xì)胞絕對(duì)tumap數(shù)量(″定量樣本″)分析的腫瘤組織樣本中各tumap的ms結(jié)果。圖7:顯示了選擇用于絕對(duì)定量的hla-a*24tumap的其他校準(zhǔn)曲線。每個(gè)圖表中包括了用于每個(gè)細(xì)胞絕對(duì)tumap數(shù)量(″定量樣本″)分析的腫瘤組織樣本中各tumap的ms結(jié)果。圖8:顯示了所分析的所有tumap的ms反復(fù)測(cè)量值的估計(jì)變化。每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)特定組織樣本個(gè)體tumapms復(fù)制的變異系數(shù)(cv,%)。所有tumap的中值cv被認(rèn)為ms復(fù)制操作的平均變異。圖9:顯示了肽mhc分離的效率。對(duì)于肽mhc分離的效率,a*02tumap在8個(gè)a*02陽(yáng)性樣本中確定(a),a*24tumap在6個(gè)a*24陽(yáng)性樣本確定(b)。平均來(lái)說(shuō),對(duì)于分離效率,a*02tumap變化為24%,a*24tumap為32%(c)。圖10:顯示了dna含量分析的評(píng)價(jià)方法。a.給定dna量細(xì)胞計(jì)數(shù)插補(bǔ)三種不同方法比較:使用來(lái)自腫瘤細(xì)胞系(深灰)、來(lái)自健康供體pbmc(灰色)并使用人二倍體基因組理論重量(淺灰色)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。生物學(xué)復(fù)制,即來(lái)自相同腫瘤不同部分的獨(dú)立組織溶解液制備品(以灰色突出顯示)。b.pbmc標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制圖,其用于確定tumap絕對(duì)定量中分析組織樣本的總細(xì)胞計(jì)數(shù)。圖11顯示了固體、冷凍組織樣本細(xì)胞計(jì)數(shù)的測(cè)定。a*02-和a*24陽(yáng)性腫瘤樣本的細(xì)胞計(jì)數(shù)分析(a)和細(xì)胞計(jì)數(shù)分析估計(jì)變異(b)。生物學(xué)復(fù)制用灰色突出顯示。圖12顯示了hla-a*02tumap的每細(xì)胞肽拷貝數(shù)的結(jié)果。分析了八種不同gc腫瘤,其中三種重復(fù)(生物重復(fù)進(jìn)行分組,并以灰色突出顯示)。lloq指一種ms實(shí)驗(yàn)中的定量范圍,并外推至一種樣本和tumap特異性lloq,即一種特定tumap特定樣本的可定量最低拷貝數(shù)(以灰色示出)。圖13顯示了hla-a*02tumap的每細(xì)胞肽拷貝數(shù)的其他結(jié)果。分析了八種不同gc腫瘤,其中三種重復(fù)(生物重復(fù)進(jìn)行分組,并以灰色突出顯示)。lloq指一種ms實(shí)驗(yàn)中的定量范圍,并外推至一種樣本和tumap特異性lloq,即一種特定tumap特定樣本的可定量最低拷貝數(shù)(以灰色示出)。圖14顯示了hla-a*24tumap的每細(xì)胞肽拷貝數(shù)的結(jié)果。分析了六種不同gc腫瘤,其中三種重復(fù)(生物重復(fù)進(jìn)行分組,并以灰色突出顯示)。lloq指一種ms實(shí)驗(yàn)中的定量范圍,并外推至一種樣本和tumap特異性lloq,即一種特定tumap特定樣本的可定量最低拷貝數(shù)(以灰色示出)。圖15顯示了hla-a*24tumap的每細(xì)胞肽拷貝數(shù)的其他結(jié)果。分析了六種不同gc腫瘤,其中三種重復(fù)(生物重復(fù)進(jìn)行分組,并以灰色突出顯示)。lloq指一種ms實(shí)驗(yàn)中的定量范圍,并外推至一種樣本和tumap特異性lloq,即一種特定tumap特定樣本的可定量最低拷貝數(shù)(以灰色示出)。圖16顯示了在mhc/肽單體制備中使用500fmol游離肽測(cè)試樣本進(jìn)樣的影響。分析中游離肽對(duì)所示的肽無(wú)實(shí)質(zhì)性影響。圖17顯示了使用qubiths(熒光)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的dna分離再現(xiàn)性測(cè)試的結(jié)果。樣本(癌組織樣本,如nsclc)顯示出足夠的同構(gòu)型。從3x50μl等分樣本中分離dna。seqidno.1至24顯示了表1和表2中根據(jù)實(shí)施例選定用于絕對(duì)定量的肽。實(shí)施例:以下實(shí)施例描述了在taa/癌癥情況下的發(fā)明方法。本發(fā)明不僅限于這些實(shí)施例,因?yàn)樗麄儍H僅是本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案??