一種生物素化atps的儲(chǔ)存試劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生物素化ATPS的儲(chǔ)存試劑。
【背景技術(shù)】
[0002] ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase，ATPS，EC 2.7.7.4)是一種可逆催化腺苷酰硫酸 (adenosine-5 ' -phospho sulfate，APS)與焦磷酸鹽（pyrophosphate，PPi)反應(yīng)生成三磷酸 腺苷(ATP)與硫酸鹽的酶，在生物體硫代謝中發(fā)揮重要作用。ATPS廣泛存在于植物、動(dòng)物及 微生物中，但它在各種生物體當(dāng)中的生物學(xué)作用略有不同。在植物和部分微生物中，是催化 硫酸鹽同化反應(yīng)第一步的關(guān)鍵酶。在ATPS的催化下，硫酸根離子與ATP反應(yīng)，產(chǎn)生腺嘌呤-5' -磷酸硫酸APS和焦磷酸鹽PPi。而在一些化學(xué)自養(yǎng)菌和化能無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)菌中，ATPS是催化硫 化氫氧化生成無(wú)機(jī)硫酸鹽最后一步的酶，其作用是催化APS和PPi反應(yīng)生成ATP和硫酸根離 子，即上述反應(yīng)的逆反應(yīng)。ATPS已經(jīng)從產(chǎn)黃青霉菌、鼠肝、卷心菜等生物體中提取并純化得 到，而且編碼ATPS的基因也已經(jīng)從原核生物、真核生物、動(dòng)物和植物中克隆出來(lái)并在適當(dāng)?shù)?宿主中得到表達(dá)。不同來(lái)源的ATPS結(jié)構(gòu)不同，大腸桿菌來(lái)源的ATPS是異源二聚體且需要GTP 激活，酵母、真菌以及植物來(lái)源的ATPS是單體或是同源寡聚體。在分子生物學(xué)方面，目前已 通過氨基酸修飾等手段研究其結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，加深了對(duì)ATPS作用機(jī)制的了解。偶連ATP 硫酸化酶可以應(yīng)用于很多方面，如:PPi定量、RNA測(cè)定、DNA測(cè)序、DNA聚合酶酶活測(cè)定等，其 中ATPS在焦磷酸測(cè)序技術(shù)發(fā)揮重要作用。
[0003] 焦磷酸測(cè)序技術(shù)(Pyrosequencing)是利用DNA聚合酶(polymerase )、ATPS、焚光素 酶（lucif erase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(apyrase)四種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián) 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行DNA測(cè)序的技術(shù)，其實(shí)質(zhì)是利用生物發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行序列測(cè)定的技術(shù)。焦磷 酸測(cè)序技術(shù)的反應(yīng)體系由反應(yīng)底物、待測(cè)單鏈、測(cè)序引物和上述4種酶構(gòu)成，反應(yīng)底物為5'-腺苷酰硫酸(adenosine-5'-phosphosulfat，APS)和焚光素（luciferin)。在每一輪測(cè)序反 應(yīng)中，只加入四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)中的一種，若該dNTP能夠與DNA模板的下一個(gè)堿 基配對(duì)，則會(huì)在DNA聚合酶的催化下，將其摻入到測(cè)序引物鏈的3'末端，同時(shí)釋放出一分子 的PPi;在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結(jié)合形成等量的ATP;生成的ATP在熒 光素酶的催化下，可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見光，通過微弱光檢測(cè)裝 置及處理軟件可獲得一個(gè)特異的檢測(cè)峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。