本申請要求于2014年3月28日提交的美國臨時專利申請序列號61/971,996的優(yōu)先權(quán)，所述申請通過引用結(jié)合到本文中。發(fā)明概述本公開內(nèi)容一般地描述修飾形式的CD16，表達(dá)修飾的CD16的遺傳修飾的細(xì)胞，和涉及遺傳修飾的細(xì)胞的方法。所述修飾形式的CD16可顯示增加的抗腫瘤和/或抗病毒活性，這至少部分上是由于減少的對NK細(xì)胞刺激時金屬蛋白酶介導(dǎo)的脫落的敏感性。因此，在一個方面，本公開內(nèi)容描述經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)具有膜近側(cè)區(qū)和膜近側(cè)區(qū)中的氨基酸修飾的CD16多肽的細(xì)胞。在另一個方面，本公開內(nèi)容描述包含編碼具有膜近側(cè)區(qū)和膜近側(cè)區(qū)中的氨基酸修飾的CD16多肽的多核苷酸的細(xì)胞。在任何一個方面，所述氨基酸藥物（medication）反映與CD16膜近側(cè)區(qū)野生型氨基酸序列相比一個或多個氨基酸的添加、一個或多個氨基酸的缺失，或一個或多個氨基酸的置換。在這些實(shí)施方案的一些中，一個或多個氨基酸的置換包括SEQIDNO:1的197位的絲氨酸殘疾的置換。在任何一個方面，細(xì)胞可為自然殺傷(NK)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞或T細(xì)胞。在任何一個方面，與野生型CD16多肽相比修飾的CD16多肽顯示減小的對ADAM17介導(dǎo)的脫落的敏感性。在任何一個方面，與野生型CD1多肽相比修飾的CD16多肽顯示減小的對NK細(xì)胞刺激時的切割的敏感性。在另一個方面，本公開內(nèi)容描述一般地涉及給予需要這種處理的患者包括以下的治療的方法：(a)給予患者治療性NK效應(yīng)物，和(b)給予患者上文概述的遺傳修飾細(xì)胞的任何實(shí)施方案。在一些實(shí)施方案中，治療性NK效應(yīng)物包括治療劑。在這些實(shí)施方案的一些中，治療劑可包括抗體，或治療性抗體片段。在這些實(shí)施方案的一些中，抗體或抗體片段與病毒抗原特異性結(jié)合。在其它實(shí)施方案中，抗體或抗體片段與腫瘤抗原特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，治療劑可包括雙特異性殺傷銜接體(BiKE)或三特異性殺傷細(xì)胞銜接體(TriKE)。在又一個方面，本公開內(nèi)容描述用于改善對患者的免疫治療的方法，其中所述免疫治療涉及給予患者治療性NK效應(yīng)物。一般地所述方法包括進(jìn)一步給予患者上文概述的遺傳修飾細(xì)胞的任何實(shí)施方案。本發(fā)明的以上概述不意在描述本發(fā)明的每一公開的實(shí)施方案或每一實(shí)現(xiàn)。隨后的說明書更具體地例示說明性的實(shí)施方案。在整個申請的若干位置，指導(dǎo)通過實(shí)施例的列表提供，這些實(shí)施例可以以不同的組合使用。在每種情況下，敘述的列表僅用作代表性群組，并且不應(yīng)解釋為排他的列表。附圖簡述圖1.人CD16中胞外域切割位點(diǎn)的位置。(A)從PMA-活化人NK細(xì)胞或中性粒細(xì)胞的細(xì)胞上清液免疫沉淀的可溶性CD16的胰蛋白酶肽（trypticpeptides）經(jīng)受質(zhì)譜分析。鑒定了四個具有非胰蛋白酶C末端的高置信度肽：1個肽來自NK細(xì)胞釋放的可溶性CD16(肽#1，左上)，3個肽來自中性粒細(xì)胞釋放的可溶性CD16(肽#2，左下；肽#3，右上；和肽#4，右下)。(B)肽#1-4(加下劃線的)以及CD16a(SEQIDNO:1)和CD16b(SEQIDNO:2)中假定切割位點(diǎn)(箭頭)的說明。所鑒定的肽中氨基酸176區(qū)分CD16a(F)與CD16b(V)。氨基酸1-16指示CD16a和CD16b的預(yù)測信號序列。氨基酸210-229指示CD16a的跨膜區(qū)域。氨基酸編號從信號序列中的甲硫氨酸開始。CD16a和CD16b的氨基酸序列分別來自NCBI參考序列NM_000569.6和NM_000570.4。圖2.CD16胞外域脫落、切割區(qū)域和經(jīng)工程改造的絲氨酸-197至脯氨酸突變的示意圖。CD16a和CD16b通過ADAM17在膜近側(cè)區(qū)內(nèi)經(jīng)受胞外域脫落，如所標(biāo)明的。膜近側(cè)區(qū)內(nèi)的CD16切割區(qū)域基于質(zhì)譜分析，其顯示極為貼近的三個不同的切割位點(diǎn)(箭頭)。進(jìn)行定點(diǎn)突變以將CD16(SEQIDNO:1的氨基酸190-202)中的絲氨酸-197置換為脯氨酸(CD16/S197P)。圖3.經(jīng)工程改造的S197P突變對CD16a和CD16b脫落的作用。轉(zhuǎn)染的HEK293(人胚胎腎)細(xì)胞以相似水平分別表達(dá)CD16b和CD16b/S197P(A)或CD16a和CD16a/S197P(B)，如通過流式細(xì)胞術(shù)所測定的(左側(cè)面板)。用或不用PMA處理(15ng/ml在37℃持續(xù)30分鐘)不同轉(zhuǎn)染子并通過ELISA定量培養(yǎng)基上清液中的CD16的可溶性水平(右側(cè)面板)。對于每一實(shí)驗(yàn)，每一處理?xiàng)l件重復(fù)三次，數(shù)據(jù)代表三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。條形圖顯示平均值±SD。統(tǒng)計(jì)顯著性表示為***P<0.001。(C)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞表達(dá)L-選擇素(CD62L)或L-選擇素和CD16b/S197P。轉(zhuǎn)染和模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞上L-選擇素和CD16b/S197P的表面水平使用流式細(xì)胞術(shù)測量(直方圖)。在PMA存在或不存在下37℃孵育表達(dá)L-選擇素或L選擇素和CD16b/S197P的轉(zhuǎn)染子30分鐘，并測定L-選擇素染色的平均熒光強(qiáng)度(MFI)(條形圖)。對于每一實(shí)驗(yàn)，每一處理?xiàng)l件重復(fù)三次，數(shù)據(jù)代表兩個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。條形圖顯示平均值±SD。統(tǒng)計(jì)顯著性表示為*P<0.05。對于所有直方圖，x-軸=Log10熒光，y-軸=細(xì)胞數(shù)目。圖4.經(jīng)工程改造的S197P突變對NK細(xì)胞中CD16a脫落的作用。不用(Unstim.)或用PMA(100ng/ml)37℃處理用空載體(僅載體)、CD16a或CD16a/S197P轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK92細(xì)胞30分鐘(A)，用IL-12和IL-18(分別100ng/ml和400ng/ml)37℃處理24小時(B)，或用Raji細(xì)胞和利妥昔單抗37℃處理60分鐘(C)。CD16a的細(xì)胞表面水平通過流式細(xì)胞術(shù)測定。虛線指示同種型匹配的陰性對照抗體染色。(D)在ADAM17抑制劑BMS566394(5μM)存在或不存在下用Raji細(xì)胞和利妥昔單抗37℃處理親本NK92細(xì)胞和表達(dá)CD16a或CD16a/S197P的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞60分鐘?？扇苄訡D16a水平通過ELISA測定。