紤]到本發(fā)明的目的,文中引用的所有參考文獻(xiàn)透過(guò)引用的方式并入在本文中。表1:選擇用于絕對(duì)定量的hla-a*02tumap11種肽被選擇用于絕對(duì)定量。表2:選擇用于絕對(duì)定量的hla-a*24tumap14種肽被選擇用于絕對(duì)定量。一種肽(plk4-001)的性質(zhì)被證明不適合于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于其余的13種肽,完成了絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)。實(shí)體腫瘤樣本中每個(gè)細(xì)胞的tumap拷貝數(shù)定量需要(子)定量a)分離的tumap,b)分離期間tumap的損失,以及c)所分析的組織樣本細(xì)胞計(jì)數(shù)。圖1中給出了根據(jù)本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)方法的概述。nanolc-ms/ms肽定量為了透過(guò)質(zhì)譜法準(zhǔn)確定量肽,首先需要學(xué)習(xí)肽量和ms信號(hào)肽特異性相關(guān)性的基礎(chǔ)知識(shí)。例如,每肽10fmol肽混合物的ms測(cè)定值顯示,ms信號(hào)存在較大的肽特異性差異(圖2)。這也暗示了ms可靠量化肽的范圍取決于個(gè)體的肽特性。此外,只能在一定范圍內(nèi)預(yù)期特定肽的量和ms信號(hào)之間線性相關(guān)。因此,發(fā)明人決定確定每種肽的個(gè)體校準(zhǔn)曲線。選定的每個(gè)校準(zhǔn)曲線的范圍可不僅反映肽的個(gè)體定量范圍,而且也可反映先前分析的腫瘤樣本中每種肽的ms信號(hào)范圍。目標(biāo)是,每個(gè)校準(zhǔn)曲線應(yīng)包含至少80%常規(guī)樣本的肽特異性ms信號(hào)范圍。精確校準(zhǔn)曲線的產(chǎn)生需要合成標(biāo)準(zhǔn),其必須用采用一種獨(dú)立的方法進(jìn)行定量,并與天然tumap具有相同的特性。發(fā)明人使用了雙同位素標(biāo)記版本的tumap,即tumap合成期間納入2個(gè)同位素標(biāo)記的氨基酸。根據(jù)標(biāo)記的氨基酸,雙標(biāo)記版本可采用12-18道爾頓的質(zhì)量差異與天然tumap區(qū)分。除了質(zhì)量外,同位素標(biāo)記不會(huì)改變ms中肽的性質(zhì),即,具有相同序列但不同同位素標(biāo)記的肽ms信號(hào)強(qiáng)度相同(andersonetal.,2012)。合成后,雙標(biāo)記tumap透過(guò)氮分析法精確定量,以得出肽量和ms信號(hào)之間的精確相關(guān)性。校準(zhǔn)曲線用至少三種不同的矩陣?yán)L制,即,來(lái)自于類似于常規(guī)ms樣本的天然樣本的hla肽洗脫液,并且每個(gè)制備品以重復(fù)ms運(yùn)行進(jìn)行測(cè)量。為了補(bǔ)償ms運(yùn)行之間的任何技術(shù)變化,內(nèi)標(biāo)肽被納入所有的測(cè)量中。對(duì)滴定肽與固定內(nèi)標(biāo)物ms信號(hào)的比例進(jìn)行作圖,并且校準(zhǔn)曲線采用邏輯回歸進(jìn)行計(jì)算(圖3)。定量下限(lloq)采用目視法確定,并考慮與線性的偏差。如果線性偏差不明顯,如:肽fap-003(圖4),在使用最低肽量的平均比值來(lái)計(jì)算lloq。定量上限,即在較高濃度時(shí)線性偏差,在任何校準(zhǔn)曲線上均未達(dá)到。在實(shí)際定量實(shí)驗(yàn)中,相同量的內(nèi)標(biāo)物被加入各樣本中以作出校準(zhǔn)曲線,并計(jì)算天然肽與內(nèi)標(biāo)肽的比率。這種「內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)法」是基于ms蛋白質(zhì)定量的一種常用方法,例如,用于生物樣本的生物標(biāo)志物分析(sturmetal.,2012;prasadandunadkat,2014;satoetal.,2012)。對(duì)于選定絕對(duì)定量的所有tumap,校準(zhǔn)曲線和實(shí)際腫瘤樣本中測(cè)得的值,示于圖4和圖5(hla-a*02)以及圖6和圖7(hla-a*24)中。為了估計(jì)定量ms測(cè)量值的變化,計(jì)算了每個(gè)ms樣本肽含量的變異系數(shù)(cv,%)。對(duì)每個(gè)ms樣本的cv進(jìn)行作圖,并且ms測(cè)量值的整體變化估計(jì)為中值cv(圖8)。肽/mhc分離的效率對(duì)于任何蛋白質(zhì)純化過(guò)程,來(lái)自組織樣本蛋白的分離與相關(guān)蛋白的一定損失相關(guān)聯(lián)。