一種保持細(xì)胞應(yīng)力平衡的固定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種保持細(xì)胞應(yīng)力平衡的固定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞是生命體結(jié)構(gòu)和生命活動的基本單元。對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分與生化作用的研究，是揭示生命體生理與病理過程的重要途徑。然而，不同類型的活體細(xì)胞在離體或脫離其生活環(huán)境數(shù)分鐘至數(shù)小時后，會出現(xiàn)自溶性的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)破與化學(xué)成分降解。再者，活體細(xì)胞膜是一種具有流動性的、由蛋白質(zhì)鑲嵌的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)胞器，包括為細(xì)胞的應(yīng)力結(jié)構(gòu)與形態(tài)保持發(fā)揮著重要作用的細(xì)胞骨架，也處于類凝膠狀的半流動相胞漿中。上述細(xì)胞的行為與結(jié)構(gòu)特點為細(xì)胞的分析研究造成困難。為此，科學(xué)家建立了針對細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)分析與化學(xué)成分功能定位研究的細(xì)胞狀態(tài)固化保持方法，即細(xì)胞固定(fixat1n)。它能夠?qū)⒓?xì)胞生理或病理狀態(tài)予以保持并使組織硬化，便于分析樣品的制作，例如病理切片等。
[0003]目前，科學(xué)家為了達到不同的實驗?zāi)康模捎昧瞬煌墓潭▌┖凸潭ǚ椒ǎ缬糜谥谱鞑±砬衅母栺R林固定、用于電鏡分析的戊二醛或鋨酸固定、用于細(xì)胞核檢測的醋酸固定、用于免疫組織化學(xué)/免疫細(xì)胞化學(xué)分析的甲醇或多聚甲醛固定、用于DNA分析的乙醇固定、以及用于染色體分析的Carnoy液(甲醇和冰醋酸)固定等等。但沒有一種適用于各種實驗的通用固定方法。對于傳統(tǒng)的細(xì)胞固定方法，無論采用何種固定劑與何種步驟，其理想結(jié)果是使細(xì)胞得到完全徹底的固定。為得到此結(jié)果，固定通常需要較長時間(數(shù)十分鐘至數(shù)小時)。而本發(fā)明所涉及的是一種區(qū)別于傳統(tǒng)概念的細(xì)胞固定技術(shù)方法。其目的是，選用適合的固定劑和優(yōu)化的固定時間(僅數(shù)秒)，使細(xì)胞在保持其既有應(yīng)力結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞內(nèi)待檢蛋白非變性的狀態(tài)下，經(jīng)受細(xì)胞原位電泳過程，而不發(fā)生破碎。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是為了提供一種保持細(xì)胞應(yīng)力平衡的固定方法。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0006]一種保持細(xì)胞應(yīng)力平衡的固定方法，具體包括以下步驟:
[0007](I)取需要固定處理的分離細(xì)胞，加入磷酸鹽緩沖液離心漂洗；
[0008](2)將棄上清的細(xì)胞團加入磷酸鹽緩沖液，混勻后將細(xì)胞懸液涂布于培養(yǎng)皿底部;
[0009](3)將培養(yǎng)皿置于(TC，用254nm UV燈以1.84W/cm2強度照射，總劑量165.6J/cm2 ；
[0010](4)將經(jīng)過步驟3)處理后的細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液沖洗收集于離心管中；
[0011](5)收集的細(xì)胞經(jīng)260g離心3_8(優(yōu)選5)分鐘，棄上清后，加入4%的多聚甲醛固定1-6 (優(yōu)選3)秒鐘后加入PBS終止固定。
[0012]本發(fā)明所用到的PBS的pH都為7.4。
[0013]本發(fā)明的有益效果:
[0014]在固定前先將分散的細(xì)胞懸液放于將培養(yǎng)皿置于(TC，用254nm UV燈以1.84ff/cm2強度照射，總劑量165.6J/cm2，加強了細(xì)胞核以及細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中蛋白質(zhì)原有的狀態(tài)。
[0015]收集的細(xì)胞經(jīng)離心后，加入4%的多聚甲醛固定1_6(優(yōu)選3)秒鐘，本方法中利用4%的多聚甲醛固定時間僅在1-6秒的時間，在保證細(xì)胞固定效果的同時，保持了細(xì)胞的應(yīng)力平衡，使后期的實驗結(jié)果更加的準(zhǔn)確明顯。
[0016]固定在1-6秒保證了細(xì)胞在保持其既有應(yīng)力結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞內(nèi)待檢蛋白非變性的狀態(tài)下，經(jīng)受細(xì)胞原位電泳過程，而不發(fā)生破碎。若4%的多聚甲醛固定10秒以上，就使得細(xì)胞內(nèi)的所有蛋白都處于鉸鏈狀態(tài)。