如果加 入的dNTP不能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對(duì)，則上述反應(yīng)不會(huì)發(fā)生，也就沒有檢測(cè)峰。反應(yīng) 體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。待上一輪反應(yīng)完成后， 加入另一種dNTP，使上述反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息。 [0004]近年來(lái)出現(xiàn)了一種高通量光導(dǎo)纖維皮升級(jí)微反應(yīng)池陣列焦測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)一次 可以測(cè)定上百萬(wàn)個(gè)樣品，其出現(xiàn)帶來(lái)了測(cè)序技術(shù)的革命，這極大地推動(dòng)了后基因組計(jì)劃的 發(fā)展。這種高通量焦磷酸測(cè)序技術(shù)需要對(duì)ATPS進(jìn)行生物素化修飾，使之便于固定在微球表 面。眾所周知，酶活會(huì)直接關(guān)系到測(cè)序反應(yīng)的準(zhǔn)確度，而酶儲(chǔ)存試劑的優(yōu)劣又直接影響到酶 活。ATPS作為一種生物活性蛋白，在儲(chǔ)存、運(yùn)輸和銷售過程中易失活，目前常用的酶儲(chǔ)存試 劑并不能有效保護(hù)生物素化ATPS的酶活，也沒有一種專門針對(duì)生物素化ATPS的儲(chǔ)存試劑。 因此，開發(fā)一種專門針對(duì)生物素化ATPS的儲(chǔ)存試劑，保證其在儲(chǔ)存、運(yùn)輸和銷售過程中的穩(wěn) 定性，是該酶工業(yè)化生產(chǎn)的應(yīng)用基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技 術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0006] 本發(fā)明中涉及的英文符號(hào)：
[0007] Tris-HCl指利用三羥甲基氨基甲烷(Tris)和鹽酸配制的緩沖液;EDTA指乙二胺四 乙酸;DTT指二硫蘇糖醇;Tris-Ac指利用三羥甲基氨基甲烷和醋酸配制的緩沖液;BSA指牛 血清白蛋白；PVP指聚乙烯吡咯烷酮。
[0008] 本發(fā)明要解決的一個(gè)問題是提供一種生物素化ATPS的儲(chǔ)存試劑，該儲(chǔ)存試劑包括 以下組分:Tris-HCl、氯化鈉、EDTA和DTT，溶劑為去離子水。
[0009] 上述儲(chǔ)存試劑中，Tris-HCl的濃度為25~50mM;優(yōu)選為30~40mM;進(jìn)一步優(yōu)選為32 ~36mM〇
[0010] 上述儲(chǔ)存試劑中，Tris-HCl的pH值為7.0~8.0;優(yōu)選為7.2~7.8;進(jìn)一步優(yōu)選為 7.4~7.6〇
[0011] 上述儲(chǔ)存試劑中，氯化鈉的濃度為10~35mM;優(yōu)選為10~30mM;進(jìn)一步優(yōu)選為15~ 25mM〇
[0012] 上述儲(chǔ)存試劑中，EDTA的濃度為0.02~0.08mM;優(yōu)選為0.03~0.07mM;進(jìn)一步優(yōu)選 為0.04~0.07mM。
[0013] 上述儲(chǔ)存試劑中，DTT的濃度為0.02~0.08mM;優(yōu)選為0.04~0.07mM;進(jìn)一步優(yōu)選 為0·04~0·06mM。
[0014] 在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的生物素化ATPS的儲(chǔ)存試劑中還包括:蔗糖、山梨 醇和硫代硫酸鈉中的一種或多種。
[0015] 所述的蔗糖的濃度為30~lOOrnM;優(yōu)選為40~90mM;進(jìn)一步優(yōu)選為50~80mM;再一 步優(yōu)選為60~70mM。
[0016] 所述的山梨醇的濃度為10~20mM;優(yōu)選為12~18mM;進(jìn)一步優(yōu)選為14~16mM。
[0017] 所述的硫代硫酸鈉的濃度為〇 · 4~0 · 8mM;優(yōu)選為0 · 4~0 · 7mM;進(jìn)一步優(yōu)選為0 · 5~ 0.6mM〇