為了確定tumap分離的效率,針對(duì)選定為絕對(duì)定量的所有tumap產(chǎn)生了肽mhc復(fù)合物。為了能夠區(qū)別天然肽mhc復(fù)合物與加樣物,使用了單同位素標(biāo)記版本的tumap,即tumap合成期間引入1個(gè)同位素標(biāo)記的氨基酸。這些復(fù)合物被摻入新制備的組織裂解物中,例如,在tumap分離過(guò)程中最早可能時(shí)間點(diǎn),然后在之后的親和純化中像天然肽mhc復(fù)合物被獲取。因此,測(cè)量單標(biāo)記tumap的恢復(fù)可得到個(gè)體tumap分離效率相關(guān)的結(jié)論。分離效率在被選作絕對(duì)tumap定量的13個(gè)樣本(7個(gè)hla-a*02陽(yáng)性樣本、5個(gè)hla-a*24陽(yáng)性樣本和1個(gè)hla-a*02/a*24雙陽(yáng)性樣本)中進(jìn)行了測(cè)定。8個(gè)a*02陽(yáng)性樣本進(jìn)行了a*02tumap分離效率分析,6個(gè)a*24陽(yáng)性樣本進(jìn)行了a*24tumap分離效率分析(圖9a、b)。結(jié)果表明,在不同組織樣本中,大部分肽的分離效率相當(dāng)。與此相反,個(gè)體肽之間的分離效率不同。這表明,分離效率雖然只在有限數(shù)量的樣本中進(jìn)行測(cè)定,但可外推至任何其他組織制備品中。但是,由于分離效率不能從一種肽外推至其他肽,因此,有必要單獨(dú)分析每個(gè)tumap。在少數(shù)情況下,對(duì)于肽ncapg-001,分離效率不切實(shí)際的高和/或變化強(qiáng)烈(圖9a)。分離效率例如由于定量肽依賴性困難無(wú)法確定(例如,肽ccnb1-002、aspm-001的高lloq水平)或分離效率經(jīng)計(jì)算高于100%的情況下,發(fā)明人假定分離效率為100%。這是一種保守的方法,其中最有可能高估了分離效率,從而最終導(dǎo)致低估了每個(gè)細(xì)胞的肽拷貝量。為了估算tumap分離效率的變化,繪制了來(lái)自6-8個(gè)樣本的個(gè)體tumap分離的變異系數(shù)(cv,%)(圖9c)??傮w來(lái)說(shuō),a*02tumap的平均偏差為24%,a*24tumap為32%。固體、冷凍組織中細(xì)胞計(jì)數(shù)的測(cè)定用于計(jì)算每個(gè)細(xì)胞肽拷貝數(shù)的另一個(gè)關(guān)鍵因素是用于tumap分離組織樣本的總細(xì)胞計(jì)數(shù)的估計(jì)值。發(fā)明人決定使用dna含量分析法,因?yàn)榇朔椒ㄟm用于不同來(lái)源的廣泛樣本,而最重要的是,冷凍樣本(forseyandchaudhuri,2009;alcoseretal.,2011;alcoseretal.,2011;silvaetal.,2013)??紤]腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性,有必要確定來(lái)自代表用于tumap分離的完整組織樣本的組織片段的細(xì)胞計(jì)數(shù)。tumap分離期間制備的組織裂解液進(jìn)行dna分析的合適樣本,因?yàn)樗啾扔诠腆w組織片段更均勻。dna分離后,用基于熒光的測(cè)定法對(duì)總dna濃度進(jìn)行定量(lifetechnologies公司,qubithsdna分析法)并計(jì)算樣本的總dna含量。為了計(jì)算來(lái)自給定dna量的細(xì)胞數(shù),發(fā)明人考慮了兩種不同的方法:首先,細(xì)胞數(shù)可使用人類基因組的理論質(zhì)量(被估計(jì)為每二倍體基因組約6.67pgdna)進(jìn)行計(jì)算(alcoseretal.,2011;konigshoffetal.,2003)。另外,可使用含已知細(xì)胞數(shù)的樣本以采用組織樣本同樣的方法來(lái)繪制dna標(biāo)準(zhǔn)曲線。這種方法已補(bǔ)償了dna分離和定量程序的任何影響,從而提高了我們結(jié)果的準(zhǔn)確性。發(fā)明人繪制了兩個(gè)不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線,一個(gè)來(lái)自七種不同腫瘤細(xì)胞系和另一個(gè)來(lái)自六個(gè)不同健康供體的外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)。為了比較所有三種評(píng)價(jià)方法(理論dna質(zhì)量和兩種不同基于細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)曲線),計(jì)算了幾個(gè)樣本的每1g組織的細(xì)胞數(shù)(圖10a)。