發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明尤其涉及用于治療黑素瘤的治療劑,在罹患黑素瘤的受試者中診斷轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加的方法,治療這樣的受試者的方法,診斷試驗(yàn)和試劑盒。更特別地,在某些實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及通過(guò)在得自受試者的組織樣本中測(cè)定ambra-1和兜甲蛋白的表達(dá),鑒定罹患黑素瘤的受試者是否具有增加的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。發(fā)明背景黑素瘤僅占所有皮膚癌的2.3%,但它是最威脅生命的形式,造成超過(guò)75%的皮膚癌死亡。由于全世界的發(fā)病率上升,皮膚黑素瘤目前已是一個(gè)主要的公共健康問(wèn)題,僅在英國(guó)每年有超過(guò)2000個(gè)體的生命要求索賠。增加的速率高于任何其它癌癥,并且已經(jīng)把它比作一種流行病。一些增加可能是由于監(jiān)視和早期檢測(cè)的改進(jìn)以及診斷標(biāo)準(zhǔn)的修改,然而,認(rèn)為相當(dāng)比例的增加是真實(shí)的。增加與陽(yáng)光暴露上升和/或使用人工日光浴增加有關(guān)。歐洲人年齡-標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率在過(guò)去30年對(duì)于女性增加4-倍和對(duì)于男性增加7-倍。黑素瘤現(xiàn)在是英國(guó)第五位最常見的癌癥,占全部新癌癥病例的4%。死亡率也增加,但死亡率不成比例地少于發(fā)病率,以致死亡與患者病例的比例在過(guò)去50年中穩(wěn)步下降。即使如此,全世界黑素瘤每年總共有幾乎50,000人死亡。影響預(yù)后的因素包括腫瘤的厚度(毫米)(布雷斯洛深度(breslow'sdepth)),與皮膚結(jié)構(gòu)相關(guān)的深度(克拉克水平(clarklevel)),黑素瘤的類型,轉(zhuǎn)移的存在和潰爛的存在。與非-潰爛的腫瘤比較,在診斷時(shí)顯示表皮潰爛的原發(fā)性黑素瘤預(yù)示增加的轉(zhuǎn)移率和較差的后果。然而,潰爛的基礎(chǔ)生物學(xué)仍然是神秘的。早期(ajcc1a或1b期)黑素瘤的治療涉及圍繞黑素瘤的組織的去除,稱為寬泛的局部切除。這通常接著是患者1-5年期內(nèi)疾病復(fù)發(fā)的定期檢查。療法,例如化學(xué)療法,不給予早期黑素瘤患者。對(duì)于患有較厚腫瘤的患者(ajcc2a、2b或2c期),寬泛的局部切除可能緊隨一個(gè)前哨淋巴結(jié)活檢,以確定疾病是否已經(jīng)擴(kuò)散到淋巴結(jié)。如果已經(jīng)擴(kuò)散,則淋巴結(jié)切除可執(zhí)行。幫助防止黑素瘤返回或蔓延的手術(shù)后的治療被稱為輔助療法。輔助療法可以是化學(xué)療法或生物學(xué)療法(如干擾素治療)。然而,輔助療法一般僅提供給患有2期黑素瘤的患者作為臨床試驗(yàn)的一部分?;瘜W(xué)療法、放射療法和/或生物學(xué)療法可被用來(lái)在已切除2期腫瘤的患者中治療復(fù)發(fā)中的黑素瘤,以幫助進(jìn)一步控制局限于淋巴結(jié)(3期)的患病患者的轉(zhuǎn)移進(jìn)展,或縮小晚期轉(zhuǎn)移疾病患者(ajcc4期)的黑素瘤以減輕癥狀。仍有改進(jìn)罹患黑素瘤患者的治療和降低進(jìn)展至轉(zhuǎn)移的可能性的需求。本發(fā)明的一些實(shí)施方案的目的是至少部分地減輕一些現(xiàn)有技術(shù)中確定的問(wèn)題。本發(fā)明的某些實(shí)施方案的概述依據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面,提供一種用于治療受試者的黑素瘤的治療劑,其中所述受試者已被鑒定為具有在得自受試者的組織樣本中ambra-1和兜甲蛋白的表達(dá)降低或喪失。ambra-1(beclin-1調(diào)節(jié)的自噬蛋白1中的活化分子)是含有wd40的蛋白。研究已涉及在自噬控制中的ambra-1,其中ambra-1被認(rèn)為作為蛋白-蛋白相互作用平臺(tái)發(fā)揮功能。ambra-1在自噬過(guò)程中的主要作用被認(rèn)為是作為beclin-1/vps34復(fù)合物的成員,其在自噬的成核階段期間參與富含pi3k的膜的形成。研究已提出ambra-1也直接作為自噬活性的上游調(diào)節(jié)劑起作用。ambra-1的氨基酸序列在附圖中示出。ambra-1已另外地顯示在細(xì)胞分化中發(fā)揮作用。在小鼠模型中ambra-1的功能失活導(dǎo)致具有嚴(yán)重的神經(jīng)管缺陷的子宮內(nèi)致死性,伴有自噬損傷和不平衡的細(xì)胞增殖。相反,ambra-1的過(guò)度表達(dá)已顯示降低神經(jīng)組織中的細(xì)胞增殖率,因此支持其作為表皮增殖的關(guān)鍵參與者的作用。兜甲蛋白是富含甘氨酸-絲氨酸-半胱氨酸的蛋白,其在人類中由lor基因編碼。lor基因是稱為表皮分化復(fù)合物的染色體1上的基因簇的部分。這些基因參與外層皮膚(表皮),特別是其堅(jiān)韌的外表面(角質(zhì)層)的形成和維持。角質(zhì)層,其在稱為角質(zhì)化的過(guò)程中形成,提供身體及其環(huán)境之間的一個(gè)堅(jiān)固的屏障。角質(zhì)層的每個(gè)細(xì)胞,稱為角質(zhì)細(xì)胞,被稱為角質(zhì)化包膜(ce)的蛋白質(zhì)外殼圍繞。兜甲蛋白是角質(zhì)化包膜的主要蛋白質(zhì)。兜甲蛋白和包膜的其它成分之間的連接將角質(zhì)細(xì)胞保持在一起并幫助賦予角質(zhì)層其強(qiáng)度。兜甲蛋白的氨基酸序列在附圖中示出。依據(jù)本發(fā)明的第二方面,提供一種用于治療受試者的黑素瘤的治療劑,其中所述受試者已被鑒定為具有增加的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn),其中風(fēng)險(xiǎn)增加的鑒定通過(guò)以下來(lái)確定:(i)測(cè)定ambra-1和兜甲蛋白在得自受試者的組織樣本中的表達(dá),其中組織樣本包含覆蓋原發(fā)性黑素瘤的組織;和(ii)比較在(i)中獲得的表達(dá)與參考組織或由此獲得的水平;其中與參考組織或水平比較,ambra-1和兜甲蛋白在組織樣本中的表達(dá)降低,或ambra-1和兜甲蛋白在組織樣本中的表達(dá)喪失,表示受試者的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加。應(yīng)該意識(shí)到,在一些實(shí)施方案中,可能不需要ambra-1和兜甲蛋白在組織樣本中的表達(dá)與參考的比較,例如其中表達(dá)的喪失被確定時(shí)。因此,在某些實(shí)施方案中,ambra-1和兜甲蛋白的表達(dá)的降低或喪失是明顯的,沒有必要將表達(dá)與參考組織比較。依據(jù)本發(fā)明的第三方面,提供一種用來(lái)在罹患黑素瘤和已被鑒定為正處于進(jìn)展至轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)增加的受試者中預(yù)防或減少進(jìn)展至轉(zhuǎn)移的可能性的治療劑,其中所述鑒定包括確定受試者具有ambra-1和兜甲蛋白在受試者的覆蓋原發(fā)性黑素瘤的角化細(xì)胞中的表達(dá)降低或喪失。依據(jù)本發(fā)明的第四方面,提供一種測(cè)定患有黑素瘤的受試者是否具有增加的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的體外方法,該方法包括:(i)測(cè)定ambra-1和兜甲蛋白在得自受試者的組織樣本中的表達(dá),其中組織樣本包括覆蓋原發(fā)性黑素瘤的組織;和(ii)比較在(i)中獲得的表達(dá)與參考組織或由此獲得的水平,其中與參考組織或水平比較,ambra-1和兜甲蛋白在組織樣本中的表達(dá)降低或ambra-1和兜甲蛋白在組織樣本中的表達(dá)喪失,表示轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加。