每一處理?xiàng)l件重復(fù)三次，數(shù)據(jù)代表三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。條形圖顯示平均值±SD。統(tǒng)計(jì)顯著性表示為***P<0.001。(E)表達(dá)CD16a或CD16a/S197P的NK92細(xì)胞用抗-ADAM17mAbsM220、623、633或同種型匹配的陰性對照抗體染色，如所標(biāo)明的。(F)從模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)iPSCs(左側(cè)面板)或表達(dá)重組CD16a或CD16a/S197P的iPSCs(右側(cè)面板)衍生的CD56+CD45+NK細(xì)胞與或不與K562靶細(xì)胞在37℃孵育4小時。對于所有直方圖，x-軸=Log10熒光，y-軸=細(xì)胞數(shù)目，并且數(shù)據(jù)代表至少3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。圖5.經(jīng)工程改造的S197P突變對CD16a功能的作用。(A)以相等水平表達(dá)CD16a或CD16a/S197P的NK92細(xì)胞用單體人IgG(0-20μg/ml)處理(左側(cè)面板)。作為對照，細(xì)胞也用單體人IgA(20μg/ml)處理并用IgG(20μg/ml)處理NK92親本細(xì)胞(條)?？贵w結(jié)合通過流式細(xì)胞術(shù)測定，如材料與方法中所描述的。條形圖顯示至少三個單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。相對于IgG(0μg/ml)、IgA或NK92親本細(xì)胞+IgG，統(tǒng)計(jì)顯著性表示為*P<0.05。(B)在Raji細(xì)胞不存在(Unstim.)或存在下用或不用抗CD20利妥昔單抗37℃孵育模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK92細(xì)胞或表達(dá)CD16a或CD16a/S197P的NK92細(xì)胞達(dá)到指定的時間點(diǎn)。NK92細(xì)胞活化通過流式細(xì)胞術(shù)由CD107a染色的上調(diào)評估。對于直方圖，x-軸=Log10熒光，y-軸=細(xì)胞數(shù)目。數(shù)據(jù)代表至少3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。說明性實(shí)施方案的詳述本公開內(nèi)容一般地描述修飾形式的CD16a，表達(dá)修飾的CD16a的遺傳修飾的細(xì)胞，和涉及遺傳修飾的細(xì)胞的方法。所述修飾形式的CD16a可顯示增加的抗腫瘤和/或抗病毒活性，這至少部分上是由于減少的對NK細(xì)胞刺激時金屬蛋白酶介導(dǎo)的脫落的敏感性。與許多實(shí)體腫瘤類型相比，在過去的30年間具有上皮性卵巢癌的婦女的存活率幾乎未改變。此外，當(dāng)前對復(fù)發(fā)性卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療提供低(<20%)響應(yīng)率。盡管卵巢癌樣品中普遍的HER2過表達(dá)，在晚期卵巢癌患者中用抗-HER2抗體曲妥單抗處理僅提供有限的響應(yīng)。這一對曲妥單抗的抗性可能由功能失調(diào)的NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗體-依賴性細(xì)胞毒性引起。因此，存在對創(chuàng)新治療策略的迫切需求。我們描述了一種用于提供治療處理策略的新途徑。卵巢癌的一個關(guān)注為周圍環(huán)境，其中腫瘤細(xì)胞發(fā)展可為高度促炎的因此很可能促進(jìn)浸潤NK細(xì)胞上CD16a切割從而減少抗體-依賴性細(xì)胞毒性。數(shù)種抗體已經(jīng)作為有效的用于治療人惡性腫瘤的靶向治療而出現(xiàn)。其功效部分上是由于與自然殺傷(NK)細(xì)胞上FcγRIIIa/CD16a的抗體相互作用和通過抗體-依賴性細(xì)胞毒性誘導(dǎo)殺死癌細(xì)胞。人IgGFc受體CD16(FcγRIII)由兩種同種型組成：CD16a(FcγRIIIa)和CD16b(FcγRIIIb)。CD16a由自然殺傷(NK)細(xì)胞表達(dá)，CD16b由中性粒細(xì)胞表達(dá)。NK細(xì)胞活化通過稱為胞外域脫落(涉及金屬蛋白酶ADAM17和發(fā)生在接近質(zhì)膜的單一胞外區(qū)域的蛋白水解事件)的過程導(dǎo)致兩種CD16同種型的表面水平的快速下調(diào)(圖1A)。如上文所指出的，卵巢癌患者可能抵抗NK細(xì)胞介導(dǎo)的免疫治療——即，腫瘤對NK細(xì)胞介導(dǎo)的治療不敏感。例如，卵巢癌細(xì)胞通常表達(dá)表皮生長因子受體HER2，但用治療抗體曲妥單抗靶向其僅提供有限的臨床響應(yīng)。該抗性至少部分上可由胞外域脫落造成——即，細(xì)胞因子對NK細(xì)胞的活化、靶細(xì)胞相互作用和/或腫瘤浸潤可導(dǎo)致CD16切割和損傷抗體-依賴性細(xì)胞毒性。因此，阻斷胞外域脫落過程具有臨床意義。我們已經(jīng)使用質(zhì)譜法測定CD16a和CD16b的切割位點(diǎn)并從人血白細(xì)胞克隆CD16a和CD16b的cDNA。以定向方式突變每一cDNA以誘導(dǎo)單個氨基酸改變。197位的絲氨酸變?yōu)楦彼?圖1B)。該突變阻斷CD16a和CD16b的切割，防止細(xì)胞活化時其下調(diào)。體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞中抗切割CD16a的表達(dá)維持該IgGFc受體的高表面水平，這增強(qiáng)NK細(xì)胞刺激、治療抗體功效和癌細(xì)胞殺傷。ADAM17具有許多細(xì)胞表面底物，但不具有可用于預(yù)測CD16a切割位點(diǎn)的蛋白質(zhì)水解共有序列。因此，我們使用LC-MS-MS測定從活化的人外周血白細(xì)胞釋放的可溶性CD16中的C-端切割位點(diǎn)。我們在CD16的膜近側(cè)區(qū)(CD16a與CD16b之間相同的區(qū)域)觀察到極為接近的三個假定切割位點(diǎn)(圖2，箭頭)。盡管ADAM17蛋白質(zhì)水解不需要共有序列，切割區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)很重要。試圖阻斷CD16a切割，我們用脯氨酸置換絲氨酸-197(CD16a197P)以引入構(gòu)象變化。我們通過從活化NK細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液，并分開地從中性粒細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液免疫沉淀CD16而鑒定CD16切割的位置。用PNGaseF處理免疫沉淀的CD16以移除N-聚糖，胰蛋白酶消化，對所產(chǎn)生的肽進(jìn)行質(zhì)譜分析。鑒定到包含非胰蛋白酶C端的高置信度的四個不同肽譜（peptidepatterns）(圖1A)。對于從活化NK細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液富集的CD16，我們僅觀察到一個肽譜，其對應(yīng)于SEQIDNO:1的氨基酸甘氨酸-174至丙氨酸-195(肽#1,圖1A)。CD16a和CD16b的膜近側(cè)區(qū)，除了殘基176之外，具有相同的氨基酸序列。該位置處苯丙氨酸表示CD16a，其存在于肽#1中(圖1A和B)。該肽在丙氨酸-195/纈氨酸-196處顯示非胰蛋白酶P1/P1’切割位點(diǎn)(圖1B)。