與使用pbmc標(biāo)準(zhǔn)相比,使用細(xì)胞系標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)算導(dǎo)致細(xì)胞計(jì)數(shù)大大降低(最大3.6倍的低估)。這是預(yù)期情況,因?yàn)榭紤]到與健康二倍體pbmc相比,腫瘤細(xì)胞系常常非整倍體細(xì)胞比例更高且dna含量較高。在文獻(xiàn)中,不同研究中二倍體胃腫瘤的比例為25-67%(hiyamaetal.,1995;tamuraetal.,1991;wikstenetal.,2008;zhangetal.,2005;sugaietal.,2005)。由于組織樣本的倍性和非整倍體細(xì)胞的分?jǐn)?shù)未知,因此,這兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線可能只對(duì)真實(shí)細(xì)胞計(jì)數(shù)提供估計(jì),但沒(méi)有考慮個(gè)體組織樣本的所有特性。變化的另一個(gè)來(lái)源是組織樣本的未知增殖狀態(tài)或壞死細(xì)胞的存在。特別是,增殖細(xì)胞中dna含量的倍增增加了相對(duì)于細(xì)胞數(shù)的dna量,并因而導(dǎo)致細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算值的偏差。在兩種正常胃組織樣本中,發(fā)明人用三種方法均計(jì)算出每1g組織相較于腫瘤樣本,細(xì)胞數(shù)較低。作為一種保守方法,發(fā)明人決定使用pbmc標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖10b),這可能會(huì)導(dǎo)致過(guò)高估計(jì)超二倍體組織樣本部分中的細(xì)胞計(jì)數(shù),從而低估此類樣本中每個(gè)細(xì)胞的肽拷貝數(shù),但決不應(yīng)過(guò)高估計(jì)任何樣本中每個(gè)細(xì)胞的肽拷貝數(shù)。為了分析選定作為絕對(duì)tumap定量的組織樣本,發(fā)明人從2-3等份組織溶解液中分離出dna,并且采用基于熒光的測(cè)定法以2-3次復(fù)制定量每種dna制備品。使用pbmc標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖11a)根據(jù)dna含量計(jì)算總細(xì)胞數(shù)和每1g組織的細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)。為了獲得細(xì)胞計(jì)數(shù)分析的整體變化的估計(jì)值,首先在每個(gè)樣本的水平或如果可行用生物復(fù)制物(即來(lái)自相同腫瘤不同部分的獨(dú)立組織裂解制備液)測(cè)定變異系數(shù)(%)。該計(jì)算考慮到了組織裂解液的等分試樣之間的變化以及熒光測(cè)定法重復(fù)測(cè)量值之間的變化。這些cv示于圖11b中,總體變化確定為所描繪cv的中位數(shù)。變化可部分地由以下事實(shí)進(jìn)行說(shuō)明:組織裂解物并非完全均質(zhì)化,即含有未解離細(xì)胞的剩余組織顆粒導(dǎo)致個(gè)體分離復(fù)制物細(xì)胞計(jì)數(shù)較高(例如,參見(jiàn)圖11a的gc816t)。每細(xì)胞的肽拷貝數(shù)采用nanolc-ms/ms運(yùn)行中肽定量數(shù)據(jù)(″總肽″),tumap分離效率(″分離效率,%″)以及每個(gè)腫瘤樣本可用的細(xì)胞計(jì)數(shù),能夠根據(jù)以下公式計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的tumap拷貝數(shù):總肽的量根據(jù)2-4個(gè)nanolc-ms/ms實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用圖4至圖7中所示的校準(zhǔn)曲線計(jì)算(″肽/運(yùn)行[fmol]″)。只有使用校準(zhǔn)曲線定義高于lloq的ms測(cè)量值用于絕對(duì)肽拷貝數(shù)的計(jì)算。此lloq是指nanolc-ms/ms實(shí)驗(yàn)中的tumap量(″lloq/運(yùn)行[fmol]″)??闪炕乃须拿總€(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)從每個(gè)細(xì)胞50至30000的拷貝數(shù)(見(jiàn)表3)。表3:hla-a*02和hla-a*24tumap每個(gè)細(xì)胞拷貝數(shù)概覽hla-a*02tumap在8個(gè)樣本中分析,hla-a*24tumap在6個(gè)樣本中分析。