查加斯病是由鞭毛蟲原生動物克氏錐蟲(trypanosomacruzi)引起的熱帶寄生蟲病。克氏錐蟲通常通過昆蟲載體(即錐獵蝽亞科(subfamilytriatominae)(獵蝽科(familyreduviidae)，德文：“raubwanzen”)的吸血“親吻蟲”)傳播給人類和其他哺乳動物。該疾病也可通過輸血和器官移植、攝入被寄生蟲污染的食物傳播以及從母親傳播到胎兒?？耸襄F蟲以不同形式和發(fā)育階段出現(xiàn)。繁殖形式被稱為短膜蟲期(epimastigote)，其恰好在接吻蟲已經(jīng)在包括人類的被感染的動物上吸血后適應。短膜蟲移動到該蟲的直腸細胞壁上。該蟲在隨后的吸血（其中該蟲排便）中經(jīng)由其糞便將病原體轉(zhuǎn)移至下一宿主。感染形式被稱為錐鞭毛體，并通過咬傷進入人體。因此，可以在人血中發(fā)現(xiàn)錐鞭毛體。發(fā)現(xiàn)的另一種形式(例如在心肌細胞的細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的另一種形式)稱為無鞭毛體或微鞭毛體(micromastigote)。在克氏錐蟲的生命周期期間，無鞭毛體變?yōu)殄F鞭毛體，其可以在下一次吸血中被親吻蟲吸入。查加斯病的癥狀在感染過程中有所不同。通常存在急性期，隨后是慢性期。感染后也可存在潛伏期。各期可以無癥狀或威脅生命。在早期、急性期，癥狀通常是輕度的，通常在感染部位僅僅產(chǎn)生局部腫脹。初始急性期對抗寄生蟲治療有反應，治愈率為60-90％。4-8周后，具有活動性感染的個體進入查加斯病的慢性期，其對于慢性感染個體的60-80％在其整個壽命中無癥狀。在慢性期期間，一些患者發(fā)生心臟并發(fā)癥，導致心臟擴大、心力衰竭、心率改變和猝死。導致進食或通便困難的腸道并發(fā)癥也是慢性期典型的?？辜纳x治療也似乎延緩或預防疾病慢性期期間的疾病癥狀的發(fā)展，但根據(jù)美國疾病控制與預防中心，發(fā)展這些并發(fā)癥中的一種或多種的平均壽命風險為約30％，這意味著這些慢性感染的個體仍將最終發(fā)展威脅生命的心臟和消化系統(tǒng)病癥。目前可用的查加斯病的抗寄生蟲治療是芐硝唑和硝呋莫司，其可以在許多患者中引起臨時副作用，包括皮膚病癥、腦毒性和消化系統(tǒng)刺激。查加斯病主要出現(xiàn)在墨西哥、中美洲和南美洲的貧困農(nóng)村地區(qū)；非常罕見地，該疾病在美國南部被發(fā)現(xiàn)。然而，通過這些國家的體外診斷方法，篩選獻血者被克氏錐蟲的感染。如今幾種血清學診斷方法可用來檢測克氏錐蟲的感染，例如，通過間接免疫熒光、間接血細胞凝集、補體固定、免疫印跡技術和elisa檢測針對克氏錐蟲的抗體。還應用分子生物學方法(例如pcr)和復雜的媒介生物診斷方法。在媒介生物診斷法中，使載體傳播的感染物，實驗室培育的、無病原體昆蟲(此處為：接吻蟲)從患者吸取血液。然后檢查昆蟲的腸內(nèi)容物中病原體(此處為：克氏錐蟲)的存在。這些方法中的每一種在靈敏度和特異性方面都顯示出其自身的弱點和優(yōu)勢，因此目前還沒有可用的金標準方法。在開始開發(fā)查加斯測定法用于檢測抗體中，應用了且仍正在使用天然抗原裂解物。然而，使用裂解物，在該抗原組合物中僅代表克氏錐蟲的三個發(fā)育階段之一，使得存在錯過其他兩個階段的感染的特定可能性。更現(xiàn)代的測定法應用代表克氏錐蟲感染的所有階段的重組抗原的混合物。當使用天然抗原裂解物時，診斷測定法經(jīng)常面臨在另一種寄生蟲利什曼原蟲感染的患者樣品中觀察到的特異性和交叉反應性中的問題。此外，由于克氏錐蟲的復雜抗原組成，抗原裂解物的產(chǎn)生導致相當大的批次間變化。此外，非常經(jīng)常地，基于天然裂解物的稀有試劑顯示弱靈敏度，因為一些裂解物完全不含或不含足夠的所有生命周期階段的抗原。