對于從活化的中性粒細(xì)胞的培養(yǎng)基上清富集的CD16，我們檢測到具有非胰蛋白酶C端的三個不同肽譜(肽#2-4，圖1A和1B)。肽#2對應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸甘氨酸-174至丙氨酸-195，肽#3對應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸甘氨酸-174至纈氨酸-196，肽#4對應(yīng)于SEQIDNO:2的氨基酸天冬酰胺-180至蘇氨酸-198。肽#2和肽#3在176位包含纈氨酸，表示CD16b，并在丙氨酸-195/纈氨酸-196和纈氨酸-196/絲氨酸-197處顯示P1/P1’位點(diǎn)(圖1B)。肽#4在蘇氨酸-198/異亮氨酸-199處具有P1/P1’位點(diǎn)(圖1B)。盡管該肽從來自富集的中性粒細(xì)胞的可溶性CD16衍生，但其不包含176位的氨基酸來鑒定同種型(圖1B)。無論如何，高置信度肽顯示在CD16中的第三個切割位點(diǎn)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)證明CD16中存在切割區(qū)域而不是單個特異性切割位點(diǎn)。我們通過使用定點(diǎn)突變進(jìn)一步檢查CD16的切割區(qū)域以確定在基于細(xì)胞的測定中是否可破壞CD16a和CD16b切割。ADAM17傾向于優(yōu)選在底物區(qū)域中與其催化位點(diǎn)相互作用的α-螺旋構(gòu)象。此外，ADAM17切割位點(diǎn)特異性的蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示對在P1’、P2’或P3’位置處的脯氨酸殘基非常低的偏好性。因此我們用脯氨酸置換CD16a和CD16b切割區(qū)域中的絲氨酸-197(S197P，如圖2中所標(biāo)明的)。在人腎細(xì)胞系HEK293中分別表達(dá)CD16b和CD16b/S197P，該細(xì)胞系不表達(dá)內(nèi)源性CD16。HEK293轉(zhuǎn)染子在其表面以相似水平表達(dá)CD16b或CD16b/S197P(圖3A)。從轉(zhuǎn)染HEK293釋放高水平的CD16b，當(dāng)用PMA處理它們時所述水平進(jìn)一步增加，如通過ELISA所測定的(圖3A)。然而，未處理或PMA處理的HEK293細(xì)胞所產(chǎn)生的CD16b/S197P的可溶性水平與CD16b相比顯著更低(圖3A)。我們還使用相同方法檢查了S197P突變對CD16a切割的作用。CD16a的表面表達(dá)需要與γ鏈二聚體聯(lián)合。我們因此使用穩(wěn)定表達(dá)人γ鏈的HEK293細(xì)胞。比較表達(dá)相等表面水平CD16a或CD16a/S197P的HEK293轉(zhuǎn)染子(圖3B)，我們測定未處理和PMA處理細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液中每一受體的可溶性水平。再次，當(dāng)與CD16a相比時觀察到顯著更低水平的可溶性CD16a/S197P(圖3B)。為了評估CD16中經(jīng)工程改造的S197P突變是否可破壞ADAM17活性，我們還用L-選擇素，一個白細(xì)胞正常表達(dá)的很好地描述的ADAM17底物，轉(zhuǎn)染表達(dá)或缺乏CD16b/S197P的HEK293細(xì)胞。兩種轉(zhuǎn)染子表達(dá)相等水平的L-選擇素，所述L-選擇素水平在用PMA活化后相似地下調(diào)(圖3C)，證明S197P突變影響CD16脫落但不影響ADAM17活性。為了評估S197P突變對NK細(xì)胞中CD16a脫落的作用，我們使用人NK細(xì)胞系NK92(Gong等人，1994,Leukemia8:652-658)。這些細(xì)胞缺乏內(nèi)源性CD16a的表達(dá)，但可穩(wěn)定表達(dá)重組CD16a。我們轉(zhuǎn)導(dǎo)NK92細(xì)胞以分別表達(dá)CD16a和CD16a/S197P。用PMA活化表達(dá)相等水平這些受體的細(xì)胞并通過流式細(xì)胞術(shù)檢查細(xì)胞表面CD16水平。CD16a，而非CD16a/S197P，經(jīng)歷細(xì)胞表面表達(dá)的顯著下調(diào)(圖4A)。IL-12和IL-18為NK細(xì)胞的生理刺激物，其單獨(dú)或組合可誘導(dǎo)CD16a脫落。用IL-12和IL-18處理的NK92細(xì)胞顯示CD16a而非CD16a/S197P在其細(xì)胞表面表達(dá)中相當(dāng)可觀的下調(diào)(圖4B)。通過CD16a的結(jié)合IgG的細(xì)胞的直接參與（engagement）也可誘導(dǎo)其脫落，此處我們通過在抗-CD20mAb利妥昔單抗存在或不存在下將表達(dá)CD16a或CD16a/S197P的NK92細(xì)胞與CD20陽性Burkitt’s淋巴瘤細(xì)胞系Raji孵育來對其進(jìn)行檢查。用利妥昔單抗處理的Raji細(xì)胞誘導(dǎo)CD16a而非CD16a/S197P的下調(diào)(圖4C)。BMS566394為高選擇性的ADAM17抑制劑，其具有對于ADAM17比對于其它金屬蛋白酶更高的效能數(shù)量級。BMS566394以與S197P突變相似的效率阻斷CD16a脫落，但對活化的表達(dá)CD16a/S197P的NK92細(xì)胞沒有額外的阻斷作用(圖4D)。這些發(fā)現(xiàn)提供ADAM17是在其切割區(qū)域內(nèi)切割CD16a的主要脫落酶的進(jìn)一步證據(jù)。然而，有可能ADAM17表達(dá)水平在表達(dá)CD16a或CD16a/S197P的NK92細(xì)胞中不相等，導(dǎo)致其不同的脫落。我們因此用多種抗-ADAM17mAbs染色表達(dá)CD16a或CD16a/S197P的NK92細(xì)胞并觀察到相同的細(xì)胞表面水平(圖4E)。為了確定S197P突變對原代NK細(xì)胞的CD16a脫落的作用，我們使用人iPSCs產(chǎn)生經(jīng)工程改造的NK細(xì)胞。我們先前已經(jīng)報(bào)道從iPSCs衍生功能NK細(xì)胞及其與外周血NK細(xì)胞的相似性(Knorr等人，2013StemCellsTranslMed.2:274-283;Ni等人，2014,StemCells32:1021-1031)。將CD16a和CD16a/S197PcDNA克隆入SleepingBeauty轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒用于基因插入和在iPSC細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，所述iPSC細(xì)胞隨后分化為成熟NK細(xì)胞。從模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的iPSC細(xì)胞衍生的NK細(xì)胞表達(dá)低水平的內(nèi)源性CD16a，而轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD16a和CD16a/S197P以較高的水平表達(dá)(圖4F)。當(dāng)與K562細(xì)胞相互作用時NK細(xì)胞活化通過多種受體(包括BY55/CD160)發(fā)生，導(dǎo)致ADAM17活化和CD16a脫落。我們用K562細(xì)胞刺激iPSC衍生的NK細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CD16a經(jīng)歷顯著的細(xì)胞表面表達(dá)下調(diào)，而CD16a/S197P的表達(dá)保持穩(wěn)定(圖4F)。內(nèi)源和重組CD16a具有足夠的親和力以結(jié)合單體IgG。