依據(jù)本發(fā)明的第五方面,提供一種確定用于罹患黑素瘤的受試者的治療方案的方法,該方法包括:a)從受試者獲得組織樣本,其中組織樣本包含覆蓋原發(fā)性黑素瘤的組織;b)測(cè)定ambra-1和兜甲蛋白在組織樣本中的表達(dá);c)比較在(b)中獲得的表達(dá)與參考組織或由此獲得的水平,和d)(i)如果ambra-1和兜甲蛋白的表達(dá)是正常的或增加,則遵循正常認(rèn)可的護(hù)理途徑,或(ii)如果ambra-1和兜甲蛋白的表達(dá)降低或喪失,則用系統(tǒng)性抗-癌治療方案治療受試者。依據(jù)本發(fā)明的第六方面,提供一種治療罹患黑素瘤的受試者的方法,該方法包括給予受試者治療劑,其中受試者已被鑒定為具有在得自受試者的組織樣本中ambra-1和兜甲蛋白的表達(dá)降低或喪失。依據(jù)本發(fā)明的第七方面,提供一種治療罹患黑素瘤的受試者的方法,該方法包括:(i)測(cè)定ambra-1和兜甲蛋白在得自受試者的組織樣本中的表達(dá),其中組織樣本包含覆蓋原發(fā)性黑素瘤的組織;(ii)比較在(i)中獲得的表達(dá)與參考組織或由此獲得的水平,和如果與參考組織或水平比較,ambra-1和兜甲蛋白在組織樣本中的表達(dá)有降低,或ambra-1和兜甲蛋白在組織樣本中的表達(dá)喪失,則給予受試者治療劑。依據(jù)本發(fā)明的第八方面,提供用于預(yù)測(cè)罹患黑素瘤的受試者轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加的體外試驗(yàn),該試驗(yàn)包括:(i)使得自受試者的組織樣本與對(duì)ambra-1特異性的第一配體接觸,其中ambra-1的存在產(chǎn)生一種ambra-1-配體復(fù)合物;(ii)使組織樣本與對(duì)兜甲蛋白特異性的第二配體接觸,其中兜甲蛋白的存在產(chǎn)生一種兜甲蛋白-配體復(fù)合物;和(iii)檢測(cè)和/或定量ambra-1-配體復(fù)合物和兜甲蛋白-配體復(fù)合物。受試者可以是罹患黑素瘤的人或動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中,受試者是人患者。在一些實(shí)施方案中,受試者已經(jīng)被診斷為患有黑素瘤。在一些實(shí)施方案中,受試者正罹患ajcc1期、2期、3期或4期黑素瘤。在一些實(shí)施方案中,受試者正罹患ajcc1a期、1b期、2a期、2b期或2c期黑素瘤。在一些實(shí)施方案中,受試者正罹患ajcc1a期或1b期黑素瘤。在一些實(shí)施方案中,在此描述的方法還包括依據(jù)ajcc分期標(biāo)準(zhǔn),對(duì)得自受試者的組織樣本中存在的原發(fā)性腫瘤分期。對(duì)早期黑素瘤的治療通常包括手術(shù)以切除腫瘤。療法一般用來(lái)控制疾病晚期轉(zhuǎn)移的擴(kuò)散,此時(shí)預(yù)后通常是差的。鑒定處于疾病的早期但面臨高的或增加的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的那些受試者將便利地使治療能夠相應(yīng)地定制。例如,療法可比它可能正常地給予時(shí)更快地給予那些受試者,從而抑制、預(yù)防或延遲轉(zhuǎn)移并改進(jìn)那些受試者的預(yù)后。因此,在一些實(shí)施方案中,受試者在鑒定之前不符合用治療劑治療。在某些實(shí)施方案中,與治療黑素瘤的現(xiàn)有技術(shù)方法比較,可在較早或較少進(jìn)展的階段向受試者提供治療方案,在現(xiàn)有技術(shù)方法中患者當(dāng)他們正罹患ajcc3期或4黑素瘤,或在ajcc2或3期黑素瘤后疾病復(fù)發(fā)時(shí),僅用治療劑治療。在一些實(shí)施方案中,受試者患有潰爛性黑素瘤。出乎意料地,本發(fā)明人已鑒定ambra-1和兜甲蛋白二者的表達(dá)水平和黑素瘤受試者中轉(zhuǎn)移的可能性之間的相關(guān)性。特別是,認(rèn)為ambra-1和兜甲蛋白二者的表達(dá)水平降低,或表達(dá)喪失,表示受試者具有增加的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。如在此所用的,ambra-1和兜甲蛋白的表達(dá)的降低或喪失將被理解為意指ambra-1和兜甲蛋白二者的表達(dá)水平少于各自的參考水平的約75%。在一些實(shí)施方案中,ambra-1和兜甲蛋白的表達(dá)的降低將被理解為意指ambra-1和兜甲蛋白二者的表達(dá)水平是各自的參考水平的從約25至約75%。在一些實(shí)施方案中,ambra-1和兜甲蛋白的表達(dá)的喪失將被理解為意指ambra-1和兜甲蛋白二者的表達(dá)水平少于相關(guān)蛋白的參考水平的約25%。正常表達(dá)被理解為意指ambra-1和兜甲蛋白二者的表達(dá)大于各自的參考水平的約75%。因此,在一些實(shí)施方案中,ambra-1在組織樣本中的表達(dá)水平是從約25%至約75%的參考水平。在一些實(shí)施方案中,ambra-1的表達(dá)水平不大于75%,不大于70%,不大于60%,不大于50%,不大于40%或不大于30%的參考水平。在一些實(shí)施方案中,兜甲蛋白在組織樣本中的表達(dá)水平是從約25%至約75%的參考水平。在一些實(shí)施方案中,兜甲蛋白的表達(dá)水平不大于75%,不大于70%,不大于60%,不大于50%,不大于40%或不大于30%的參考水平。在一些實(shí)施方案中,在組織樣本中基本上沒有ambra-1和/或兜甲蛋白的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中,ambra-1和/或兜甲蛋白的表達(dá)少于25%。在一些實(shí)施方案中,轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加意指7-年無(wú)轉(zhuǎn)移(也稱為“無(wú)疾病”)存活率少于50%,例如少于40%,例如少于30%,例如少于20%,例如少于10%或例如少于5%。因此,ambra-1和兜甲蛋白可被考慮為黑素瘤疾病進(jìn)展為轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)記。因此,本發(fā)明的實(shí)施方案可被考慮為提供用于預(yù)測(cè)受試者的黑素瘤進(jìn)展為轉(zhuǎn)移的方法。在一些實(shí)施方案中,本發(fā)明還提供ambra-1和兜甲蛋白在包含覆蓋原發(fā)性黑素瘤的組織的組織樣本中作為黑素瘤疾病進(jìn)展為轉(zhuǎn)移的預(yù)兆性生物標(biāo)記的用途。適當(dāng)?shù)?,ambra-1和兜甲蛋白可被考慮為用于將患有黑素瘤的受試者劃分成更可能發(fā)生轉(zhuǎn)移的那些和不太可能發(fā)生轉(zhuǎn)移的那些的生物標(biāo)記。有利地,本發(fā)明的某些實(shí)施方案的方法幫助鑒定最可能從用治療劑治療受益的患有黑素瘤的受試者。適當(dāng)?shù)?,本發(fā)明的某些實(shí)施方案可使得能夠用治療劑治療否則不符合用治療劑治療的患者。并非測(cè)定在腫瘤本身中的生物標(biāo)記的表達(dá)水平,本發(fā)明的某些實(shí)施方案的方法包括測(cè)定ambra-1和兜甲蛋白在覆蓋原發(fā)性黑素瘤的組織中的表達(dá)水平。不受理論的束縛,認(rèn)為這些蛋白的表達(dá)減少或喪失可表示覆蓋腫瘤的表皮和腫瘤下面的內(nèi)襯血管或淋巴管的內(nèi)皮組織的分解,提示癌細(xì)胞可以能夠,或可能已經(jīng)從原發(fā)性腫瘤遷移。這樣的遷移可導(dǎo)致轉(zhuǎn)移。在一些實(shí)施方案中,組織樣本包含覆蓋原發(fā)性黑素瘤的組織。在一些實(shí)施方案中,組織樣本包含覆蓋原發(fā)性黑素瘤的腫瘤周圍的表皮的至少一部分。在一些實(shí)施方案中,組織樣本還包含鄰近原發(fā)性黑素瘤的部分正常組織。在一些實(shí)施方案中,部分正常組織提供一種參考。適當(dāng)?shù)?,參考是參考組織和/或提供ambra-1和兜甲蛋白的參考水平。在一些實(shí)施方案中,所述方法包括測(cè)定ambra-1和兜甲蛋白在表皮中的表達(dá)水平。