一種硝基呋喃類藥物代謝物的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種硝基呋喃類藥物代謝物的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒由膠體金檢測(cè)卡(含酶標(biāo)孔)和前處理試劑組裝而成，所述的檢測(cè)卡在現(xiàn)有的免疫競(jìng)爭(zhēng)法膠體金卡基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，將硝基呋喃類藥物單克隆抗體膠體金標(biāo)記物直接凍干在酶標(biāo)孔中，提高了靈敏度、穩(wěn)定性和適用范圍；該試劑盒可用于硝基呋喃類藥物例如呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃妥因代謝物或呋喃西林代謝物的快速檢測(cè)，適用于魚、蝦等水產(chǎn)品，雞肉、豬肉等畜禽產(chǎn)品。本發(fā)明簡(jiǎn)化了樣本前處理方法，省去了傳統(tǒng)方法中萃取和復(fù)溶的步驟，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，并可根據(jù)不同需求同時(shí)檢測(cè)一種或多種藥物。
【專利說明】一種硝基呋喃類藥物代謝物的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種藥物代謝物的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，尤其涉及一種硝基呋喃類藥物代謝物的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]硝基呋喃類藥物是一種常見的合成抗生素，因其極好的抗菌性和藥物動(dòng)力學(xué)特性，常被用于動(dòng)物飼養(yǎng)、流通等環(huán)節(jié)。這類物質(zhì)也常被當(dāng)作催長(zhǎng)劑或肥育劑用于豬、家禽和魚類的飼養(yǎng)中。長(zhǎng)期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，硝基呋喃類藥物及其代謝產(chǎn)物均具有致癌性和致誘變性。因此，硝基呋喃類物質(zhì)被禁止在食用性飼養(yǎng)動(dòng)物上使用。自1993年起，歐盟范圍內(nèi)便禁止在動(dòng)物飼養(yǎng)中使用硝基呋喃類藥物鹽酸呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林，而呋喃唑酮也從1995年起被禁用。
[0003]對(duì)硝基呋喃類藥物的檢測(cè)須建立在對(duì)其系列代謝產(chǎn)物的檢測(cè)的基礎(chǔ)之上。在施用了硝基呋喃類藥物短時(shí)間后便很難檢測(cè)到其原藥的存在，因?yàn)樗芸斓乇淮x掉了。而其系列代謝產(chǎn)物則在用藥后的很長(zhǎng)時(shí)間都能被發(fā)現(xiàn)和被檢測(cè)到。所以，這些代謝物被作為濫用硝基呋喃類藥物的檢測(cè)目標(biāo)物。在攝入了呋喃唑酮(代謝物為AOZ:3_氨基-2-唑烷基酮)，鹽酸呋喃它酮(代謝物為AMOZ:5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮)，呋喃妥因(代謝物為AHD:1_氨基-2-內(nèi)酰脲)和呋喃西林(代謝物為SEM:氨基脲)后均可檢出其硝基呋喃類系列代謝物。
[0004]目前硝基呋喃類藥物代謝物的測(cè)定方法主要有液相色譜/紫外(LC/UV)分析和液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，但這些方法所需儀器價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)過程繁瑣，不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。目前，在藥物殘留快速檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用的有微生物法和酶聯(lián)免疫法，但是，微生物方法在靈敏度上常常達(dá)不到要求，酶聯(lián)免疫法對(duì)于操作人員技術(shù)要求較高。