為了檢查S197P突變對CD16a功能的作用，我們比較CD16a和CD16a/S197P的IgG結(jié)合能力。以相等水平表達(dá)CD16a或CD16a/S197P的NK92細(xì)胞以相似的劑量依賴方式結(jié)合IgG(圖5A)。對照由結(jié)合到表達(dá)CD16a或CD16a/S197P的NK92細(xì)胞的IgA和結(jié)合到NK92親本細(xì)胞的IgG組成。二者均以基本的背景水平發(fā)生(圖5A)。這些發(fā)現(xiàn)證明通過CD16a和CD16a/S197P的特異和相等的IgG結(jié)合。CD16a是NK細(xì)胞上有效的活化受體，我們檢查了當(dāng)抗體處理的腫瘤細(xì)胞參與時經(jīng)工程改造的S197P突變是否影響CD16a誘導(dǎo)細(xì)胞活化的能力。NK92細(xì)胞活化通過測量CD107a的上調(diào)評估，其在脫粒時非常迅速地發(fā)生并且是NK細(xì)胞活化的靈敏標(biāo)志。與用或不用利妥昔單抗處理的Raji細(xì)胞孵育的模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)NK92細(xì)胞顯示低水平和相似上調(diào)的CD107a(圖5B)。當(dāng)單獨(dú)與Raji細(xì)胞孵育時，以相等水平表達(dá)CD16a或CD16a/S197P的NK92細(xì)胞也少量上調(diào)CD107a，而其與用利妥昔單抗處理的Raji細(xì)胞的孵育導(dǎo)致CD107a的相當(dāng)大上調(diào)(圖5B)?？傊鲜霭l(fā)現(xiàn)表明CD16a中經(jīng)工程改造的S197P突變不損傷其功能。因此，我們證明CD16a和CD16b中經(jīng)工程改造的S197P突變在涉及天然ADAM17的基于細(xì)胞的測定中有效阻斷其脫落。CD16a中的S197P突變還阻斷人NK細(xì)胞系NK92中的受體脫落，但其不損傷受體功能。表達(dá)相等水平CD16a或CD16a/S197P的NK92細(xì)胞在一系列抗體濃度中以相似的效率結(jié)合單體IgG。另外，當(dāng)結(jié)合到Raji細(xì)胞的利妥昔單抗參與時，表達(dá)CD16a或CD16a/S197P的NK92細(xì)胞以可比較的方式上調(diào)活化標(biāo)志CD107a。多能干細(xì)胞允許遺傳操作以產(chǎn)生經(jīng)工程改造的NK細(xì)胞。本公開內(nèi)容描述從表達(dá)野生型CD16a或CD16a/S197P的轉(zhuǎn)導(dǎo)iSPCs產(chǎn)生經(jīng)工程改造的NK細(xì)胞。與NK92細(xì)胞同樣，CD16a在iPSCs衍生的NK細(xì)胞中經(jīng)歷脫落，證明當(dāng)細(xì)胞活化時正常的ADAM17活性，而CD16a/S197P不脫落。CD16a和NK細(xì)胞細(xì)胞毒性功能在癌癥患者中可經(jīng)歷相當(dāng)大的下調(diào)。編碼CD16a/S197P的cDNA可用于產(chǎn)生穩(wěn)定的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iSPCs)和胚胎干細(xì)胞(ESCs)。這些干細(xì)胞可然后分化為表達(dá)CD16a/S197P的原代NK細(xì)胞。表達(dá)抗切割CD16a/S197P(例如，單核細(xì)胞)或CD16b/S197P(例如，中性粒細(xì)胞)的其它細(xì)胞群也可從hESCs/iPSCs衍生。為了產(chǎn)生用在人類患者中對抗不同形式癌癥或感染的NK細(xì)胞免疫治療，CD16a/S197P-表達(dá)NK細(xì)胞可介導(dǎo)增加的抗體-依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)活性或其它CD16a介導(dǎo)的活性(例如，IFNγ和TNFα產(chǎn)生)。例如，CD16a/S197P-表達(dá)NK細(xì)胞可與治療抗體(例如，曲妥單抗或利妥昔單抗)、雙特異性殺傷銜接體(BiKE，例如，CD16×CD33、CD16×CD19或CD16×EP-CAM雙特異性殺傷細(xì)胞銜接體)或三特異性殺傷細(xì)胞銜接體(TriKE)組合。也可產(chǎn)生具有增加的CD16-介導(dǎo)活性的其它治療細(xì)胞群(例如，中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞，等)。CD16a/S197P在人iPSCs或人ESCs中的表達(dá)可產(chǎn)生具有增強(qiáng)的抗瘤病況例如，HER2卵巢癌的ADCC活性的NK細(xì)胞群。在一些情況下，瘤病況可用治療抗體例如，曲妥單抗處理。成熟NK細(xì)胞可從人胚胎干細(xì)胞和iPSCs衍生?？煽寺∫吧虲D16a和/或CD16a/S197P以產(chǎn)生表達(dá)單獨(dú)的CD16a受體的穩(wěn)定iPSC細(xì)胞系或穩(wěn)定ESC細(xì)胞系?？墒褂萌魏魏线m的克隆方法。示例性克隆方法包括，例如，基于病毒的方法、轉(zhuǎn)座子載體(例如，SleepingBeauty)或核轉(zhuǎn)染。在一個實(shí)例中，iPSCs可使用SleepingBeauty轉(zhuǎn)座子載體來修飾。載體可包含選擇系統(tǒng)，例如，GFP/博來霉素（zeocin）抗性融合蛋白，其允許雙選擇系統(tǒng)(博來霉素抗性和流式細(xì)胞術(shù)分選)。iPSCs可分化為成熟NK細(xì)胞，如先前所描述的(Ni等人,2011,J.Virol.85:43–50;Knorr等人,2013,StemCellsTranslMed2:274–283;Woll等人,2009,Blood113:6094–6101)。iPSCs中轉(zhuǎn)基因受體的表達(dá)可導(dǎo)致衍生NK細(xì)胞中高水平表達(dá)。未分化iSPCs中CD16表達(dá)可破壞NK細(xì)胞分化。在這種情況下，CD16表達(dá)可使用，例如，CD56或天然CD16a啟動子推延，以致CD16a表達(dá)更好地與正常NK細(xì)胞分化一致?？杀容^表達(dá)相等水平野生型CD16a與CD16a/S197P的NK細(xì)胞。CD16構(gòu)建體的表達(dá)水平可通過FACS分選基于GFP表達(dá)來匹配，所述GFP表達(dá)以與CD16a構(gòu)建體成比例的方式發(fā)生。匹配的CD16a水平可通過FACS驗(yàn)證。NK細(xì)胞抗HER2-表達(dá)卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性可在治療抗體，例如，曲妥單抗存在或不存在下通過標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測定評估?？稍u估用非鉻標(biāo)記卵巢癌細(xì)胞的抗體-依賴性細(xì)胞毒性。可通過ELISA評估NK細(xì)胞的細(xì)胞因子(例如，IFNγ、TNFα)產(chǎn)生和CD16a的可溶性水平，通過FACS評估CD16a和其它活化標(biāo)志(例如，CD107a、CD62L)的細(xì)胞表面水平。實(shí)施例3中描述的人腫瘤異種移植模型可用于體內(nèi)評估表達(dá)不可切割CD16a的NK細(xì)胞的抗癌活性。與人CD16不同，當(dāng)細(xì)胞刺激時小鼠CD16不經(jīng)歷胞外域脫落，因此確定CD16a脫落對NK細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC的作用不能在正常小鼠中建立模型。表1提供實(shí)驗(yàn)群組和處理的代表性集合。表1.