角化細(xì)胞是組成約90%的表皮的細(xì)胞。因此,在一些實(shí)施方案中,組織樣本包含覆蓋原發(fā)性黑素瘤的角化細(xì)胞。適當(dāng)?shù)?,受試者可被鑒定為處于增加的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)中,其中所述鑒定包括測(cè)定受試者具有ambra-1和兜甲蛋白在受試者的覆蓋原發(fā)性黑素瘤的角化細(xì)胞中的表達(dá)降低或喪失。在一些實(shí)施方案中,組織樣本先前已得自受試者,以致采樣本身不形成本發(fā)明的方法的一部分。樣本可在本方法之前即刻,或在本方法之前數(shù)小時(shí)、數(shù)天或數(shù)周已經(jīng)獲得。在其它實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法可另外地包括從受試者獲得組織樣本的步驟。適當(dāng)?shù)?,將ambra-1和兜甲蛋白在組織樣本中的表達(dá)與一個(gè)或多個(gè)參考比較。適當(dāng)?shù)?,參考是組織,或由此獲得的表達(dá)水平。在一些實(shí)施方案中,參考包含為正常組織的特征的ambra-1和兜甲蛋白表達(dá)的水平。適當(dāng)?shù)?,兜甲蛋白和ambra-1的參考水平可通過(guò)測(cè)定兜甲蛋白和ambra-1在參考組織中的表達(dá)獲得。在一些實(shí)施方案中,兜甲蛋白和ambra-1在參考組織中的表達(dá)水平通過(guò)視覺或自動(dòng)評(píng)估測(cè)定。在一些實(shí)施方案中,為正常組織的特征的ambra-1和兜甲蛋白表達(dá)的參考水平通過(guò)測(cè)定在得自一個(gè)或多個(gè)(如一群)健康受試者的組織樣本中的表達(dá)水平獲得。在一些實(shí)施方案中,參考組織包含正常組織。在一些實(shí)施方案中,正常組織包含來(lái)自不包括原發(fā)性黑素瘤的部位的表皮。在一些實(shí)施方案中,參考組織(或由此獲得的水平)是內(nèi)部參考(即得自受試者)。在一些實(shí)施方案中,參考組織是得自鄰近原發(fā)性黑素瘤的部位的正常組織。在其它實(shí)施方案中,參考組織得自遠(yuǎn)離原發(fā)性黑素瘤的受試者的部位。因此,在一些實(shí)施方案中,參考水平是兜甲蛋白和/或ambra-1在正常組織中的表達(dá)水平。參考組織適當(dāng)?shù)厝∽哉1砥?,而參考水平是在正常表皮的角化?xì)胞中的表達(dá)水平。ambra-1和/或兜甲蛋白在參考組織中的表達(dá),例如生成參考水平,可使用本文描述的方法確定。適當(dāng)?shù)?,組織樣本可以是得自受試者的活組織檢查,或其切片。組織樣本,例如活組織檢查,可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種采樣方法,包括穿孔活組織檢查,刮削活組織檢查,寬泛的局部切除和其它手段獲得。適當(dāng)?shù)?,腫瘤樣本從原發(fā)性黑素瘤已從受試者切除的手術(shù)部位取得。適當(dāng)?shù)?,組織樣本可以是冷凍的、新鮮的、固定的(如福爾馬林固定的)、離心分離的,和/或包埋的(如石蠟包埋的)等。組織樣本可經(jīng)受或已經(jīng)受各種熟知的收集后制備和貯藏技術(shù)(如,核酸和/或蛋白提取、固定、貯藏、冷凍、超濾、濃縮、蒸發(fā)、離心分離等),然后評(píng)價(jià)樣本中的ambra-1和兜甲蛋白的量。同樣,活組織檢查也可經(jīng)受收集后制備和貯藏技術(shù),如固定。組織樣本,或其切片,可固定在固體載體,例如載玻片上。在一些實(shí)施方案中,測(cè)定ambra-1和兜甲蛋白在組織樣本中的表達(dá)包括測(cè)量存在于組織樣本中的每種蛋白的水平。這可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法實(shí)現(xiàn)。這樣的方法包括免疫分析,例如免疫組織化學(xué)、elisa、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀反應(yīng),隨后的sds-page和免疫細(xì)胞化學(xué)等。因此,在一些實(shí)施方案中,測(cè)定ambra-1和兜甲蛋白的表達(dá)水平包括進(jìn)行試驗(yàn)。在一些實(shí)施方案中,測(cè)定是體外試驗(yàn)。在一些實(shí)施方案中,受試者通過(guò)以一種方法測(cè)定ambra-1和兜甲蛋白在組織樣本中的表達(dá),被鑒定為具有增加的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn),所述方法包括:使組織樣本與對(duì)ambra-1特異性的第一配體接觸,其中ambra-1的存在產(chǎn)生一種ambra-1-配體復(fù)合物;使組織樣本與對(duì)兜甲蛋白特異性的第二配體接觸,其中兜甲蛋白的存在產(chǎn)生一種兜甲蛋白-配體復(fù)合物;和檢測(cè)和/或定量ambra-1-配體復(fù)合物和兜甲蛋白-配體復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中,第一配體包含抗-ambra-1抗體或適體。在一些實(shí)施方案中,抗-ambra-1抗體或適體特異性地結(jié)合于具有在seqidno.1中所示的序列的蛋白。在一些實(shí)施方案中,第二配體包含抗-兜甲蛋白抗體或適體。在一些實(shí)施方案中,抗-兜甲蛋白抗體或適體特異性地結(jié)合于具有在seqidno.2中所示的序列的蛋白。人ambra-1和兜甲蛋白的氨基酸序列作為例子在此提供,然而,應(yīng)意識(shí)到這些序列的變體可以是已知的或被鑒定的。在一些實(shí)施方案中,受試者是非-人哺乳動(dòng)物。因此還應(yīng)該意識(shí)到,在此提及ambra-1(或seqidno.1)和兜甲蛋白(或seqidno.2)包括其非人同系物的序列。在一些實(shí)施方案中,第一和/或第二配體包含檢測(cè)部分(如熒光標(biāo)記)。檢測(cè)部分能夠直接或間接檢測(cè)和/或量化形成的復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中,第一配體包含第一檢測(cè)部分和第二配體包含第二檢測(cè)部分。第一檢測(cè)部分可以是與第二檢測(cè)部分相同的,或它可以是不同的。在一些實(shí)施方案中,所述方法包括使組織樣本的第一部分或切片與第一配體接觸,并使組織樣本的第二部分或切片與第二配體接觸。這特別適合于其中第一檢測(cè)部分與第二檢測(cè)部分是相同的實(shí)施方案。在一些備選的實(shí)施方案中,所述方法包括使組織樣本,或其部分或切片,與第一配體接觸,和使相同的組織樣本,或其部分或切片,與第二配體接觸。有可能在相同的樣本,或其部分或切片中檢測(cè)和/或量化ambra-1-配體復(fù)合物和兜甲蛋白-配體復(fù)合物二者,特別地如果第一和第二檢測(cè)部分是不同的話。適當(dāng)?shù)?,第一?或第二配體可與一種或多種捕獲劑組合使用。因此,在一些實(shí)施方案中,檢測(cè)和/或定量ambra-1-配體復(fù)合物和兜甲蛋白-配體復(fù)合物的步驟包括使組織樣本(或其切片或部分)與至少一種捕獲劑接觸。適當(dāng)?shù)兀禺愋缘亟Y(jié)合于第一配體的第一捕獲劑可被用來(lái)檢測(cè)和/或量化ambra-1-配體復(fù)合物,而特異性地結(jié)合于第二配體的第二捕獲劑可被用來(lái)檢測(cè)和/或量化兜甲蛋白-配體復(fù)合物?;蛘?,可使用能夠特異性地結(jié)合于第一和第二配體二者的單一捕獲劑。在一些實(shí)施方案中,捕獲劑包含結(jié)合部分和檢測(cè)部分。在一些實(shí)施方案中,結(jié)合部分是特異性地結(jié)合于第一和/或第二配體的第二抗體。例如,結(jié)合部分可以是能夠結(jié)合于用作第一和第二配體的一次抗體的通用抗-igg抗體。在一些實(shí)施方案中,該方法還包括一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟以除去未結(jié)合的第一和第二配體和任選的未結(jié)合的捕獲劑。