通過應用重組抗原，可以規(guī)避或避免上述挑戰(zhàn)。然而，基于重組抗原組合物的用于檢測查加斯病的商購測定試劑盒在靈敏度和特異性方面顯示相當大的差異，使得客戶(即商業(yè)或臨床實驗室或血液篩選單元)通常必須并行使用幾個試劑盒以獲得可靠的結(jié)果。因此，關于患者樣品是否反應的決定基于通過幾種基于不同抗原組合物的試劑盒對相同樣品獲得的陽性或陰性結(jié)果的大部分。顯而易見的是，應用多種診斷測試的該耗時程序在經(jīng)濟上沒有意義，因為其導致實驗室設備和個人、時間、工作量和成本的增加。用于檢測針對克氏錐蟲抗原的抗體的血清學測定已經(jīng)在現(xiàn)有技術文獻中廣泛描述，對于綜述，參見例如silveira等人trendsinparasitology2001,vol.17no.6。已經(jīng)由幾個實驗室分離了與血清診斷相關的克氏錐蟲重組抗原。這些基因中的幾個具有串聯(lián)重復序列。由于克氏錐蟲表達的抗原蛋白數(shù)量極大(公共數(shù)據(jù)庫中近似23000個預測的蛋白編碼序列和假基因)，所以用于免疫測定的抗原的可能組合的數(shù)量非常巨大。盡管重組生產(chǎn)的方法已經(jīng)知道了幾十年，但仍然存在找出建立診斷測定法需要何種抗原的挑戰(zhàn)。選擇用于免疫診斷測定的合適抗原，必須記住考慮病原體的所有生命周期階段的抗原，并且還應用這樣的抗原，針對其的抗體可以在所有感染階段(急性、窗口和慢性期)發(fā)現(xiàn)。同時，因為技術考慮(例如缺乏溶解性和穩(wěn)定性，導致信號淬滅的不必要的交叉反應，避免與例如利什曼原蟲的交叉反應性)以及還有經(jīng)濟考慮(因為每種抗原此外需要大規(guī)模開發(fā)、評估和生產(chǎn))，抗原的數(shù)量不應超過約5或10。據(jù)silveria等人(同上)，商購的測定法通常使用六種或七種不同的克氏錐蟲抗原的組合，有時也與源自克氏錐蟲全長抗原的較短合成肽組合。提供高度靈敏的診斷測試的另一種方法基于多組分測定法，其應用大量已單獨包被在分開珠粒上的各種克氏錐蟲抗原。wo2009/017736和美國專利號8,329,411公開了用于檢測生物樣品中克氏錐蟲感染的裝置和方法。該設置包括16種不同的蛋白(選自最初的59種候選蛋白，其充當抗原)，其必須單獨包被在標記的珠粒上，提供陣列樣診斷工具?？贵w，如果存在于樣品中，則與這些包被的蛋白結(jié)合。因此，通過標記的二抗與樣品抗體的結(jié)合來檢測結(jié)合的抗體。盡管該程序?qū)τ谘芯糠椒ㄓ幸饬x，但導致大量生產(chǎn)成本的大量抗原太昂貴，不能用作商業(yè)或臨床實驗室中的常規(guī)測定法?？傊?，本領域中已知用于檢測來自感染個體的樣品中的克氏錐蟲抗體的免疫測定法應用大量不同的抗原來實現(xiàn)高靈敏度和特異性。仍然沒有真正的金標準和經(jīng)濟實惠的測定法可用。因此，在提供這樣的診斷組合物和方法時可以看到問題，所述診斷組合物和方法克服了用于檢測克氏錐蟲感染的現(xiàn)有技術測定法的重現(xiàn)性、靈敏度和特異性方面的缺點。該問題通過如權利要求中所指定的本發(fā)明來解決。發(fā)明概述本發(fā)明涉及適用于檢測分離的生物樣品中針對克氏錐蟲(trypanosomacruzi,t.cruzi)的抗體的多肽的組合物，其包含多肽1f8、jl7和至少一種選自cruzipain、kmp-11和par2的多肽。本發(fā)明的一個進一步方面是適用于檢測克氏錐蟲抗體的多肽的組合物，其中多肽1f8包含seqidno.1，多肽jl7包含seqidno.2，且至少一種選自cruzipain、kmp-11和par2的多肽包含至少一種選自seqidno.3(cruzipain)、seqidno.4(kmp-11)和seqidno.5(par2)的序列。