腫瘤異種移植模型群組n處理#15無處理25僅OVCAR3細(xì)胞35OVCAR3+NK細(xì)胞/WT-CD16a45OVCAR3+NK細(xì)胞/WT-CD16a+曲妥單抗55OVCAR3+NK細(xì)胞/CD16a197P65OVCAR3+NK細(xì)胞/CD16a197P+曲妥單抗75OVCAR3+NK細(xì)胞/僅載體85OVCAR3+NK細(xì)胞/載體+曲妥單抗#處理至少進(jìn)行兩次并匯總數(shù)據(jù)。腫瘤生長和/或消退可通過常規(guī)方法每周監(jiān)測，包括，例如，生物發(fā)光成像、超聲、CT、MRI、另一種成像技術(shù)和/或稱重小鼠(Woll等人,2009,Blood113:6094–6101)。也可對小鼠采血(例如，每周)以定量人NK細(xì)胞存活。各種效應(yīng)物功能標(biāo)志(例如，IFNγ、CD16a)的表達(dá)和/或細(xì)胞表面水平可使用常規(guī)技術(shù)例如，通過FACS評估。小鼠可在任何適當(dāng)時期，例如，60天期間隨訪。處死時，可檢查內(nèi)臟(例如，脾、肝、肺、腎和/或卵巢)的轉(zhuǎn)移證據(jù)(例如，通過生物發(fā)光)，如先前所描述的(Woll等人,2009,Blood113:6094–6101)。我們的分析允許定義和比較表達(dá)野生型CD16a與CD16a/S197P的iPSC-衍生NK細(xì)胞的抗體-依賴性細(xì)胞毒性活性和體內(nèi)效能。因此，我們在本文中描述修飾形式的CD16a、表達(dá)修飾的CD16a的遺傳修飾的細(xì)胞(例如，NK細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞等)和涉及遺傳修飾的細(xì)胞的方法。例如，表達(dá)修飾形式的CD16a，CD16a/S197P的NK細(xì)胞顯示增加的抗卵巢癌活性，這至少部分上是由于減少的對NK細(xì)胞刺激時ADAM17-介導(dǎo)的脫落的敏感性。這繼而，在接合（engage）抗體-標(biāo)記的癌細(xì)胞（例如用治療抗體標(biāo)記的癌細(xì)胞）時，增加抗體-依賴性細(xì)胞毒性活性。此外，通過NK細(xì)胞的抗體識別增加與腫瘤細(xì)胞的接觸穩(wěn)定性并通過其它活化受體（例如NKG2D）支持NK細(xì)胞活性。術(shù)語“和/或”意指一個或所有所列元素或兩個或更多個所列元素的組合；術(shù)語“包括”及其變體在說明書和權(quán)利要求中這些術(shù)語出現(xiàn)處不具有限制性含義；除非另外說明，“一個”、“一種”、“所述”和“至少一個”可交換地使用，意指一個或一個以上；通過端點(diǎn)敘述的數(shù)字范圍包括該范圍內(nèi)包含的所有數(shù)字(例如，1-5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5，等)。在前述說明中，為了清楚起見可能分開描述具體的實(shí)施方案。除非另外清楚指明一個具體實(shí)施方案的特征與另一個實(shí)施方案的特征不相容，否則某些實(shí)施方案可包括與一個或多個實(shí)施方案有關(guān)的本文所描述的相容特征的組合。對于本文所公開的包括不連續(xù)步驟的任何方法，所述步驟可以以任何可行次序進(jìn)行。并且，適當(dāng)時，可同時進(jìn)行兩個或更多個步驟的任何組合。本發(fā)明通過下列實(shí)施例說明。應(yīng)理解的是具體的實(shí)施例、材料、量和程序應(yīng)根據(jù)如本文所闡述的本發(fā)明的范圍和精神廣義解讀。實(shí)施例實(shí)施例1質(zhì)譜法從健康個體采集外周血依照尼蘇達(dá)大學(xué)研究審查委員會(UniversityofMinnesotaInstitutionalReviewBoard)批準(zhǔn)的方案根據(jù)方案#9708M00134進(jìn)行。人中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞分離如先前所描述的進(jìn)行(Wang等人,2013,BiochimBiophysActa.1833:680-685;Long等人,2010,JLeukocBiol.87:1097-1101;Long等人,2012,JLeukocBiol.92:667-672)。富集的中性粒細(xì)胞或NK細(xì)胞(在PBS中1×107/ml;Mediatech,Inc.Manassas,VA)用PMA(分別15ng/ml或50ng/ml;Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)在37℃活化30分鐘。過濾細(xì)胞上清液(0.45μm孔徑)并使用mAb3G8(BioLegend,Inc.,SanDiego,CA)和Pierce直接免疫沉淀試劑盒(ThermoFisherScientific,Rockford,IL)按照制造商的說明免疫沉淀CD16。純化的CD16通過靶向幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Remove-iTPNGaseF(NewEnglandBioLabs,Inc.,Ipswich,MA)按照制造商的說明脫糖基化。簡言之，將10-20μg純化的CD16在40mMDTT存在下55℃變性10分鐘，然后用3μlRemove-iTPNGaseF(NewEnglandBioLabs,inc.,Ipswich,MA)在37℃孵育1小時。然后使用幾丁質(zhì)磁珠從反應(yīng)中去除Remove-iTPNGaseF。對CD16進(jìn)行SDS-PAGE并通過氪熒光蛋白染色(ThermoFisherScientific,Rockford,IL)檢測可溶性CD16對應(yīng)的凝膠帶，通過CD16免疫印跡分析同一凝膠中鄰近的泳道而驗(yàn)證，然后將其切下并用胰蛋白酶對其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)凝膠內(nèi)消化。將從凝膠提取的消化的肽干燥并在98:2:0.01的水:乙腈:甲酸中復(fù)溶用于液相色譜-質(zhì)譜法分析，通過質(zhì)譜法(VELOSOPBITRAP,ThermoFisherScientific,Rockford,IL)以數(shù)據(jù)依賴掃描模式分析≤1μg的等分試樣，如先前所描述的(Lin-Moshier等人,2013,JBiolChem.288:355-367)。數(shù)據(jù)庫檢索用ProteinPilot4.5(ABSciex,Framingham,MA)針對附加污染物數(shù)據(jù)庫(thegpm.org/cRAP/index,109蛋白質(zhì))的NCBI參考序列人蛋白質(zhì)FASTA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行，所述ProteinPilot4.5使用Paragon評分算法(Shilov等人,2007,MolCellProteomics6:1638-1655)。檢索參數(shù)為：半胱氨酸碘乙酰胺；胰蛋白酶；儀器OrbiMS(1-3ppm)OrbiMS/MS；生物修飾ID焦點(diǎn)，其包括天冬酰胺脫酰胺；徹底的檢索努力；和假發(fā)現(xiàn)率分析(用相反的數(shù)據(jù)庫)。cDNA表達(dá)構(gòu)建體的產(chǎn)生CD16b作為命名為NA1和NA2的兩個等位基因變體存在，其差異為在其胞外區(qū)域的N端部分的四個氨基酸。ADAM17以相似的效率切割兩個CD16b等位基因變體。對于本研究，我們僅檢查NA1變體。CD16a也存在兩個等位基因變體，它們在176位具有纈氨酸或苯丙氨酸殘基。ADAM17以相似的效率切割CD16a的這兩個等位基因變體。對于本研究，我們僅檢查纈氨酸等位基因變體CD16a。