在一些特定實(shí)施方案中,提供一種預(yù)測(cè)罹患黑素瘤的受試者的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加的體外試驗(yàn),所述試驗(yàn)包括:使得自受試者的組織樣本的第一部分與對(duì)ambra-1特異性的第一配體接觸,其中ambra-1的存在產(chǎn)生一種ambra-1-配體復(fù)合物;使組織樣本的第二部分與對(duì)兜甲蛋白特異性的第二配體接觸,其中兜甲蛋白的存在產(chǎn)生一種兜甲蛋白-配體復(fù)合物;洗滌組織樣本的第一和第二部分以除去未結(jié)合的配體;使組織樣本的第一和第二部分接觸捕獲劑,其中捕獲劑包含對(duì)第一和第二配體特異性的檢測(cè)部分和結(jié)合部分;洗滌組織樣本的第一和第二部分以除去未結(jié)合的捕獲劑;和檢測(cè)和/或定量組織樣本的第一和第二部分中存在的捕獲劑。適當(dāng)?shù)?,合適的檢測(cè)部分選自熒光部分、發(fā)光部分、生物發(fā)光部分、放射性物質(zhì)、比色部分、具有合適的可檢測(cè)特性的納米粒子、發(fā)色部分、生物素或酶。合適的熒光部分包括熒光蛋白(例如藻紅蛋白(pe)、多甲藻素-葉綠素-蛋白復(fù)合物(percp)和別藻藍(lán)蛋白(apc))、熒光染料(例如異硫氰酸熒光素(fitc)、若丹明(rs)和藍(lán)色素(cys))、熒光串聯(lián)復(fù)合物(例如別藻藍(lán)蛋白-藍(lán)色素7(apc-cy7)、多甲藻素-葉綠素-蛋白復(fù)合物-藍(lán)色素5(percp-cy5)和藻紅蛋白-得克薩斯紅(pe-texasred)),和納米晶體(例如qdot525、qdot545和qdot625)。ambra-1-配體和兜甲蛋白-配體復(fù)合物的存在可使用熒光顯微鏡,經(jīng)由使用熒光配體或包含熒光檢測(cè)部分的捕獲劑檢測(cè)。在其中檢測(cè)部分包含酶的實(shí)施方案中,ambra-1-配體復(fù)合物和兜甲蛋白-配體復(fù)合物的存在可通過(guò)檢測(cè)和/或定量由酶催化的底物反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)和/或量化。在這些實(shí)施方案中,該方法還包括加入酶的底物和檢測(cè)和/或定量酶在底物上進(jìn)行反應(yīng)的產(chǎn)物。例如,反應(yīng)可導(dǎo)致有色沉淀的產(chǎn)生,其將使用光學(xué)顯微鏡檢測(cè)。合適的酶包括,例如,堿性磷酸酶和辣根過(guò)氧化物酶。堿性磷酸酶的發(fā)色底物是pnpp(對(duì)硝基苯基磷酸二鈉鹽)。pnpp產(chǎn)生一種在405nm處吸光的黃色水溶性反應(yīng)產(chǎn)物。辣根過(guò)氧化物酶的發(fā)色底物包括abts(2,2'-連氮雙[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二銨鹽),其產(chǎn)生一種綠色反應(yīng)產(chǎn)物;opd(鹽酸鄰苯二胺),其產(chǎn)生一種橙黃色反應(yīng)產(chǎn)物;和當(dāng)檢測(cè)hrp時(shí),tmb(3,3',5,5'-四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯)可溶性底物產(chǎn)生一種藍(lán)色。其它合適的酶-底物組合,檢測(cè)ambra-1-配體和兜甲蛋白-配體復(fù)合物的方法,和合適的檢測(cè)部分將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在一些實(shí)施方案中,第一和/或第二配體或捕獲劑被固定在固相表面,例如微陣列、載玻片、孔或珠上。在一些實(shí)施方案中,ambra-1和兜甲蛋白的表達(dá)經(jīng)視覺評(píng)估檢測(cè)和/或定量,例如,微陣列。在其它實(shí)施方案中,ambra-1和兜甲蛋白的表達(dá)通過(guò)自動(dòng)玻片掃描儀檢測(cè)和/或定量。依據(jù)本發(fā)明的第九個(gè)方面,提供一種預(yù)測(cè)罹患黑素瘤的受試者發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)增加的試劑盒,所述試劑盒包含:對(duì)ambra-1特異性的第一配體;和對(duì)兜甲蛋白特異性的第二配體。在一些實(shí)施方案中,試劑盒還包含使用試劑盒以預(yù)測(cè)罹患黑素瘤的受試者轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)的用法說(shuō)明書。在一些實(shí)施方案中,試劑盒還包含至少一種捕獲劑。適當(dāng)?shù)?,捕獲劑可包含對(duì)第一和/或第二配體特異性的檢測(cè)部分和結(jié)合部分。在一些實(shí)施方案中,第一和/或第二配體和/或捕獲劑包含作為檢測(cè)部分的酶,和試劑盒還包含酶的底物。適當(dāng)?shù)兀噭┖羞€可包含一個(gè)或多個(gè)另外的成分例如為進(jìn)行體外試驗(yàn)必需的試劑和/或設(shè)備,如緩沖劑、固定劑、洗滌溶液、封閉試劑、稀釋劑、發(fā)色體、酶、底物、試管、測(cè)定板、吸液管等。本發(fā)明的某些實(shí)施方案的試劑盒可有利地用來(lái)進(jìn)行本發(fā)明的某些實(shí)施方案的方法并可用于各種應(yīng)用,例如用于診斷領(lǐng)域或作為一種研究工具。要意識(shí)到試劑盒的各部分可被單獨(dú)包裝在小瓶中或組合包裝在容器或多-容器單位中。適當(dāng)?shù)?,試劑盒的生產(chǎn)遵循本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中,在受試者被鑒定為具有在組織樣本中ambra-1和兜甲蛋白的表達(dá)降低或喪失后不超過(guò)12周,不超過(guò)10周,不超過(guò)6周,不超過(guò)4周,不超過(guò)2周或不超過(guò)1周,給予受試者治療劑。在一些實(shí)施方案中,治療劑是化學(xué)治療劑。任何可獲得的、合適的化學(xué)治療劑可給予受試者。如在此所用的,“化學(xué)治療劑”意指任何可用來(lái)治療癌癥的治療劑,并涵蓋小分子以及生物制劑,例如抗體。在一些實(shí)施方案中,化學(xué)治療劑選自達(dá)卡巴嗪(dtic)、替莫唑胺、nab-紫杉醇、紫杉醇、卡莫司汀(bcnu)、順鉑、卡鉑、長(zhǎng)春堿、白介素2、α干擾素、抗體(如伊匹木單抗、抗-pd1抗體)和b-raf抑制劑(如維羅非尼(vemurafenib)、達(dá)帕菲尼(dabrafenib))。給予治療劑的非-限制性途徑包括口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、局部、皮內(nèi)、鼻內(nèi)或支氣管內(nèi)給予(例如如通過(guò)吸入進(jìn)行的)。在一些實(shí)施方案中,治療劑經(jīng)胃腸外給予,如靜脈內(nèi)。治療劑可經(jīng)此給予的常見給藥模式包括,例如,在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)作為推注劑量或作為輸注給予。治療劑可以以有效預(yù)防、抑制或延遲轉(zhuǎn)移的發(fā)生的量給予。用于給定的受試者和治療劑的合適的劑量和劑量方案可使用各種不同方法,例如身體-表面積或身體-重量,或依據(jù)專題文獻(xiàn)和/或各個(gè)醫(yī)院的協(xié)議確定。劑量還可在考慮了受試者的中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、腎和肝功能,和任何以前的對(duì)治療劑的副作用歷史后調(diào)整。劑量也可根據(jù)治療劑是否單獨(dú)或組合使用而不同。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到其它給藥模式、治療劑的劑量和治療方案可由治療醫(yī)師依據(jù)本領(lǐng)域已知的方法確定。