具體而言，本發(fā)明聚焦于多肽的組合物，其由三種重組或合成產(chǎn)生的對克氏錐蟲特異性的多肽組成，其中所述多肽為1f8、jl7和cruzipain。所述組合物中的多肽是1f8(其包含seqidno.1)、多肽jl7(其包含seqidno.2)和cruzipain(其包含seqidno.3)。在另一個實施方案中，存在于所述多肽組合物中的三種克氏錐蟲特異性多肽1f8、j17和cruzipain分別由seqidno.1、2和3組成。另一個實施方案涉及生產(chǎn)適用于檢測分離的樣品中針對克氏錐蟲的抗體的上述多肽的可溶性和免疫反應性組合物的方法。所述多肽組合物在用于檢測克氏錐蟲特異性抗體的體外診斷測定中的用途也是本發(fā)明的一部分。此外，本發(fā)明涉及用于檢測分離的樣品中對克氏錐蟲特異性的抗體的方法(其中使用所述克氏錐蟲多肽的組合物)以及包含所述克氏錐蟲多肽的組合物的試劑盒。公開的氨基酸序列的說明：seqidno.1顯示了克氏錐蟲蛋白1f8(uniprot條目q4d1q2)，也稱為fcabp、tc24或tc28；完全描述性名稱：鞭毛鈣結(jié)合蛋白3。seqidno.1顯示氨基酸位置1-211。根據(jù)本發(fā)明，半胱氨酸殘基可被丙氨酸(a)或絲氨酸(s)替換，以避免由于分子內(nèi)二硫鍵的形成而導致的錯誤折疊。因此，半胱氨酸(c)自然出現(xiàn)的所有位置(在這種情況下為四個位置)都通過x標記；x=c、a或s。seqidno.2顯示了下述的部分序列：克氏錐蟲蛋白jl7(uniprot條目q4cs87)，也稱為fra、ag1、h49；完全描述性名稱：鈣蛋白酶半胱氨酸肽酶，推定。seqidno.2顯示了上述uniprot數(shù)據(jù)庫條目的氨基酸位置62-287，得到長度為226個氨基酸的多肽。全長蛋白包含氨基酸1至1275。seqidno.3顯示了下述的部分序列：克氏錐蟲蛋白cruzipain(uniprot條目q9tw51)，也稱為cruzain、gp51/57、ag163b6；完全描述性名稱：主要半胱氨酸蛋白酶。seqidno.3顯示了uniprot數(shù)據(jù)庫條目的氨基酸位置6-135，得到長度為130個氨基酸的多肽，也稱為c-cruzipain。全長蛋白包含氨基酸1至135。seqidno.4顯示了下述的部分序列：克氏錐蟲蛋白kmp-11(uniprot條目q9u6z1)，完全描述性名稱：動質(zhì)體(kinetoplastid)膜蛋白11。該蛋白包含氨基酸位置1至92。seqidno.5顯示了下述的部分序列：克氏錐蟲蛋白par2(uniprot條目q01530)，也稱為pfr2；完全描述性名稱：主要副鞭毛桿蛋白。seqidno.5顯示了par2的c-末端部分(c-par2)，即uniprot數(shù)據(jù)庫條目的氨基酸位置277-600，得到長度為324個氨基酸的多肽。全長蛋白包含氨基酸1至600。seqidno.6代表了完整大腸桿菌slyd氨基酸序列(196個氨基酸殘基)，其也可經(jīng)由uniprot數(shù)據(jù)庫中的idp0a9k9得到。當slyd用作根據(jù)本發(fā)明的克氏錐蟲多肽的分子伴侶融合配偶體時，在一個實施方案中，使用跨越下列序列的氨基酸殘基1-165的大腸桿菌slyd的c-末端截短形式。在另一個實施方案中(如實施例1中所應用)，向根據(jù)本發(fā)明的多肽的n端末端添加兩個slyd單元的串聯(lián)版本。為了便于表達所得融合多肽后的克隆和重折疊，這兩個slyd單元可以通過如seqidno.7中所示的接頭序列分隔。