CD16a和CD16b從人白細(xì)胞cDNA擴(kuò)增，如先前所描述的(Wang等人,2013,BiochimBiophysActa.1833:680-685;Dong等人,2014,ArthritisRheumatol.66:1291-1299)在BamHI和EcoRI限制酶位點(diǎn)單獨(dú)克隆入pcDNA3.1質(zhì)粒(Invitrogen,Carlsbad,CA)。構(gòu)建體然后按照制造商的說明進(jìn)行Quik-ChangeSite-directedMutagenesis(快速改變定點(diǎn)誘變)(AgilentTechnologies,SantaClara,CA)以將CD16a和CD16b中197位的絲氨酸轉(zhuǎn)換為脯氨酸。所有構(gòu)建體經(jīng)測序證實(shí)存在預(yù)期突變并且不存在任何自發(fā)突變。隨后將CD16acDNA在BamHI和EcoRI限制酶位點(diǎn)處克隆入Dr.G.Nolan(StanfordUniversity,Stanford,CA)提供的雙順反子逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pBMN-IRES-EGFP。CD16a構(gòu)建體還如先前所述(Wilber等人,2007,StemCells25:2919-2927;Tian等人,2009,StemCells27:2675-2685)克隆入雙順反子SleepingBeauty轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒(pKT2-IRES-GFP:zeo)中。簡言之，使用引物：5'-CCGGAATTCCAGTGTGGCATCATGTGGCAGCTGCTC-3'(正向,SEQIDNO:XX)和5'-CCGGAATTCTCATTTGTCTTGAGGGTCCTTTCT-3'(反向,SEQIDNO:YY)PCR擴(kuò)增野生型CD16a和CD16a/S197P。有下劃線的是EcoRI位點(diǎn)。將EcoRI-消化的CD16a和CD16a/S197PPCR片段單獨(dú)克隆入pKT2-IRES-GFP:zeo中。正確的CD16a定向和序列通過PCR和測序分析確認(rèn)。我們先前已經(jīng)克隆了全長人L選擇素(CD62L)cDNA(Feehan等人,1996,JBiolChem.271:7019-7024;Matala等人,2001,JImmunol.167:1617-1623)，將所述全長人L選擇素(CD62L)cDNA在限制酶位點(diǎn)XbaI處轉(zhuǎn)移至pcDNA3.1載體中。如先前所述(Dong等人,2014,ArthritisRheumatol.66:1291-1299)克隆全長人FcRγcDNA，并修改為使用pcDNA3.1載體。表達(dá)重組L-選擇素、CD16a和CD16b的細(xì)胞系的產(chǎn)生HEK293細(xì)胞(人胚胎腎細(xì)胞系)和NK92細(xì)胞(人NK細(xì)胞系)(ATCC,Manassas,VA)按照貯藏所的說明培養(yǎng)。HEK293細(xì)胞使用Lipofectamine2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)按照制造商的說明用含有或不含CD16b、CD16b/S197P和/或L-選擇素的pcDNA3.1瞬時轉(zhuǎn)染。穩(wěn)定表達(dá)人FcRγ的HEK293細(xì)胞通過同一方法用含有或不含CD16a或CD16a/S197P的pcDNA3.1瞬時轉(zhuǎn)染。NK92細(xì)胞通過先前所描述的逆轉(zhuǎn)錄病毒產(chǎn)生和感染程序(Matala等人,2001,JImmunol.167:1617-1623;Walcheck等人,2003,JLeukocBiol.74:389-394;Wang等人,2009,JImmunol.182:2449-2457)用含有或不含CD16a或CD16a/S197P的pBMN-IRES-EGFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)。構(gòu)建體表達(dá)通過EGFP熒光和CD16染色評估，如通過流式細(xì)胞術(shù)所測定的。人iPSCs(UCBiPS7,衍生自臍帶血CD34細(xì)胞)培養(yǎng)（maintained）在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上(Knorr等人,2013,StemCellsTranslMed.2:274-283;Ni等人,2014,StemCells32:1021-1031)。CD16a或CD16a/S197P的穩(wěn)定表達(dá)如先前所述使用SleepingBeauty轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)來進(jìn)行(Wilber等人,2007,StemCells25:2919-2927;Tian等人,2009,StemCells27:2675-2685)。簡言之，用pKT2-IRES-GFP:zeo與在核轉(zhuǎn)染儀(nucleofector)溶液V中的轉(zhuǎn)座酶DNA的組合(LonzaInc.,Gaithersburg,MD)使用程序設(shè)置B16核轉(zhuǎn)染（nucleofect）iPSCs。核轉(zhuǎn)染的細(xì)胞立即懸浮在包含博來霉素(50μg/ml)的iPSC生長培養(yǎng)基中并接種到小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上。從CD16a-hESC和CD16a-iPSC細(xì)胞衍生NK細(xì)胞hESCs和iPSCs的造血分化如先前所述(Ng等人,2005,Blood106:1601–1603;Ng等人,2008,NatProtoc3:768–776;LeGarff-Tavernier等人,2010,AgingCell9:527–535)進(jìn)行。簡言之，在含有干細(xì)胞因子(SCF,40ng/ml)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF,20ng/ml)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4,20ng/ml)的BPEL培養(yǎng)基中在96孔圓底板的每孔中接種3000個單細(xì)胞。BPEL培養(yǎng)基包含Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium(IMDM,86ml,Invitrogen,ThermoFisherScientific,Inc.,Waltham.MA)、含GlutmaxI的F12營養(yǎng)混合液(NutrientMixture)(86mL,Invitrogen,ThermoFisherScientific,Inc.,Waltham.MA)、10%去離子牛血清白蛋白(BSA,5ml,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、5%聚乙烯醇(10ml,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、亞麻酸(20μl1gm/ml溶液，Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、亞油酸(20μl1gm/ml溶液,Sigma)、Synthecol500x溶液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、a-monothioglyceral(3.9μl/100ml,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)、無蛋白雜交瘤混合物II(Invitrogen,ThermoFisherScientific,Inc.,Waltham.MA)、抗壞血酸(5mg/ml,Sigma)、GlutamaxI(Invitrogen,ThermoFisherScientific,Inc.,Waltham.MA)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒100x溶液(Invitrogen,ThermoFisherScientific,Inc.,Waltham.MA)、青霉素/鏈霉素(Invitrogen,ThermoFisherScientific,Inc.,Waltham.MA)。