本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種確定用于罹患黑素瘤的受試者的治療方案的方法,該方法包括:a)從受試者獲得組織樣本,其中組織樣本包含覆蓋原發(fā)性黑素瘤的組織;b)測(cè)定ambra-1和兜甲蛋白在組織樣本中的表達(dá);c)比較在(b)中獲得的表達(dá)與參考組織或由此獲得的水平,和d)(i)如果ambra-1和兜甲蛋白的表達(dá)是正常的或增加,則遵循正常認(rèn)可的護(hù)理途徑,或(ii)如果ambra-1和兜甲蛋白的表達(dá)降低或喪失,則用系統(tǒng)性抗-癌治療方案治療受試者。“正常認(rèn)可的護(hù)理途徑”,如將為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的,將被理解為意指,在受試者上進(jìn)行通過(guò)切除原發(fā)性黑素瘤留下的疤痕的較寬切除。較寬切除的尺寸將由臨床醫(yī)師或外科醫(yī)師,基于原發(fā)性黑素瘤的布雷斯洛深度確定。正常認(rèn)可的護(hù)理途徑還可包括受試者持續(xù)至多5年的定期(如每3-12個(gè)月)臨床評(píng)價(jià)。在一些實(shí)施方案中,其中原發(fā)性黑素瘤是2b或2c期,正常認(rèn)可的護(hù)理途徑還可包括在診斷時(shí)間內(nèi)對(duì)受試者,從頭到骨盆進(jìn)行分期ct掃描。一些治療中心提供全部2a、2b和2c期腫瘤的分期前哨淋巴結(jié)活組織檢查。因此,在一些實(shí)施方案中,正常認(rèn)可的護(hù)理途徑還可包括進(jìn)行前哨淋巴結(jié)活組織檢查。在一些實(shí)施方案中,系統(tǒng)性抗-癌治療方案包括給予受試者治療劑。本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種治療罹患黑素瘤的受試者的方法。理想地,對(duì)鑒定為具有增加的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的受試者盡可能快地治療,以使發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性最小化。因此,在一些實(shí)施方案中,所述方法或治療方案在受試者中預(yù)防、抑制或延遲轉(zhuǎn)移或降低轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。在一些實(shí)施方案中,受試者在被鑒定為具有增加的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)后立即或不久被治療。在一些實(shí)施方案中,用治療劑治療在切除原發(fā)性黑素瘤的手術(shù)后進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中,治療方法或治療方案還可包括以下一個(gè)或多個(gè):該受試者的增強(qiáng)成像(如ct掃描、pet、mri、x-射線);討論和/或提供,或進(jìn)行前哨淋巴結(jié)活組織檢查;部分或完整的淋巴切除術(shù);在臨床試驗(yàn)中包括該受試者;和放射療法。某些實(shí)施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施方案現(xiàn)在將僅僅通過(guò)舉例的方式,并參考附圖描述,其中:圖1a-1d是顯示ambra-1在正常表皮中表達(dá)(圖1a)和覆蓋ajcci期黑素瘤的腫瘤周圍的表皮中表達(dá)(圖1b-1d)的光學(xué)顯微鏡圖像。比例尺:50μm。圖2a-2c是顯示兜甲蛋白在正常表皮中表達(dá)(圖2a),和覆蓋ajcci期黑素瘤的腫瘤周圍的表皮中表達(dá)(圖2b-2c)的免疫熒光顯微鏡圖像。比例尺:50μm。圖3a顯示表皮ambra-1在全部ajcc各期黑素瘤中表達(dá)的單變量分析。顯示7-年無(wú)疾病存活(直到檢測(cè)出首次轉(zhuǎn)移的月份)的卡普蘭-邁耶曲線(kaplan-meiercurve),在原發(fā)性黑素瘤表皮中ambra-1表達(dá)無(wú)變化(頂線)、降低或缺乏ambra-1表達(dá)(虛線)或潰爛性腫瘤(底線)。對(duì)數(shù)秩(mantel-cox)檢驗(yàn)p<0.0001。dfs=100%無(wú)ambra-1喪失,72.1%降低或缺乏ambra-1,35.7%有潰爛。無(wú)喪失的ambra-1和降低的/缺乏ambra-1對(duì)數(shù)秩(mantel-cox)檢驗(yàn)的直接分析p=0.0270,hr3.56(95%ci1.16-10.93);圖3b顯示在ajcci期黑素瘤的試驗(yàn)組中ambra-1表達(dá)的多變量分析。顯示在ajcci期原發(fā)性黑素瘤表皮中的7-年無(wú)疾病存活(直到檢測(cè)出首次轉(zhuǎn)移的月份)的卡普蘭-邁耶曲線,其揭示與具有缺乏表皮ambra-1的i期腫瘤(底線)比較的ambra-1表達(dá)無(wú)變化(頂線)。dfs=100%無(wú)ambra-1喪失,83.3%降低或缺乏ambra-1。對(duì)數(shù)秩(mantel-cox)檢驗(yàn)p=0.0575,hr4.29(95%ci0.95-19.25);圖4a是顯示在表皮中7-年無(wú)疾病存活(直到檢測(cè)出首次轉(zhuǎn)移的月份)的卡普蘭-邁耶曲線,在所有腫瘤類型中,與其中ambra-1的表達(dá)喪失的那些(底線)比較,在所述表皮中ambra-1表達(dá)維持(頂線)。p=0.0007,hr10.1(95%ci2.65-38.5);圖4b是顯示在表皮中7-年無(wú)疾病存活(直到檢測(cè)出首次轉(zhuǎn)移的月份)的卡普蘭-邁耶曲線,在所有腫瘤類型中,與其中兜甲蛋白的表達(dá)喪失的那些(底線)比較,在所述表皮中兜甲蛋白表達(dá)維持(頂線)。p=0.0006,hr18.4(95%ci3.5-96.2);圖4c是顯示在表皮中7-年無(wú)疾病存活(直到檢測(cè)出首次轉(zhuǎn)移的月份)的卡普蘭-邁耶曲線,在所有腫瘤類型中,與其中ambra-1和兜甲蛋白的表達(dá)喪失的那些(底線)比較,在所述表皮中ambra-1和兜甲蛋白表達(dá)均維持(頂線)。p=<0.0001,hr39.6(95%ci6.4-243.9);圖5a是顯示在ajcci期原發(fā)性黑素瘤表皮中7-年無(wú)疾病存活(直到檢測(cè)出首次轉(zhuǎn)移的月份)的卡普蘭-邁耶曲線,與其中ambra-1表達(dá)喪失的那些(底線)比較,在所述表皮中ambra-1表達(dá)維持(頂線)。p=0.001,hr24.12(95%ci3.6-161);圖5b是顯示在ajcci期原發(fā)性黑素瘤表皮中7-年無(wú)疾病存活(直到檢測(cè)出首次轉(zhuǎn)移的月份)的卡普蘭-邁耶曲線,與其中兜甲蛋白表達(dá)喪失的那些(底線)比較,在所述表皮中兜甲蛋白表達(dá)維持(頂線)。p<0.0001,hr210(95%ci16.86-2624);圖5c是顯示在ajcci期原發(fā)性黑素瘤表皮中7-年無(wú)疾病存活(直到檢測(cè)出首次轉(zhuǎn)移的月份)的卡普蘭-邁耶曲線,與其中ambra-1和兜甲蛋白表達(dá)喪失的那些(底線)比較,在所述表皮中ambra-1和兜甲蛋白表達(dá)均維持(頂線)。p=0.0002,hr93.5(95%ci8.67-1008);圖6顯示來(lái)自u(píng)niprotkb(主入藏登記號(hào)q9c0c7-1,同工型1)(seqidno.1)的智人ambra-1的氨基酸序列;和圖7顯示來(lái)自u(píng)niprotkb(主入藏登記號(hào)p23490)(seqidno.2)的智人兜甲蛋白的氨基酸序列。圖8顯示ambra-1(抗-ambra-1抗體(abcambiochemicals,cambridge,uk;69501;1:200))在正常表皮(a),或覆蓋i期黑素瘤(b)中表達(dá)的一系列顯微鏡圖像。ambra-1維持,(c)。ambra-1降低和(d)ambra-1完全喪失。圖9顯示兜甲蛋白(抗-兜甲蛋白抗體(abcambiochemicals,cambridge,uk;24722;1:500))在正常表皮(a),或覆蓋i期黑素瘤(b)中表達(dá)的一系列顯微鏡圖像。兜甲蛋白維持,(c)兜甲蛋白完全喪失。