【附圖說明】
[0017]圖1為細(xì)胞原位電泳裝置主視圖，其中1.電泳緩沖液池，2.濾膜，3.側(cè)連接通道，
4.細(xì)胞電泳槽；
[0018]圖2為正常人胚肺成纖維細(xì)胞核大小影響SSB結(jié)合狀態(tài)的檢測圖，其中2a顯示RPA32、RPA70和POTl檢測結(jié)果；2b和2c分別為HFLF在貼壁與胰蛋白酶消化懸浮狀態(tài)的細(xì)胞核熒光染色圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0020]實施例1
[0021]胰蛋白酶消化對培養(yǎng)的正常人胚肺成纖維細(xì)胞(HFLF) SSBs (檢測3種，分別為:RPA32、RPA70和P0T1)結(jié)合狀態(tài)影響的檢測:
[0022](I)用0.25%的胰蛋白酶消化法獲取指數(shù)生長期的正常人胚肺成纖維細(xì)胞細(xì)胞濃度為2 X 17的HFLF。
[0023](2)細(xì)胞經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)離心漂洗一次，將棄上清的細(xì)胞團加入200 μ IPBS后，滴加于3.5cm培養(yǎng)皿底部，用移液器吸頭將培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞懸液均勻地攤布于整個培養(yǎng)皿底部。
[0024](3)將培養(yǎng)皿置于冰上，用254nm UV燈以1.84W/cm2強度照射，總劑量165.6J/cm2。
[0025](4)分別用20ml PBS將培養(yǎng)皿中被照射的細(xì)胞沖洗收集于一個50ml的離心管中。
[0026](5)收集的細(xì)胞經(jīng)260g離心5分鐘，棄上清后，加入4%的多聚甲醛200 μ I預(yù)固定3秒鐘，加入46ml PBS終止固定。
[0027]實施例2
[0028](I)用0.25%的胰蛋白酶消化法獲取指數(shù)生長期的小鼠胚胎干細(xì)胞，細(xì)胞濃度為2X107。
[0029](2)細(xì)胞經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)離心漂洗一次，將棄上清的細(xì)胞團加入200 μ IPBS后，滴加于3.5cm培養(yǎng)皿底部，用移液器吸頭將培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞懸液均勻地攤布于整個培養(yǎng)皿底部。
[0030](3)將培養(yǎng)皿置于冰上，用254nm UV燈以1.84W/cm2強度照射，總劑量165.6J/cm2。
[0031](4)分別用20ml PBS將培養(yǎng)皿中被照射的細(xì)胞沖洗收集于一個50ml的離心管中。
[0032](5)收集的細(xì)胞經(jīng)260g離心3分鐘，棄上清后，加入4%的多聚甲醛200 μ I預(yù)固定I秒鐘，加入46ml PBS終止固定。
[0033]實施例3
[0034](I)用0.25%的胰蛋白酶消化法獲取指數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞濃度為2X107。
[0035](2)細(xì)胞經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)離心漂洗一次，將棄上清的細(xì)胞團加入200 μ IPBS后，滴加于3.5cm培養(yǎng)皿底部，用移液器吸頭將培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞懸液均勻地攤布于整個培養(yǎng)皿底部。
[0036](3)將培養(yǎng)皿置于冰上，用254nm UV燈以1.84W/cm2強度照射，總劑量165.6J/cm2。
[0037](4)分別用20ml PBS將培養(yǎng)皿中被照射的細(xì)胞沖洗收集于一個50ml的離心管中。
[0038](5)收集的細(xì)胞經(jīng)260g離心8分鐘，棄上清后，加入4%的多聚甲醛200 μ I預(yù)固定6秒鐘,加入46ml PBS終止固定。
[0039]細(xì)胞原位電泳(cell in situ electrophoresis, CISE),是將待檢細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，使其單個游離的細(xì)胞分散于等滲即應(yīng)力平衡的介質(zhì)中，在電場作用下，將細(xì)胞中的物質(zhì)從細(xì)胞中分離出來的一種電泳方式。
[0040]將實施例1固定后的細(xì)胞進行如下的試驗:
[0041](I)經(jīng)260g離心5分鐘棄上清后，加入0.2% Triton Χ-100200 μ I進行細(xì)胞打孔，時間10分鐘，之后加入46ml PBS，470g離心5分鐘，棄上清。
[0042](2)細(xì)胞團加入936 μ I CISE (cell in situ electroporesis)緩沖液(三輕甲基氨基甲燒 Tris:25mM ;甘氨酸 Glycine: 192mM ;葡萄糖 Glucose:43.2mM ；pH8.3)，并通過吹吸輕柔地將細(xì)胞分散懸浮。
[0043](3)取500 μ I細(xì)胞懸