[0018] 本發(fā)明要解決的另一個(gè)問題是提供上述生物素化ATPS的儲(chǔ)存試劑的使用方法:使 用時(shí)，先將生物素化ATPS與甘油按照1: 2的體積比混勻，得到生物素化ATPS的甘油溶液;再 將該生物素化ATPS的甘油溶液與本發(fā)明所述的ATPS儲(chǔ)存試劑按照3:1的體積比混合均勻。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：
[0020] 本發(fā)明提供的生物素化ATPS儲(chǔ)存試劑，對(duì)生物素化ATPS的活性有保護(hù)作用，是的 生物素化ATPS在-80°C、_20°C和4°C下放置1個(gè)月，活性幾乎不變;在_80°C、_20°C和4°C下放 置3個(gè)月，分別能夠維持>99%、>97%以及>92%的殘余活力；在-80°(3、-20°(3和4°(3下放置6 個(gè)月，分別能夠維持>97%、>93%以及>90%的殘余活力；在25°(3、30°(3和35°(3下放置1211，能 夠維持>97 %的殘余活力;在25°C、30°C和35°C下放置24h，能夠維持>95 %的殘余活力；在25 °C、30°C和35°C下放置48h，能夠維持>93 %的殘余活力。本發(fā)明提供的生物素化ATPS儲(chǔ)存試 劑在以上各個(gè)儲(chǔ)存條件下對(duì)ATPS的活性保護(hù)均優(yōu)于常規(guī)50%甘油的儲(chǔ)存條件。
[0021] 加入本發(fā)明提供的儲(chǔ)存試劑后，生物素化ATPS在凍融1次和3次后，均能夠維持〉 93 %的殘余活力;在凍融5次后，均能夠維持>97 %的殘余活力;在凍融10次后，均能夠維持〉 94 %的殘余活力。而在50 %甘油中，生物素化ATPS在反復(fù)凍融10次后，僅剩13.1 %的殘余活 力;不加任何試劑的生物素化ATPS在反復(fù)凍融10次后，僅剩5.8 %的殘余活力。
[0022] 綜上所述，本發(fā)明提供的儲(chǔ)存試劑能夠延長(zhǎng)生物素化ATPS的儲(chǔ)存時(shí)間，減少反復(fù) 凍融對(duì)其活性的影響；并且使得生物素化ATPS可以長(zhǎng)期存放于-80°C、_20°C和4°C下，增加 了其儲(chǔ)存溫度的選擇性;還能夠有效降低ATPS上生物素標(biāo)簽的脫落率。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 如無(wú)特殊說明，本發(fā)明涉及的化學(xué)或生物試劑均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；生物發(fā) 光檢測(cè)儀購(gòu)自Promega公司，型號(hào)為GloMax20/20。
[0024] 實(shí)施例1 一種生物素化ATPS的儲(chǔ)存試劑
[0025] 包括以下組分：Tris-HCl 25mM ρΗ7·0、氯化鈉 10mM、EDTA0.02mM和DTT0.02mM，溶 劑為去離子水。
[0026] 實(shí)施例2-種生物素化ATPS的儲(chǔ)存試劑
[0027] 包括以下組分：Tris-HCl 30mM ρΗ7·2、氯化鈉 15mM、EDTA0.03mM和DTT0.03mM，溶 劑為去離子水。
[0028]實(shí)施例3-種生物素化ATPS的儲(chǔ)存試劑
[0029] 包括以下組分：Tris-HCl 35mM ρΗ7·4、氯化鈉20mM、EDTA0.04mM和DTT0.04mM，溶 劑為去離子水。
[0030] 實(shí)施例4 一種生物素化ATPS的儲(chǔ)存試劑
[0031 ]包括以下組分：Tris-HCl 40mM ρΗ7·6、氯化鈉25mM、EDTA0.05mM和DTT0.06mM，溶 劑為去離子水。
[0032]實(shí)施例5-種生物素化ATPS的儲(chǔ)存試劑
[0033]包括以下組分:Tris-HC145mM ρΗ7·8、氯化鈉30mM、EDTA0.06mM和DTT0.06mM，溶劑 為去離子水。
[0034]實(shí)施例6-種生物素化ATPS的儲(chǔ)存試劑
[0035] 包括以下組分：Tris-HC150mM pH7.8、氯化鈉35mM、EDTA0.07mM和DTT0.07mM，溶劑 為去離子水。
[0036] 實(shí)施例7-種生物素化ATPS的儲(chǔ)存試劑
[0037] 包括以下組分：Tris-HC150mM pH8·0、氯化鈉35mM、EDTA0·08mM和DTTO.08mM，溶劑 為去離子水。
[0038] 實(shí)施例8-種生物素化ATPS的儲(chǔ)存試劑