seqidno.7顯示了可用作融合多肽部分之間的柔性、可溶性和蛋白酶抗性間隔物或接頭的富含甘氨酸的間隔物(包含通過絲氨酸分隔的三重甘氨酸單元)的氨基酸序列。seqidno.8顯示了可以添加至根據(jù)本發(fā)明的多肽的n-端末端或在另一個實施方案中根據(jù)本發(fā)明的多肽的c端末端的六組氨酸標簽。該標簽用于促進蛋白純化和重折疊。附圖說明：圖1(包含圖1a和1b)含有表2，其顯示通過使用重組克氏錐蟲抗原變體(相比于三種商購的查加斯測定法)檢測人血清中的抗克氏錐蟲抗體的實驗結(jié)果(還參見實施例4)。對于architectchagas測定法，如果信號/截止值之比(s/co)≥1.0，則樣品被視為陽性(即含有克氏錐蟲抗體)；如果s/co值為<0.8，則樣品被視為陰性(無克氏錐蟲抗體)，而如果s/co值≥0.8且<1.0，則樣品被視為“equ”?！癳qu”意指不明確(或中間)，即結(jié)果在灰色區(qū)域中。根據(jù)商業(yè)提供者的說明，這些“equ”樣品需要通過一種或兩種額外的測定法來證實，以接收可靠的最終結(jié)果(多數(shù)決定法)。對于biolisachagas和novalischagasiggelisa，顯示相應的s/co值。對于根據(jù)本發(fā)明的多肽，對于每種抗原顯示絕對測量計數(shù)(cobas?e601分析儀，rochediagnosticsgmbh，實施例4)和個體截止值。圖2(表3)，其含有用三種商購的用于檢測人血清中的抗克氏錐蟲抗體的查加斯測定法測試的樣本的結(jié)果，以及與之相比，使用根據(jù)本發(fā)明的個別重組克氏錐蟲抗原變體的結(jié)果(還參見實施例4)。圖3(表5)顯示了關于重組克氏錐蟲抗原混合物相比于商業(yè)抗查加斯測定法的靈敏度的實施例6的實驗數(shù)據(jù)。圖4(表6)顯示了有和無分子伴侶融合的重組克氏錐蟲抗原的免疫反應性的比較(還參見實施例7)。圖5(表7)顯示了1f8的鈣依賴性反應性的實驗數(shù)據(jù)(實施例8)。發(fā)明詳述如背景部分中所解釋，現(xiàn)有技術中已知用于檢測來自感染個體的樣品中的克氏錐蟲抗體的免疫測定法使用大量不同的抗原來實現(xiàn)高靈敏度和特異性。大多數(shù)情況下，患者是否被感染的決定基于不同免疫測定結(jié)果中的大部分。到目前為止，還沒有金標準和經(jīng)濟實惠的測定法可用。令人驚訝的是，通過使用包含1f8、jl7和至少一種選自cruzipain、kmp-11和par2的多肽的克氏錐蟲特異性抗原的組合物或混合物，我們已經(jīng)能夠提供克服現(xiàn)有技術的缺點的診斷組合物和方法。就用于檢測分離的患者樣品中針對克氏錐蟲的抗體的重現(xiàn)性、靈敏度和特異性而言，該新型組合物是相當?shù)幕蛏踔羶?yōu)異的。此外，僅三種克氏錐蟲特異性抗原對于產(chǎn)生用于可靠地檢測克氏錐蟲特異性抗體的組合物或試劑盒是有必要的。所述組合物包含至少三種、四種或五種克氏錐蟲多肽。在一個實施方案中，克氏錐蟲特異性多肽的數(shù)目在3至5之間；在一個進一步實施方案中，三種多肽，即1f8、jl7和至少一種選自cruzipain、kmp-11和par2的多肽。在一個進一步實施方案中，所述組合物由三種克氏錐蟲特異性抗原1f8、jl7和cruzipain組成。一個進一步實施方案是包含1f8、jl7、cruzipain和kmp-11的組合物。在另一個實施方案中，所述組合物由1f8、jl7、cruzipain和kmp-11組成。在又另一個實施方案中，所述組合物由seqidno.1(1f8)、seqidno.2(jl7)和seqidno.3(cruzipain)中公開的多肽組成。