[0005]因此，尋找一種具有靈敏度高、穩(wěn)定性好和適用范圍廣的檢測(cè)方法是目前硝基呋喃類藥物代謝物檢測(cè)中亟待解決的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種藥物代謝物的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，特別是一種硝基呋喃類藥物代謝物的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
[0007]為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0008]第一方面，本發(fā)明提供了一種硝基呋喃類藥物代謝物的檢測(cè)試劑盒，包括檢測(cè)卡和試劑，所述檢測(cè)卡的酶標(biāo)孔中含有凍干的硝基呋喃類藥物代謝物的單克隆抗體膠體金標(biāo)記物。
[0009]本發(fā)明是在現(xiàn)有的免疫競(jìng)爭(zhēng)法膠體金卡基礎(chǔ)上進(jìn)行的改進(jìn)，將硝基呋喃類藥物單克隆抗體膠體金標(biāo)記物直接凍干在酶標(biāo)孔中，提高了靈敏度、穩(wěn)定性和適用范圍。
[0010]本發(fā)明中，所述的硝基呋喃類藥物代謝物為呋喃唑酮代謝物(AOZ)、呋喃它酮代謝物(AMOZ)、呋喃妥因代謝物(AHD)或呋喃西林代謝物(SEM)中的任意一種或至少兩種的混合物。
[0011]本發(fā)明中，所述試劑包括IM鹽酸、衍生化試劑、提取劑和IM氫氧化鈉。
[0012]本發(fā)明中，所述檢測(cè)卡為膠體金試紙條。
[0013]第二方面，本發(fā)明還提供了一種硝基呋喃類藥物代謝物的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0014](I)前處理待測(cè)樣品；
[0015](2)用本發(fā)明第一方面所述的試劑盒檢測(cè)樣品；
[0016](3)分析檢測(cè)結(jié)果。
[0017]本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)化了樣本前處理方法，省去了傳統(tǒng)方法中的萃取和復(fù)溶步驟，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，并可根據(jù)不同需求同時(shí)檢測(cè)一種或多種藥物。該方法靈活性高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、特異性高、準(zhǔn)確性好、能夠進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)大量篩查。
[0018]作為優(yōu)選的具體實(shí)施方案，本發(fā)明中硝基呋喃類藥物代謝物的檢測(cè)方法具體包括以下步驟:
[0019](I)取一定的動(dòng)物組織去除脂肪后，用剪刀剪碎或者用絞肉機(jī)攪碎；
[0020](2)取l_3g待測(cè)樣品于50mL離心管中，依次加入3_5mL去離子水，0.3-0.6mL IM鹽酸，0.1-0.3mL衍生化試劑，震蕩混勻3-5min，55-60°C水浴條件下孵育30min ；
[0021](3)取出后，依次加入3-6mL提取劑，0.3-0.5mL IM氫氧化鈉，震蕩混勻l_3min ；4000轉(zhuǎn)離心2-10min，取上層清液待測(cè)；
[0022](4)吸取50_150μ L待測(cè)液于酶標(biāo)孔中，反復(fù)吹打至孔內(nèi)紅色物質(zhì)完全溶解，等待反應(yīng)2-6min,吸取孔內(nèi)所有溶液滴加到檢測(cè)卡的加樣孔中，加樣后開始計(jì)時(shí),反應(yīng)5_8min
判讀結(jié)果。
[0023]作為進(jìn)一步優(yōu)選的具體實(shí)施方案，本發(fā)明中硝基呋喃類藥物代謝物的檢測(cè)方法具體包括以下步驟:
[0024](I)取一定的組織(魚、蝦、蟹、雞肉、豬肉等)去除脂肪后，用剪刀剪碎或者用絞肉機(jī)攪碎，若不及時(shí)檢測(cè)，分裝保存于_20°C ；
[0025](2)取2g待測(cè)樣品于50mL離心管中，依次加入4mL去離子水，0.4mL IM鹽酸，0.2mL衍生化試劑，震蕩混勻3min，60°C水浴條件下孵育30min ；
[0026](3)取出后，依次加入5mL提取劑，0.4mL IM氫氧化鈉，震蕩混勻Imin ；4000轉(zhuǎn)離心5min，取上層清液待測(cè)；