圖10顯示對(duì)腫瘤周圍的ambra-1的變化(無(wú)喪失、一些喪失或完全喪失)給出的視覺評(píng)分和與腫瘤周圍的表皮比較的正常表皮中染色陽(yáng)性百分比降低的量化分析結(jié)果之間的關(guān)系。水平線表示均數(shù)評(píng)分百分比±均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差(0=12.05,1=25.16,3=46.92)。單因素anovap<0.0001****圖11顯示對(duì)腫瘤周圍的ambra-1的變化給出的視覺評(píng)分與無(wú)喪失或一些喪失染色和完全喪失染色之間的關(guān)系。水平線表示均數(shù)評(píng)分百分比±標(biāo)準(zhǔn)差(無(wú)/一些喪失均數(shù)=18.12sd12.97,完全喪失均數(shù)=46.92sd15.34)。曼-惠特尼秩和檢驗(yàn)(mann-whitney)p<0.0001****圖12顯示在全部ajcci期黑素瘤中表皮ambra-1表達(dá)的單變量分析。顯示在無(wú)喪失或減少的ambra-1表達(dá)(黑線),對(duì)比缺乏ambra-1表達(dá)(紅線)的原發(fā)性黑素瘤表皮中的7-年無(wú)疾病存活(直到檢測(cè)出首次轉(zhuǎn)移的月份)的卡普蘭-邁耶曲線。dfs=97.7%無(wú)喪失/降低的ambra-1(n=44),94.3%缺乏ambra-1(n=35)。對(duì)數(shù)秩(mantel-cox)檢驗(yàn)p=0.411,hr2.59(95%ci0.26-25.05)。圖13顯示在全部ajcci期黑素瘤中表皮ambra-1和兜甲蛋白的組合表達(dá)的單變量分析。顯示在維持一些表皮ambra-1或兜甲蛋白表達(dá)(“低風(fēng)險(xiǎn)”黑線),對(duì)比喪失ambra-1和兜甲蛋白二者的表皮表達(dá)(“高風(fēng)險(xiǎn)”紅線)的原發(fā)性黑素瘤表皮中的7-年無(wú)疾病存活(直到檢測(cè)出首次轉(zhuǎn)移的月份)的卡普蘭-邁耶曲線。dfs=98.46%低風(fēng)險(xiǎn)(n=65),86.67%高風(fēng)險(xiǎn)(n=15)。對(duì)數(shù)秩(mantel-cox)檢驗(yàn)p=0.025,hr9.29(95%ci1.49-558.0)。本發(fā)明某些實(shí)施方案的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)在下文提供。定義如在此所用的術(shù)語(yǔ)"抗體"意欲包括單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源抗體、雙-特異性抗體、抗體-藥物綴合物,和抗體的結(jié)構(gòu)域和片段,包括fab、fab'、f(ab')2、scfv、dsfv、ds-scfv、二聚體、微抗體(minibodies)、雙抗體(diabodies)及其多聚體??贵w可使用常規(guī)技術(shù)被片段化??贵w可來(lái)自任何動(dòng)物來(lái)源,包括鳥和哺乳動(dòng)物(如,人、鼠、驢、綿羊、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬,或雞)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,或來(lái)自重組來(lái)源??贵w可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備。如在此所用的,術(shù)語(yǔ)"原發(fā)性黑素瘤"指在無(wú)區(qū)域或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性疾病的臨床或組織學(xué)證據(jù)的患者的來(lái)源部位的皮膚上的惡性腫瘤,而不管其厚度。如在此所用的,措辭“覆蓋原發(fā)性黑素瘤的組織”,指位于原發(fā)性黑素瘤和皮膚表面之間的表皮組織。如在此所用的,術(shù)語(yǔ)“正常組織”包括例如“正常表皮”,其是健康(即無(wú)疾病)表皮。在一些實(shí)施方案中,正常組織是位于原發(fā)性黑素瘤附近的表皮,例如在原發(fā)性黑素瘤樣本附帶的正常皮膚的套囊內(nèi)。如在此所用的,“腫瘤周圍的表皮”指覆蓋或位于腫瘤周圍的表皮組織。如在此所用的,"轉(zhuǎn)移"被定義為可局部(例如局部復(fù)發(fā)和在轉(zhuǎn)移疾病中)、區(qū)域(例如結(jié)節(jié)微轉(zhuǎn)移或宏轉(zhuǎn)移),或遠(yuǎn)端(例如腦、肺和其它組織)發(fā)生的復(fù)發(fā)或疾病進(jìn)展。在一些實(shí)施方案中,術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)移”被用來(lái)指在原發(fā)性黑素瘤之后轉(zhuǎn)移的疾病。通常,源自原發(fā)性黑素瘤的轉(zhuǎn)移可擴(kuò)散至受試者的肺和/或腦以及其它位置。要理解如在此所用的術(shù)語(yǔ)“比較”和“對(duì)比”通常指對(duì)應(yīng)的參數(shù)或水平的比較,如絕對(duì)量與絕對(duì)參考量比較,而濃度與參考濃度比較,或從組織樣本獲得的信號(hào)強(qiáng)度信號(hào)與從參考獲得的相同類型的信號(hào)強(qiáng)度比較。比較可手工進(jìn)行,例如由視覺評(píng)估,或它可自動(dòng)(如使用自動(dòng)掃描儀或計(jì)算機(jī)-輔助裝置)進(jìn)行。因此,比較可用計(jì)算設(shè)備進(jìn)行。黑素瘤的階段分期是其廣泛擴(kuò)散到何種程度的描述。這包括其在皮膚中的厚度,是否它已擴(kuò)散至附近的淋巴結(jié)或任何其它器官,以及某些其它因素。分期是基于物理檢查、活組織檢查,和任何成像試驗(yàn)(ct或mri掃描等)或已經(jīng)進(jìn)行的其它試驗(yàn)的結(jié)果。這樣的試驗(yàn)將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。最常用來(lái)對(duì)黑素瘤分期的系統(tǒng)是美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(ajcc)tnm系統(tǒng)。表1描述鑒定每個(gè)階段的特征。表1實(shí)施例材料和方法實(shí)施例1對(duì)于ambra-1和兜甲蛋白的免疫組織化學(xué)表2中所示的來(lái)自患者組的原發(fā)性黑素瘤組織的分析通過(guò)福爾馬林-固定的石蠟-包埋的切片的免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行。將5-6μm厚度的組織切片于56℃烘烤到x-tra顯微鏡載玻片上(leicamicrosystems,miltonkeynes,uk)過(guò)夜。然后使它們?cè)趆istoclear(agtcbioproducts,hessle,uk)中孵育20分鐘,然后在100%、75%、50%乙醇中,和然后在蒸餾水中各自再水合5秒。抗原恢復(fù)通過(guò)在預(yù)熱抗原恢復(fù)緩沖劑中(ambra-1(10mmtris-hcl(ph7.6))、兜甲蛋白(10mm檸檬酸鈉(ph6.0))微波加熱12分鐘,然后使之冷卻20分鐘進(jìn)行。使每個(gè)切片干燥并用immedge疏水筆(vectorlaboratoriesinc.,burlingame,usa)分離組織。然后使切片與pbs/0.05%吐溫(pbs/t)一起孵育3分鐘以允許再水合,然后與0.2%tritonx-100(sigma,st.louis,usa)一起在pbs/t中孵育10分鐘。在用pbs/t洗滌后,使切片在3%h2o/水中孵育10分鐘以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。內(nèi)源性抗生物素蛋白用抗生物素蛋白/生物素封閉試劑盒(vectorlaboratoriesinc.,burlingame,usa)的抗生物素蛋白溶液封閉15分鐘,然后用pbs/t進(jìn)一步洗滌并與試劑盒的生物素部分一起孵育15分鐘,隨后用pbs/t洗滌。