術語克氏錐蟲(trypanosomacruzi(=t.cruzi))特異性抗原、克氏錐蟲特異性多肽、克氏錐蟲多肽和克氏錐蟲抗原可以同義使用，并且各自指可以在任何天然存在的克氏錐蟲品系中發(fā)現(xiàn)的多肽序列，其可通過國際蛋白數(shù)據(jù)庫(諸如uniprot)獲得。在本發(fā)明中，應用的抗原序列的氨基酸鏈顯示約90個氨基酸(kmp-11)和至多約400個氨基酸(c-par2)之間的長度范圍。在一個實施方案中，每個克氏錐蟲抗原的長度在該范圍內(nèi)。如在實施例4、表2(圖1a和1b)中可見，當使用每種多肽作為個別單一抗原時，包含1f8、jl7、cruzipain、kmp-11或par2肽序列的個別克氏錐蟲多肽在免疫測定中都表現(xiàn)出顯著的抗原性。然而，該實施例還顯示，個別克氏錐蟲抗原的反應性強烈地取決于個體患者血清?？偸谴嬖谝恍┎荒芡ㄟ^使用單一抗原來檢測的樣品。該發(fā)現(xiàn)很好地對應于與商購的查加斯測定的比較?？纯幢?(圖2)，可以看到也不存在檢測所有反應性樣品的單一商購測定法(其各自使用至少四至十種不同的重組克氏錐蟲特異性抗原)。為了可靠地檢測克氏錐蟲特異性抗體，每種樣品必須通過所有三種商業(yè)測定法進行分析，以便在大多數(shù)方法(即三種商業(yè)測定法中的兩種檢測感染)來決定哪種樣品是反應性的并且含有克氏錐蟲特異性抗體。根據(jù)本發(fā)明，包含1f8、jl7和至少一種選自cruzipain、kmp-11和par2的多肽的克氏錐蟲特異性多肽的組合物顯示約99.8％的特異性，其與商業(yè)測定法相當且一致(參見表4，實施例5)。我們測試了兩種試劑盒變體，包含1f8、jl7和cruzipain的試劑盒1和包含1f8、jl7和cruzipain以及kmp-11的試劑盒2。此外，當與三種商業(yè)抗查加斯測定法相比時，兩種試劑盒/組合物均顯示優(yōu)異的稀釋靈敏度，如從實施例6和表5/圖3可見。術語組合物意味著將分離的單獨的克氏錐蟲多肽組合成混合物。該術語不應包括這樣的多肽：其已在一條單一氨基酸鏈上重組表達或合成(化學產(chǎn)生)、使得所有多肽作為多抗原-融合多肽位于僅一條多肽鏈上。換句話說，排除了天然不出現(xiàn)在單一多肽鏈上的幾個表位的多表位融合抗原。相反，克氏錐蟲多肽1f8、jl7和至少一種選自cruzipain、kmp-11和par2的多肽中的每一種在分開的多肽鏈上表達或作為分開的多肽鏈化學合成。在一個實施方案中，所述組合物由對克氏錐蟲特異性的三種重組或合成產(chǎn)生的多肽組成，其中所述多肽是1f8、jl7和cruzipain。通過在一個容器或管中混合個別克氏錐蟲多肽、導致產(chǎn)生組合物來產(chǎn)生組合物。所述組合物可以是液體，即將克氏錐蟲多肽以水或緩沖液可溶形式添加至混合物。合適的緩沖液成分是本領域技術人員已知的。所述組合物也可以是固體，即其包含凍干或其它干燥形式的克氏錐蟲抗原。在一個實施方案中，所述多肽的組合物包含根據(jù)seqidno.1的1f8氨基酸序列、根據(jù)seqidno.2的jl7序列，且至少一種選自cruzipain、kmp-11和par2的多肽包含至少一種選自seqidno.3(cruzipain)、seqidno.4(kmp-11)和seqidno.5(par2)的序列。在另一個實施方案中，所述多肽的組合物包含多肽1f8、jl7和cruzipain。在又另一個實施方案中，所述組合物包含根據(jù)seqidno.1(1f8)、2(jl7)和3(cruzipain)的多肽。在一個進一步實施方案中，所述組合物由包含seqidno.1(1f8)、2(jl7)和3(cruzipain)的三種多肽組成。在一個進一步實施方案中，對于克氏錐蟲特異性的部分由seqno.1(1f8)、2(jl7)和3(cruzipain)組成。