[0027](4)吸取100 μ L待測(cè)液于酶標(biāo)孔中，反復(fù)吹打至孔內(nèi)紅色物質(zhì)完全溶解，等待反應(yīng)5min,吸取孔內(nèi)所有溶液滴加到檢測(cè)卡的加樣孔中,加樣后開始計(jì)時(shí),反應(yīng)5_8min判讀結(jié)果，其他時(shí)間判讀無效。
[0028]本發(fā)明的檢測(cè)方法中，所述的硝基呋喃類藥物代謝物為呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃妥因代謝物或呋喃西林代謝物中的任意一種或至少兩種的混合物。
[0029]本發(fā)明的試劑盒及檢測(cè)方法可廣泛適用于魚、蝦等水產(chǎn)品和雞肉、豬肉等畜禽產(chǎn)品O
[0030]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果:
[0031](I)本發(fā)明的試劑盒靈敏度高，穩(wěn)定性強(qiáng)和適用范圍廣，該試劑盒可用于硝基呋喃類藥物例如呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃妥因代謝物或呋喃西林代謝物的快速檢測(cè)，適用于魚、蝦等水產(chǎn)品，雞肉、豬肉等畜禽產(chǎn)品；利用該試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，對(duì)于所有樣品，靈敏度均可達(dá)Ippb ；
[0032](2)本發(fā)明的試劑盒操作簡(jiǎn)單，讀取結(jié)果時(shí)間短，該試劑盒無需另配其它試劑，樣品無需無菌處理，按試劑盒說明在5-8min內(nèi)即可判定檢測(cè)結(jié)果；
[0033](3)本發(fā)明簡(jiǎn)化了樣本前處理方法，省去了傳統(tǒng)方法中萃取和復(fù)溶的步驟，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，并可根據(jù)不同需求同時(shí)檢測(cè)一種或多種藥物；
[0034](4)本發(fā)明的試劑盒可批量檢測(cè)，一步到位，成本低廉，投資少，見效快。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1檢測(cè)樣品的結(jié)果判定示意組合圖；
[0036]其中，圖1a表示檢測(cè)結(jié)果為陰性，圖1b表示檢測(cè)結(jié)果為陽性，圖1c表示檢測(cè)結(jié)果失效。

【具體實(shí)施方式】
[0037]下面通過【具體實(shí)施方式】來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的具體限制。
[0038]實(shí)施例1:檢測(cè)卡的制備
[0039]1.抗原制備
[0040]稱取40mg呋喃唑酮代謝物(AOZ)溶于16mL無水乙醇，18mg HS酶溶于2mL甲苯，常溫下磁力攪拌2h，SOOOrpm,離心15min，棄除上清，殘留物用無水乙醇洗三次，烘干，得呋喃唑酮代謝物衍生物；用2mL水將衍生物溶解，加入活化劑1EDC.HAOZ 114mg，活化劑2NHS34mg，室溫活化2h，即得呋喃唑酮代謝物活潑酯。按照η (呋喃唑酮代謝物活潑酯產(chǎn)物):m(牛血清白蛋白)=60: 1，合成檢測(cè)抗原呋喃唑酮代謝物-牛血清白蛋白，用0.0IM PBS緩沖液透析3天，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定偶聯(lián)比率；制備好的檢測(cè)抗原，冷凍干燥后，于_20°C保存。
[0041]2.抗原噴膜
[0042]用純水把偶聯(lián)抗原稀釋至lmg/mL, 二抗稀釋至lmg/mL, 2h內(nèi)用完。噴膜選用參數(shù)為0.74μ L/cm，氣壓為8psi，噴完后于37°C烘箱中干燥過夜，用塑料薄膜包好，放入干燥器中待用。
[0043]3.單克隆抗體的制備