nq=因肽數(shù)量低于lloq而沒(méi)有定量為了使″每個(gè)細(xì)胞肽拷貝數(shù)″背景下的lloq可視,使用上面所示的兩個(gè)公式計(jì)算每個(gè)樣本中每個(gè)tumap的″每個(gè)細(xì)胞的lloq″。由于樣本的總細(xì)胞計(jì)數(shù)不同,每個(gè)樣本的每個(gè)細(xì)胞lloq不同(a*02tumap參見(jiàn)圖12和圖13,a*24tumap參見(jiàn)圖14和圖15)。絕對(duì)tumap定量誤差估計(jì)為了估計(jì)絕對(duì)tumap定量的變化,發(fā)明人考慮了以下三個(gè)主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)變化:a)分離tumap的數(shù)量:相對(duì)偏差1.8%(a*02)和2.1%(a*24)b)mhc分離的效率:相對(duì)偏差24%(a*02)和32%(a*24)c)組織樣本的細(xì)胞計(jì)數(shù):相對(duì)偏差27%假定變數(shù)值為正態(tài)分布,“每個(gè)細(xì)胞拷貝數(shù)”的相對(duì)誤差(σ)可計(jì)算為每個(gè)變量的二次相對(duì)誤差總和的平方根:根據(jù)上面給出的值,每個(gè)細(xì)胞絕對(duì)肽拷貝數(shù)的變異系數(shù)hla-a*02肽約為36%,hla-a*24約為42%。為了提供結(jié)果變化的影響,計(jì)算了模型肽和樣本的每個(gè)細(xì)胞肽拷貝數(shù)的絕對(duì)和相對(duì)誤差(表4)。表4:模型肽絕對(duì)tumap定量中絕對(duì)和相對(duì)誤差的示例性計(jì)算該模型計(jì)算表明,對(duì)于絕對(duì)定量復(fù)雜的多步驟分析,結(jié)果的變化仍在可接受的范圍內(nèi)。對(duì)于個(gè)體tumap,相對(duì)誤差可能偏離此處算出的平均誤差。每個(gè)細(xì)胞的tumap拷貝數(shù)可在不同tumap之間進(jìn)行定量比較,從而優(yōu)化tumap以選擇合適的抗體和/或可溶性t細(xì)胞受體靶標(biāo)。tumap定量方法與已發(fā)表方法的比較以前未曾顯示每個(gè)細(xì)胞mhc相關(guān)肽拷貝數(shù)絕對(duì)定量的準(zhǔn)確方法。最重要的是,先前發(fā)表的使用ms分析定量mhc結(jié)合肽的方法沒(méi)有考慮樣本制備過(guò)程中的抗原損失(tanetal.,2011;hoganetal.,2005)。petera.vonvelen小組最近發(fā)表了「mhc結(jié)合肽準(zhǔn)確定量」的一種方法(hassanetal.,2014)。在此技術(shù)說(shuō)明中,一種方法被用來(lái)量化ebv-lcljypp65細(xì)胞上的兩種小組織兼容性抗原——lb-nisch-1a和lb-ssr1-1s。但是,各個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟大不相同,總結(jié)于下表:表5:hassan等人的tumap定量方法與本發(fā)明的比較hassan等人分析的兩種肽拷貝數(shù)在生物復(fù)制物中每個(gè)細(xì)胞為800至5300(相對(duì)偏差74%)和3000至12000(相對(duì)偏差60%)拷貝。這種偏差的原因沒(méi)有明確討論,但可能是由于使用不同的ms儀器所致。總之,本發(fā)明中改良的方法預(yù)期有助于得出更準(zhǔn)確和可靠的結(jié)果。低拷貝數(shù)肽的定量為了顯示本發(fā)明方法的功效,產(chǎn)生了如下表中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)。肽經(jīng)確定只有非常少量的拷貝數(shù)存在,在他們之中有肽pde11-001。由此可以看出,該方法可測(cè)定少至每個(gè)細(xì)胞約10個(gè)拷貝的肽。表6:低拷貝數(shù)肽的定量pc-前列腺癌-序列pde11-001為allesrvnl(序列號(hào)25)pde11-001是一種源自磷酸二酯酶11a(pde11a)的hla-a*02結(jié)合肽,其催化camp和cgmp的水解,從而下調(diào)各信號(hào)通路。pde11a突變與腎上腺皮質(zhì)增生以及家族性睪丸生殖細(xì)胞腫瘤相關(guān)聯(lián)。該肽在前列腺癌樣本上檢測(cè)到,也在肝細(xì)胞癌、胰腺癌和腎細(xì)胞癌中檢測(cè)到,并且不能在任何正常組織中檢測(cè)到。