在造血分化的第11天，將旋轉(zhuǎn)擬胚體（spinembryoidbodies）直接轉(zhuǎn)移至具有或不具EL08-1D2間質(zhì)細(xì)胞的24孔板的提供有細(xì)胞因子的NK培養(yǎng)基中(LeGarff-Tavernier等人,2010,AgingCell9:527–535)。培養(yǎng)4-5周后，用APC-、PE-、FITC-和PerCP-cy5.5-偶聯(lián)的IgG或抗人血液表面抗原的特異性抗體：CD45-PE、CD56-APC、CD56-PE、CD16-PerCP-cy5.5、NKG2D-PE、NKp44-PE、NKp46-PE、CD158b-FITC、CD158e1/2-FITC(BDPharmingen,SanJose,CA)、CD158a/h-PE和CD158i-PE(BeckmanCoulter,Inc.,Pasadena,CA)染色單細(xì)胞懸液?？贵w染色通過流式細(xì)胞術(shù)評估。細(xì)胞刺激分別用15ng/ml和100ng/mlPMA在37℃活化RPMI1640培養(yǎng)基(Mediatech,Inc.,Manassas,VA)中的HEK293和NK92細(xì)胞30分鐘。NK92細(xì)胞用IL-12(PeproTechInc,RockyHill,NJ)和IL-18(R&DSystems,Inc.,Minneapolis,MN)分別以100ng/ml和400ng/ml活化達(dá)到標(biāo)明的時間點(diǎn)。通過CD16a的NK92細(xì)胞活化通過與用抗-CD20mAb利妥昔單抗(1μg/ml)(Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,CA)處理的CD20-陽性Burkitt’s淋巴瘤細(xì)胞系Raji(ATCC，按照貯藏所的說明生長)(1:1比率)孵育而介導(dǎo)，如先前所描述的(Romee等人,2013,Blood121:3599-3608)。通過洗滌Raji細(xì)胞去除過量的利妥昔單抗。在一些實(shí)驗(yàn)中，NK92細(xì)胞用選擇性ADAM17抑制劑BMS566394(5μM)(Bristol-MyersSquibbCompany,Princeton,NJ)預(yù)孵育30分鐘。從iPSCs衍生的NK細(xì)胞用人紅白血病細(xì)胞系K562(ATCC，按照貯藏所的說明生長)刺激，如先前所描述的(Romee等人,2013,Blood121:3599-3608)。簡言之，與K562靶細(xì)胞(2:1比例)在37℃孵育iPSC-衍生的NK細(xì)胞4小時。抗體結(jié)合測定細(xì)胞與單體人IgG和IgA(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的結(jié)合如先前所述(Dong等人,2014,ArthritisRheumatol.66:1291-1299)實(shí)施，并進(jìn)行了一些修改。PBS中5×106/ml的NK92親本細(xì)胞或表達(dá)CD16a或CD16a/S197P的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞在4℃用IgG或IgA以標(biāo)明的濃度一式三份孵育1小時。充分洗滌細(xì)胞并用APC-綴合的驢抗人Fc(重鏈和輕鏈)抗體(JacksonImmunoresearch,WestGrove,PA)按照制造商的說明進(jìn)行孵育。洗滌細(xì)胞，然后立即通過流式細(xì)胞術(shù)分析。流式細(xì)胞術(shù)和ELISA對于細(xì)胞染色，阻斷非特異性抗體結(jié)合位點(diǎn)，細(xì)胞用標(biāo)明的抗體染色并通過流式細(xì)胞術(shù)檢查，如先前所描述的(Wang等人,2013,BiochimBiophysActa.1833:680-685;Romee等人,2013,Blood121:3599-3608)。流式細(xì)胞術(shù)分析在FACSCanto和LSRII儀器(BDBiosciences,SanJose,CA)上進(jìn)行。人CD16通過mAbs3G8(BioLegend,Inc.,SanDiego,CA)和DJ130c(SantaCruzBiotech,SantaCruz,CA)檢測。CD107a通過mAbH4A3(Biolegend,Inc.,SanDiego,CA)檢測。ADAM17通過mAbsM220(Doedens等人,2000,JBiolChem.275:14598-14607)、111633和111623(R&DSystems,Inc.,Minneapolis,MN)檢測。人L-選擇素通過mAbLAM1-116(AncellCorp.,Stillwater,MN)檢測。同種型匹配的陰性對照mAbs用于評估非特異性染色水平。CD16ELISA通過定制的流式微球測定（cytometricbeadassay）進(jìn)行，如先前所描述的(Wang等人,2013,BiochimBiophysActa.1833:680-685)。統(tǒng)計(jì)分析統(tǒng)計(jì)分析使用Prism軟件(GraphPad,SanDiego,CA)適當(dāng)時使用ANOVA和學(xué)生t檢驗(yàn)進(jìn)行。認(rèn)為P值<0.05是顯著的。實(shí)施例2表達(dá)相等水平WTCD16a和CD16a197P(CD16a/S197P)的NK細(xì)胞的比較CD16構(gòu)建體的表達(dá)水平通過FACS分選基于GFP表達(dá)匹配(如上述對于NK92細(xì)胞進(jìn)行的，圖2)，所述GFP表達(dá)以與CD16構(gòu)建體成比例的方式發(fā)生。對于所有測定匹配的CD16a水平通過FACS驗(yàn)證。作為對照，評估用空SleepingBeauty轉(zhuǎn)座子載體修飾的iPSC-衍生NK細(xì)胞(僅表達(dá)GFP)。iPSC-衍生的NK細(xì)胞表達(dá)低水平的內(nèi)源性CD16a(數(shù)據(jù)未示出)。NK細(xì)胞對HER2-表達(dá)卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性在曲妥單抗的存在或不存在下通過標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測定評估。也進(jìn)行了用非鉻標(biāo)記卵巢癌細(xì)胞的抗體-依賴性細(xì)胞毒性。NK細(xì)胞的細(xì)胞因子(例如，IFNγ、TNFα)產(chǎn)生和CD16a的可溶性水平通過ELISA評估。CD16a和其它活化標(biāo)志(例如，CD107a、CD62L)的細(xì)胞表面水平通過FACS評估。實(shí)施例3人腫瘤異種移植模型，其用于檢驗(yàn)表達(dá)CD16a197P(CD16a/S197P)的iPSC-衍生NK細(xì)胞在曲妥單抗存在下是否具有增加的體內(nèi)抗卵巢癌活性。使用NOD/SCID/γc-/-(NSG)小鼠和經(jīng)穩(wěn)定工程改造而表達(dá)用于生物發(fā)光成像的螢火蟲熒光素酶的人卵巢癌細(xì)胞系的異種移植模型(Geller等人,2013,Cytotherapy15:1297–1306)用于檢驗(yàn)腹膜內(nèi)(ip)遞送NK細(xì)胞的抗卵巢癌細(xì)胞活性。