[0044]從液氮罐中取出呋喃唑酮代謝物1G10-H5-C7細(xì)胞株進(jìn)行復(fù)蘇，將呋喃唑酮代謝物1G10-H5-C7細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集后用RPMI 1640將其重懸，腹腔注射入BALB/C小鼠體內(nèi)(該小鼠已于一周前腹腔注射液體石蠟，0.5mL/只)，劑量為100萬細(xì)胞/0.5mL/只小鼠，各5只。7-10天后小鼠腹腔脹大，收集其腹水。37°C，靜置30min。4°C，5000r/min離心15min，取中央透明層進(jìn)行腹水純化。純化后腹水濃度測(cè)定:用紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。將得到的抗體加入等體積甘油后，分別貼上標(biāo)簽，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0045]4.膠體金的制備
[0046]取1980mL超純水，置于干凈的5L玻璃反應(yīng)器中，加入20mL I % HAuCL4溶液(終濃度0.0l % )?；靹?，搭好回流裝置。100°c水浴加熱至HAuCL4溶液沸騰(轉(zhuǎn)速160RPM，約60min)，調(diào)整轉(zhuǎn)速至270rpm后，加入17.6mL 1%檸檬酸三鈉溶液。當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯募t色時(shí)(約2min)，調(diào)整轉(zhuǎn)速至160rpm，溫度調(diào)節(jié)至80°C，繼續(xù)回流約30min后停止加熱。放入冰箱，冷藏保存，二周內(nèi)用完。采用紫外可見光分光光度計(jì)和電鏡檢測(cè)膠體金粒徑大小，以監(jiān)控膠體金的質(zhì)量。
[0047]5.金標(biāo)抗體的制備
[0048]調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值至8.2，用恒速攪拌器均勻攪拌，同時(shí)按正交分析結(jié)果逐滴加入相應(yīng)的單克隆抗體量，并加入其它保護(hù)劑，全部加完后，繼續(xù)攪拌15分鐘。加入10%BSA進(jìn)行封閉，1000r/min離心半小時(shí)除去雜質(zhì),6000r/min離心半小時(shí)獲得均一'I"生金標(biāo)抗體沉淀。再加入重懸液重懸,混勻后移至干凈燒杯中備用。在50 μ L的金標(biāo)抗體中加入PNPB溶液200 μ L，以超純水為空白對(duì)照，掃描400-700nm之間的吸收值并精確測(cè)定OD值。
[0049]6.噴金操作
[0050]室內(nèi)相對(duì)濕度為低于40%，氣壓為8psi，將金標(biāo)抗體加入酶標(biāo)孔中，37°C烘箱中干燥1.5個(gè)小時(shí)，用塑料薄膜包好，放入干燥器中待用。
[0051]7.訂購(gòu)NC膜、樣品墊、吸水紙等材料及相關(guān)試劑，并進(jìn)行切割和干燥。
[0052]8.檢測(cè)卡的組裝小試
[0053]按膠體金免疫層析快速檢測(cè)卡結(jié)構(gòu)圖組裝為卡,進(jìn)行小試試驗(yàn)。小試試驗(yàn)的卡主要檢測(cè)陰性顯色強(qiáng)度，I μ g/L AOZ是否完全抑制。如有問題，需進(jìn)一步調(diào)試至獲得滿意小試(主要調(diào)金標(biāo)抗體量)結(jié)果后，再規(guī)模生產(chǎn)。
[0054]9.放大生產(chǎn)
[0055]按照既定條件生產(chǎn)，在相對(duì)濕度25% -35%，溫度20_25°C的條件下，進(jìn)行裝卡封袋工序，并按一定的比例進(jìn)行抽檢。
[0056]10.包裝
[0057]試劑盒組分:檢測(cè)卡(含酶標(biāo)孔)、1M鹽酸、衍生化試劑、提取劑、IM氫氧化鈉、一次性吸管。
[0058]實(shí)施例2:試劑盒的應(yīng)用
[0059]本發(fā)明的試劑盒可用于魚、蝦等水產(chǎn)品、雞肉、豬肉等畜禽產(chǎn)品中四種藥物的檢測(cè)。以魚肉中呋喃唑酮代謝物的檢測(cè)為例，具體操作如下:
[0060]取草魚背部樣本于絞肉機(jī)中絞碎，取2g樣品于50mL離心管中，依次加入4mL去離子水，0.4mL IM鹽酸，0.2mL衍生化試劑，振蕩混勻3min，60°C下水浴孵育半小時(shí)；取出后，依次加入5mL提取劑,0.4mL IM氫氧化鈉，I瓶萃取劑,振蕩混勻Imin, 4000轉(zhuǎn)離心5min,取上層清液待測(cè)，吸取100 μ L待測(cè)液于酶標(biāo)孔中，反復(fù)吹打至孔內(nèi)紅色物質(zhì)完全溶解，等待反應(yīng)5min，吸取孔內(nèi)所有溶液滴加到呋喃唑酮代謝物檢測(cè)卡的加樣孔中，加樣后開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)5min后判讀結(jié)果，結(jié)果檢測(cè)線(T線)比質(zhì)控線(C線)深，為陰性結(jié)果。