參考文獻(xiàn)alcosersy,kimmeldj,borgelsd,carterjp,doughertykm,hollingsheadmg(2011).real-timepcr-basedassaytoquantifytherelativeamountofhumanandmousetissuepresentintumorxenograffs.bmc.biotechnol.11.124.andersonnl,razavim,pearsontw,kruppag,paaper,suckaud(2012).precisionofheavy-lightpeptideratiosmeasuredbymaldi-tofmassspectrometry.jproteome.res11,1868-1878.forseyrw,chaudhurijb(2009).validityofdnaanalysistodeterminecellnumbersintissueengineeringscaffolds.biotechnol.lett.31,819-823.hassanc,kestermg,oudgenoegg,deruah,janssengm,drijfhoutjw,spaapenrm,jimenezcr,heemskerkmh,falkenburgjh,vanveelenpa(2014).accuratequantitationofmhc-boundpeptidesbyapplicationofisotopicallylabeledpeptidemhccomplexes.jproteomics.hiyamae,yokoyamat,tatsumoton,hiyamak,imamuray,murakamiy,kodamat,piatyszekma,shayjw,matsuuray(1995).telomeraseactivityingastriccancer.cancerres55,3258-3262.hogankt,suttonjn,chuku,busbyja,shabanowitzj,huntdf,slingluffcl,jr.(2005).useofselectedreactionmonitoringmassspectrometryforthedetectionofspecificmhcclassipeptideantigensona3supertypefamilymembers.cancerimmunol.immunother.54,359-371.konigshoffm,wilhelmj,bohlerm,pingouda,hahnm(2003).her-2/neugenecopynumberquantifiedbyreal-timepcr:comparisonofgeneamplification,heterozygosity,andimmunohistochemicalstatusinbreastcancertissue.clinchem.49,219-229.prasadb,unadkatjd(2014).comparisonofheavylabeled(sil)peptideversussilacproteininternalstandardsforlc-ms/msquantificationofhepaticdrugtransporters.int.jproteomics.2014,451510.satoy,miyashitaa,iwatsubot,usuit(2012).simultaneousabsoluteproteinquantificationofcarboxylesterases1and2inhumanlivertissuefractionsusingliquidchromatography-tandemmassspectrometry.drugmetabdispos.40,1389-1396.silvaal,rosaliara,sazaka,carstensmg,ossendorpf,oostendorpj,jiskootw(2013).optimizationofencapsulationofasyntheticlongpeptideinplgananoparticles:low-burstreleaseiscrucialforefficientcd8(+)tcellactivation.eur.jpharm.biopharm.83,338-345.sturmr,sheynkmang,boothc,smithlm,pedersenja,lil(2012).absolutequantificationofprionprotein(90-231)usingstableisotope-labeledchymotrypticpeptidestandardsinalc-mrmaquaworkflow.jam.soc.massspectrom.23,1522-1533.sugait,habanow,jiaoyf,suzukim,takaganea,nakamuras(2005).analysisofgeneticalterationsassociatedwithdnadiploidy,aneuploidyandmultiploidyingastriccancers.oncology68,548-557.tamurag,kihanat,nom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