過表達(dá)HER2的OVCAR3卵巢癌細(xì)胞系用作體內(nèi)靶(Hellstrom等人,2001,CancerRes61:2420–2423)。亞致死照射的(225cGY)NSG雌性小鼠腹膜內(nèi)注射表達(dá)熒光素酶用于生物發(fā)光成像而產(chǎn)生的OVCAR3(2×105細(xì)胞)以定量腫瘤生長或消退(Geller等人,2013,Cytotherapy15:1297–1306)。在小鼠得到單次腹膜內(nèi)注射20×106NK細(xì)胞前，讓腫瘤生長7天。然后每隔一天給予小鼠IL-2(5μg/小鼠)，持續(xù)4周，如先前所描述的(Woll等人,2009,Blood113:6094–6101)，以促進(jìn)NK細(xì)胞的體內(nèi)存活。曲妥單抗以50μg的劑量腹膜內(nèi)給予，每周一次，持續(xù)4周(所述劑量為先前在該模型中使用的劑量)(Warburton等人,2004,Clinicalcancerresearch10:2512–2524)。比較表達(dá)相等水平WTCD16或CD16a197P(CDa6a/S197P)的iPSC-衍生NK細(xì)胞的體內(nèi)效能。對照包括僅表達(dá)GFP(僅載體)的iPSC-衍生NK細(xì)胞，和僅接受卵巢癌細(xì)胞的小鼠同齡組。所有小鼠得到相同的IL-2處理。腫瘤生長/消退每周通過生物發(fā)光成像和稱重小鼠監(jiān)測，如先前所描述的(Woll等人,2009,Blood113:6094–6101)。每周還對小鼠采血以定量人NK細(xì)胞存活。各種效應(yīng)物功能標(biāo)志(例如，IFNγ、CD16a)的表達(dá)/細(xì)胞表面水平通過FACS評估。對小鼠隨訪達(dá)~60天。處死時，通過生物發(fā)光檢查內(nèi)臟(例如，脾、肝、肺、腎和/或卵巢)的轉(zhuǎn)移證據(jù)，如先前所描述的(Woll等人,2009,Blood113:6094–6101)。示例性實(shí)施方案實(shí)施方案1.一種經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)包含膜近側(cè)區(qū)和膜近側(cè)區(qū)中的氨基酸修飾的CD16多肽的細(xì)胞。實(shí)施方案2.一種細(xì)胞，包含：編碼包含膜近側(cè)區(qū)和膜近側(cè)區(qū)中的氨基酸修飾的CD16多肽的多核苷酸。實(shí)施方案3.實(shí)施方案1或?qū)嵤┓桨?的細(xì)胞，其中所述氨基酸藥物（medication）反映與CD16膜近側(cè)區(qū)野生型氨基酸序列相比一個或多個氨基酸的添加、一個或多個氨基酸的缺失，或一個或多個氨基酸的置換。實(shí)施方案4.實(shí)施方案3的細(xì)胞，其中一個或多個氨基酸的置換包括SEQIDNO:1的197位的絲氨酸殘基的置換。實(shí)施方案5.任何前述實(shí)施方案的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為自然殺傷(NK)細(xì)胞。實(shí)施方案6.任何前述實(shí)施方案的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為中性粒細(xì)胞。實(shí)施方案7.任何前述實(shí)施方案的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為單核細(xì)胞。實(shí)施方案8.任何前述實(shí)施方案的細(xì)胞，其中與野生型CD16多肽相比所述修飾的CD16多肽顯示減小的對ADAM17介導(dǎo)的脫落的敏感性。實(shí)施方案9.任何前述實(shí)施方案的細(xì)胞，其中與野生型CD16多肽相比所述修飾的CD16多肽顯示減小的對NK細(xì)胞刺激時的切割的敏感性。實(shí)施方案10.一種方法，其包括給予需要這種處理的患者包括以下的治療：給予患者治療性NK效應(yīng)物，和給予患者權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的細(xì)胞。實(shí)施方案11.實(shí)施方案10的方法，其中所述治療性NK效應(yīng)物包括治療劑。實(shí)施方案12.實(shí)施方案11的方法，其中所述治療劑特異性識別腫瘤抗原。實(shí)施方案13.實(shí)施方案12的方法，其中所述治療劑包括特異性識別腫瘤抗原的抗體或抗體片段。實(shí)施方案14.實(shí)施方案13的方法，其中所述腫瘤抗原包括HER2。實(shí)施方案15.實(shí)施方案13或?qū)嵤┓桨?4的方法，其中所述抗體包括曲妥單抗或利妥昔單抗。實(shí)施方案16.實(shí)施方案10的方法，其中所述治療性NK效應(yīng)物包括雙特異性殺傷銜接體(BiKE)。實(shí)施方案17.實(shí)施方案16的方法，其中所述BiKE包括CD16×CD33BiKE、CD16×CD19BiKE或CD16×EP-CAMBiKE。實(shí)施方案18.實(shí)施方案10的方法，其中所述治療性NK效應(yīng)物包括三特異性殺傷細(xì)胞銜接體(TriKE)。實(shí)施方案19.實(shí)施方案11或16-18中任一項(xiàng)的方法，其中所述治療劑特異性識別病毒靶。實(shí)施方案20.用于改善對患者的治療的方法，所述治療包括給予患者治療性NK效應(yīng)物，所述方法包括：給予患者權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的細(xì)胞。本文所引用的所有專利、專利申請和出版的完整公開內(nèi)容以及電子可得的材料(包括，例如，核苷酸序列提交（例如GenBank和RefSeq中的）以及氨基酸序列提交（例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的）和來信GenBank和RefSeq中注釋的編碼區(qū)域的翻譯)通過引用以其整體結(jié)合。如果本申請的公開內(nèi)容與本文通過引用結(jié)合的任何文獻(xiàn)的公開內(nèi)容之間存在任何不一致，應(yīng)以本申請的公開內(nèi)容為準(zhǔn)。前面的詳述和實(shí)施例僅為了清楚理解給出。不應(yīng)從其理解不必要的限制。本發(fā)明不限于所顯示和描述的確切細(xì)節(jié)，因?yàn)閷Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的變更將包含在通過權(quán)利要求書界定的本發(fā)明內(nèi)。除非另外說明，說明書和權(quán)利要求書中使用的表述組分的量、分子量等的所有數(shù)字在所有情況下應(yīng)理解為被術(shù)語“約”修飾。相應(yīng)地，除非另外指示相反，說明書和權(quán)利要求書中列出的數(shù)字參數(shù)為近似值，其可根據(jù)欲通過本發(fā)明獲得的期需性質(zhì)而改變。至少，并且不試圖將等同物的教義限制在權(quán)利要求書的范圍中，每一數(shù)字參數(shù)應(yīng)至少根據(jù)所報(bào)道的有效數(shù)字的數(shù)并通過應(yīng)用普通舍入技術(shù)來解釋。盡管闡述本發(fā)明的廣泛范圍的數(shù)字范圍和參數(shù)為近似值，但具體實(shí)施例中列出的數(shù)值仍盡可能準(zhǔn)確地報(bào)告。然而，所有數(shù)值固有地包含由其各自的檢驗(yàn)測量結(jié)果中存在的標(biāo)準(zhǔn)偏差所必然得出的范圍。所有的標(biāo)題均為了方便讀者并且不應(yīng)用于限制標(biāo)題之后的正文的含義，除非如此說明。當(dāng)前第1頁1 2 3