[0061]通過上述實(shí)施例可以看出，本發(fā)明的試劑盒操作簡(jiǎn)單，讀取結(jié)果時(shí)間短，該試劑盒無需另配其它試劑，樣品無需無菌處理，按試劑盒說明在5-8min內(nèi)即可判定檢測(cè)結(jié)果?’另夕卜，本發(fā)明簡(jiǎn)化了樣本前處理方法，省去了傳統(tǒng)方法中萃取和復(fù)溶的步驟，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，并可根據(jù)不同需求同時(shí)檢測(cè)一種或多種藥物，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0062] 申請(qǐng)人:聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的工藝方法，但本發(fā)明并不局限于上述工藝步驟，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述工藝步驟才能實(shí)施。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種硝基呋喃類藥物代謝物的檢測(cè)試劑盒，包括檢測(cè)卡和試劑，其特征在于，所述檢測(cè)卡的酶標(biāo)孔中含有凍干的硝基呋喃類藥物代謝物的單克隆抗體膠體金標(biāo)記物。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的硝基呋喃類藥物代謝物為呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃妥因代謝物或呋喃西林代謝物中的任意一種或至少兩種的混合物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑包括IM鹽酸、衍生化試劑、提取劑和IM氫氧化鈉。
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)卡為膠體金試紙條。
5.一種硝基呋喃類藥物代謝物的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)前處理待測(cè)樣品； (2)用權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的試劑盒檢測(cè)樣品； (3)分析檢測(cè)結(jié)果。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，具體包括以下步驟: (1)取一定的動(dòng)物組織去除脂肪后，用剪刀剪碎或者用絞肉機(jī)攪碎； (2)取l-3g待測(cè)樣品于50mL離心管中，依次加入3-5mL去離子水，0.3-0.6mLIM鹽酸，0.1-0.3mL衍生化試劑，震蕩混勻3-5min，55-60°C水浴條件下孵育30min ； (3)取出后，依次加入3-6mL提取劑，0.3-0.5mL IM氫氧化鈉，震蕩混勻l_3min ；4000轉(zhuǎn)離心2-10min，取上層清液待測(cè)； (4)吸取50-150μL待測(cè)液于酶標(biāo)孔中，反復(fù)吹打至孔內(nèi)紅色物質(zhì)完全溶解，等待反應(yīng)2-6min，吸取孔內(nèi)所有溶液滴加到檢測(cè)卡的加樣孔中，加樣后開始計(jì)時(shí),反應(yīng)5_8min判讀結(jié)果。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述的硝基呋喃類藥物代謝物為呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃妥因代謝物或呋喃西林代謝物中的任意一種或至少兩種的混合物。
【文檔編號(hào)】G01N33/531GK104374910SQ201410660354
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】徐波, 周麗, 李艷, 張勇攀, 梁如中, 卞禹卜 申請(qǐng)人:無錫中德伯爾生物技術(shù)有限公司