蛋白封閉通過(guò)使切片在來(lái)自動(dòng)物特定vectastainelite試劑盒(vectorlaboratoriesinc.,burlingame,usa)的2%封閉血清中孵育來(lái)進(jìn)行。在另外的pbs/t洗滌后,于室溫下,使切片用一次抗體以抗-ambra-1抗體(abcambiochemicals,cambridge,uk;69501;1:200)或抗-兜甲蛋白抗體(abcambiochemicals,cambridge,uk;24722;1:500)一起孵育1小時(shí)。用pbs/t洗滌3次后,于室溫下,用生物素化動(dòng)物特異性二次抗體檢測(cè)一次抗體30分鐘,然后用pbs/t進(jìn)一步洗滌3次。染色通過(guò)與來(lái)自vectastainelite試劑盒的abc試劑(預(yù)混合30分鐘,然后使用)一起孵育30分鐘來(lái)進(jìn)行,接著用pbs/t洗滌3次,然后與vip溶液(vectorlaboratoriesinc.,burlingame,usa)一起孵育10分鐘。載玻片用自來(lái)水淋洗5分鐘,然后用蘇木精(sigmadiagnostics,st.louis,usa)復(fù)染色2分鐘,接著用頻繁更換的自來(lái)水洗滌最后10分鐘。在通過(guò)75%和100%乙醇脫水5秒后,將切片用histoclear清潔2分鐘,使之干燥,然后蓋玻片用dpx封片劑(vwrinternationalltd.,poole,uk)固定。表達(dá)的測(cè)定正常表皮和腫瘤周圍的表皮之間的ambra-1和/或兜甲蛋白表達(dá)水平的差異最初是由3位皮膚科醫(yī)師和組織病理學(xué)家的共識(shí)協(xié)議確定的。使用leicaqwin圖像分析軟件(leicamicrosystems),作為在鄰近正常表皮的內(nèi)部控制參考中測(cè)定的ambra-1/兜甲蛋白表達(dá)的百分比,通過(guò)評(píng)價(jià)在腫瘤周圍的陽(yáng)性染色的細(xì)胞的百分比量化表達(dá)。這些觀察被分類為“維持”(>75%的正常表達(dá))、“降低”(25-75%的正常表達(dá))或“喪失”(<25%的正常表達(dá))。進(jìn)行每個(gè)切片的評(píng)價(jià),而無(wú)需最終的疾病后果的現(xiàn)有知識(shí)。表2:患者組患者數(shù)129男性:女性66:62診斷時(shí)的中位數(shù)年齡(范圍)58(17-87)診斷時(shí)的ajcc階段1a401b362a222b182c12最終ajcc階段(8年隨訪)1a381b272a122b72c4315425中位數(shù)布雷斯洛深度(范圍)1.55mm(0.3-15)潰爛性原發(fā)性腫瘤28統(tǒng)計(jì)學(xué)所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和圖像生成使用graphpadprism5(graphpadsoftware;sandiego,usa)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行。用于無(wú)疾病存活的研究變量的所有單變量和多變量分析使用卡普蘭-邁耶曲線構(gòu)建針對(duì)8-年隨訪,以及比較數(shù)據(jù)的對(duì)數(shù)秩(mantel-cox)分析來(lái)進(jìn)行。實(shí)施例1結(jié)果和討論本發(fā)明人鑒定ambra-1在覆蓋黑素瘤,特別是在ajcci期黑素瘤的腫瘤周圍的表皮中表達(dá)的降低,與降低的7年無(wú)疾病存活顯著相關(guān)。如在圖1a中所示,在位于ajcci期黑素瘤鄰近的正常表皮中,從基底層朝向角質(zhì)層,ambra-1表達(dá)增加,與維持分化一致。然而,ambra-1表達(dá)在覆蓋一系列ajcci期腫瘤的表皮中維持(圖1b)、降低(圖1c)或甚至喪失(圖1d)。參照?qǐng)D3,表皮ambra-1表達(dá)的喪失或降低與轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)??v貫全部ajcc黑素瘤(圖3a),顯示無(wú)喪失的ambra-1表達(dá)的100%患者在7年后無(wú)疾病。這在降低或缺乏ambra-1表達(dá)的患者中降低至72.1%。只有35.7%的患有潰爛性黑素瘤的患者在7年后無(wú)疾病。這凸顯了隨著ambra-1的喪失,疾病風(fēng)險(xiǎn)的逐步增加,并最終伴隨腫瘤的明顯潰爛。僅舉出ajcci期黑素瘤(圖3b),在7年后無(wú)疾病的患者的百分比對(duì)于ambra-1表達(dá)無(wú)喪失的那些為100%,對(duì)于降低或缺乏ambra-1表達(dá)的那些,減少至83.3%。圖4a和5a顯示較小組中的受試者的ambra-1表達(dá)和無(wú)疾病存活之間的相關(guān)性,在所述組中對(duì)全部腫瘤類型(圖4a)或僅對(duì)i期(圖5a)評(píng)價(jià)了7年的ambra-1和兜甲蛋白二者的表達(dá)??v貫全部腫瘤類型(圖4a),其中ambra-1的表達(dá)維持的全部患者在7年后無(wú)疾病。對(duì)于其中ambra-1表達(dá)喪失的那些,只有18%在7年后無(wú)疾病。對(duì)于i期腫瘤,維持ambra-1的表達(dá)的患者的100%再次未有轉(zhuǎn)移發(fā)生,而無(wú)疾病存活率對(duì)于喪失ambra-1表達(dá)的那些是17%。與本領(lǐng)域暗示ambra-1控制自噬的當(dāng)前的出版物相反,ambra-1在本文中的作用被認(rèn)為是下調(diào)正常表皮的分化,導(dǎo)致喪失完整性。本發(fā)明人已證實(shí)其它自噬蛋白,例如atg1的下調(diào)不影響分化過(guò)程,支持這種過(guò)程與自噬無(wú)關(guān)的假設(shè)。出乎意料地,發(fā)現(xiàn)喪失兜甲蛋白表達(dá)也與轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。圖2a-c顯示正常兜甲蛋白在角質(zhì)層中表達(dá)(圖2a)以及在腫瘤周圍的表皮中表達(dá)(其中兜甲蛋白表達(dá)喪失(圖2b)或維持(圖2c))的代表性圖像。參照?qǐng)D4b和5b,表皮兜甲蛋白表達(dá)的喪失或降低與7年的無(wú)疾病存活降低有關(guān)??v貫全部ajcc黑素瘤(圖4b),兜甲蛋白表達(dá)維持的患者的64%在7年后無(wú)疾病。然而,喪失兜甲蛋白表達(dá)的患者沒有在5年后是無(wú)疾病的。對(duì)于ajcci期黑素瘤(圖5b),其中兜甲蛋白表達(dá)維持的患者的100%在7年后無(wú)疾病。喪失兜甲蛋白表達(dá)的患者沒有在5年后是無(wú)疾病的。這證實(shí)黑素瘤患者中兜甲蛋白表達(dá)和無(wú)疾病存活率之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著相關(guān)。然而,正如ambra-1,僅喪失兜甲蛋白,對(duì)ajcci期黑素瘤或者對(duì)于所有的腫瘤階段,并不能100%準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展(見表3)。然而,本發(fā)明人已確定ambra-1和兜甲蛋白二者的表達(dá)的測(cè)定是疾病進(jìn)展至轉(zhuǎn)移的強(qiáng)烈指示。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖4c和5c中,和在表3中概括。表31陽(yáng)性預(yù)測(cè)值2陰性預(yù)測(cè)值因此,已發(fā)現(xiàn)喪失ambra-1和喪失兜甲蛋白的組合以100%準(zhǔn)確性鑒定繼續(xù)發(fā)展轉(zhuǎn)移的患者。實(shí)施例2進(jìn)一步的分析在80個(gè)回顧的ajcci期黑素瘤患者的樣本中進(jìn)行,所述患者從獨(dú)立的詹姆斯庫(kù)克大學(xué)醫(yī)院(independentjamescookuniversityhospital)黑素瘤組中招募(表4)。分析揭示數(shù)據(jù)符合在上文詳述的最初回顧組的結(jié)果。表4免疫組織化學(xué)染色使用作為在臨床應(yīng)用中最廣泛使用的特定染料的dab復(fù)染劑進(jìn)行。使用紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)生物樣本庫(kù)(newcastleuniversitybiobank)內(nèi)的leicascn400數(shù)字玻片掃描儀(leicabiosystems)自動(dòng)掃描載玻片,對(duì)所有樣本數(shù)字成像(圖8和9)。表皮ambra-1喪失的視覺分析由2位獨(dú)立的皮膚科醫(yī)師進(jìn)行,并基于在腫瘤周圍的表皮中與相同的切片內(nèi)的正常表皮比較的喪失表皮ambra-1的程度,對(duì)每個(gè)載玻片賦予分值。在皮膚科醫(yī)師之間給出的評(píng)分中有95%的一致性,并且這些載玻片的進(jìn)一步的檢查導(dǎo)致對(duì)于每個(gè)的一致分?jǐn)?shù)。類似地,相同的兩個(gè)皮膚科醫(yī)師獨(dú)立地進(jìn)行表皮兜甲蛋白喪失的視覺分析。不是由于外層表皮的直接腫瘤侵襲導(dǎo)致的腫瘤周圍表皮的兜甲蛋白染色連續(xù)性的任何中斷被評(píng)分為兜甲蛋白喪失。對(duì)所有樣本達(dá)成97.5%的一致性。表皮ambra-1的量化分析使用leicaslidepath系統(tǒng)的先前驗(yàn)證的分析軟件進(jìn)行。以200x放大倍率選擇正常表皮的5個(gè)代表性區(qū)域并獲得dab陽(yáng)性像素的平均百分比。將其與在腫瘤周圍的表皮的10個(gè)代表性區(qū)域(200x放大倍率)的dab陽(yáng)性像素的平均百分比對(duì)比。然后計(jì)算在腫瘤周圍的表達(dá)和正常表皮的表達(dá)之間的ambra-1表達(dá)的總百分比降低。視覺和量化評(píng)分的比較(圖10)揭示了隨著視覺分析的腫瘤周圍ambra-1降低,量化評(píng)分的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著(p<0.0001)的逐步增加。這證實(shí)視覺評(píng)分為分析ambra-1表皮染色的穩(wěn)健和可靠方法。為確定存活分析的分割點(diǎn),視覺和量化評(píng)分用沒有喪失或有一些喪失的腫瘤周圍的ambra-1對(duì)比完全喪失來(lái)再分析(圖11)。這顯示在視覺評(píng)分的樣本中作為具有完全喪失ambra-1的定性評(píng)分的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加(p<0.0001)。這進(jìn)一步驗(yàn)證了視覺評(píng)分鑒定具有完全喪失的腫瘤周圍ambra-1的樣本的適宜性,和低于完全ambra-1喪失的均值的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(46.92均值sd15.34)給出30%的適宜截止,以確定ambra-1喪失的進(jìn)一步的定性分析。全部患者中腫瘤周圍的ambra-1喪失的單變量分析揭示在“高風(fēng)險(xiǎn)”(具有腫瘤周圍的ambra-1完全喪失的腫瘤,如通過(guò)表達(dá)的定性降低>30%所確定的)和“低風(fēng)險(xiǎn)”腫瘤(定性表達(dá)降低<30%)之間的無(wú)疾病生存沒有總體差異(圖5)。dfs=97.7%低風(fēng)險(xiǎn)腫瘤(n=44),94.3%高風(fēng)險(xiǎn)腫瘤(n=35)。對(duì)數(shù)秩(mantel-cox)檢驗(yàn)p=0.411,hr2.59(95%ci0.26-25.05)。這些結(jié)果不支持ambra-1作為在這個(gè)亞組患者中的預(yù)后的生物標(biāo)志。為評(píng)估表皮ambra-1和兜甲蛋白表達(dá)作為預(yù)后的生物標(biāo)志的組合的有效性,在所有的樣本中采用單變量分析。“高風(fēng)險(xiǎn)”樣本被鑒定為具有完全腫瘤周圍的ambra-1喪失(>30%的定量降低)和喪失兜甲蛋白。具有喪失ambra-1或者喪失兜甲蛋白的全部其它腫瘤被認(rèn)為是“低風(fēng)險(xiǎn)”的。這些結(jié)果顯示在高風(fēng)險(xiǎn)腫瘤組中轉(zhuǎn)移的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著增加的風(fēng)險(xiǎn),即使轉(zhuǎn)移事件的總數(shù)是低的;進(jìn)一步增強(qiáng)了ambra-1和兜甲蛋白的組合作為組合預(yù)后生物標(biāo)志在ajcci期疾病中的用途。dfs=98.46%低風(fēng)險(xiǎn)(n=65),86.67%高風(fēng)險(xiǎn)(n=15)。對(duì)數(shù)秩(mantel-cox)檢驗(yàn)p=0.025,hr9.29(95%ci1.49-558.0)。表5組合的ambra-1/兜甲蛋白生物標(biāo)志的最終分析強(qiáng)調(diào)了增加的特異性(83%),組合的ambra-1/兜甲蛋白的陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值(分別為13%和98.4%)超過(guò)和高于單獨(dú)的ambra-1或者兜甲蛋白(表5)。這表示組合的生物標(biāo)志將在更確定地鑒定高風(fēng)險(xiǎn)患者以增加監(jiān)視,以及鑒定低風(fēng)險(xiǎn)患者(所述患者可被打消關(guān)于他們的預(yù)后的疑慮)中增加預(yù)后價(jià)值。這是一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn),因?yàn)檫@兩種蛋白的表達(dá)的降低或喪失可表示覆蓋腫瘤的表皮和腫瘤下面的血管的分解,意味著癌細(xì)胞可能在腫瘤切除時(shí)已經(jīng)從原發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移。因此,本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種確定罹患黑素瘤的受試者是否處于增加的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)中的方法。這允許相應(yīng)定制治療方案,從而減少受試者發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)并改善其預(yù)后??v貫本申請(qǐng)的說(shuō)明書和權(quán)利要求書,單詞“包含”和“包括”及其變化意指“包括但不限于”并且它們不打算(且不)排除其它部分、添加物、組分、整數(shù)或步驟。縱貫本申請(qǐng)的說(shuō)明書和權(quán)利要求書,單數(shù)涵蓋復(fù)數(shù),除非上下文另有要求。特別是,當(dāng)使用不定冠詞時(shí),本申請(qǐng)應(yīng)被理解為涵蓋復(fù)數(shù)以及單數(shù),除非上下文另有要求。結(jié)合本發(fā)明的特定方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├枋龅奶匦浴⒄麛?shù)、特征或組,應(yīng)被理解為適用于在此描述的任何其它方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├?,除非與其不適配。本申請(qǐng)公開的全部特征(包括任何所附的權(quán)利要求書、摘要和附圖),和/或如此公開的任何方法或過(guò)程的所有步驟,可以任何組合合并,除了其中至少一些特征和/或步驟相互排斥的組合外。本發(fā)明不限于任何前述實(shí)施方案的任何細(xì)節(jié)。本發(fā)明擴(kuò)展至本申請(qǐng)中公開的任何新的特征,或新的特征組合(包括任何所附的權(quán)利要求書、摘要和附圖),或擴(kuò)展至如此公開的任何方法或過(guò)程的任何新的步驟,或任何新的步驟組合。讀者的注意涉及全部論文和文件,所述論文和文件結(jié)合本申請(qǐng)與本說(shuō)明書同時(shí)提交或在本說(shuō)明書之前提交,并且與本說(shuō)明書一起向公眾檢查公開,而所有這樣的論文和文件的內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。當(dāng)前第1頁(yè)12