在另一個實施方案中，所述組合物由包含seqidno.1(1f8)、2(jl7)、3(cruzipain)和4(kmp-11)的多肽組成。表述“對于克氏錐蟲特異性的部分由seqidno.1(或2或3等)組成”意味著例如seqidno.1是衍生自克氏錐蟲中存在的抗原的唯一多肽部分，其存在于該多肽鏈上并與克氏錐蟲特異性抗體反應。然而，添加非克氏錐蟲特異性接頭或肽性融合氨基酸序列是可能的，因為這些序列對于克氏錐蟲不是特異性的，并且不被克氏錐蟲特異性抗體所識別。根據(jù)本發(fā)明，所述組合物中還包括根據(jù)seqidno.1、2、3、4或5的1f8、jl7、cruzipain、kmp-11和par2抗原的變體。這也適用于存在于由三種克氏錐蟲特異性多肽組成的組合物中的多肽1f8、jl7和cruzipain。該上下文中的術語“變體”涉及蛋白或基本上與所述蛋白相似的蛋白片段(即多肽或肽)。具體而言，變體可以是與最普遍的蛋白同種型的氨基酸序列相比顯示氨基酸置換、缺失或插入的同種型。在一個實施方案中，這種基本相似的蛋白與蛋白的最普遍的同種型具有至少80％的序列相似性，在另一個實施方案中具有至少85％或至少90％的序列相似性，在仍另一個實施方案中具有至少95％的序列相似性。術語“變體”還涉及翻譯后修飾的蛋白，諸如糖基化或磷酸化蛋白。根據(jù)本發(fā)明，變體被分類為這樣，只要維持體外診斷免疫測定中的免疫反應性，即變體仍然能夠結(jié)合并檢測樣品中存在的抗克氏錐蟲抗體。“變體”也是已經(jīng)例如通過將接頭氨基酸序列、標記物、標簽氨基酸序列或載體部分共價連接至多肽或抗原而修飾的多肽或抗原。根據(jù)本發(fā)明的多肽組合物在如本領域技術人員已知的生理緩沖條件下是可溶的。術語“對于克氏錐蟲特異性”意味著所述多肽能夠與存在于分離的樣品諸如人血清中的克氏錐蟲特異性的抗體結(jié)合或被其識別和結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的所有克氏錐蟲特異性多肽都可以表達為與非克氏錐蟲特異性多肽序列諸如折疊輔助分子如分子伴侶的融合蛋白。這些融合配偶體的目標是促進分析物特異性多肽的克隆、表達和純化。然而，根據(jù)本發(fā)明，克氏錐蟲特異性多肽可以同樣地作為無任何分子伴侶融合配偶體的獨立的多肽產(chǎn)生。在一個實施方案中，形成根據(jù)本發(fā)明的克氏錐蟲特異性抗原的組合物的個別多肽在沒有分子伴侶融合配偶體的情況下產(chǎn)生。實施例7和表6(圖4)顯示用于檢測克氏錐蟲特異性抗體的免疫測定中的抗原性不依賴于每種抗原的分子伴侶融合配偶體的存在。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生適用于檢測針對克氏錐蟲的抗體的多肽的可溶性和免疫反應性組合物的方法。所有個別克氏錐蟲特異性抗原都根據(jù)實施例1或2中描述的方法產(chǎn)生。在一個實施方案中，所述方法包括以下步驟：a)培養(yǎng)用表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，所述表達載體包含可操作連接的編碼第一克氏錐蟲多肽1f8的重組dna分子，b)表達所述克氏錐蟲多肽，和c)純化所述克氏錐蟲多肽，d)用表達載體重復步驟a)至d)，所述表達載體包含可操作連接的編碼第二克氏錐蟲多肽jl7的重組dna分子e)用表達載體重復步驟a)至d)，所述表達載體包含可操作連接的編碼選自cruzipain、kmp-11和par2的第三克氏錐蟲多肽的重組dna分子f)形成步驟c)、d)和e)中獲得的克氏錐蟲多肽的混合物，從而產(chǎn)生適合于檢測針對克氏錐蟲的抗體的多肽的可溶性和免疫反應性組合物。在一個實施方案中，上述詳述的用于產(chǎn)生多肽組合物的方法涉及由三種重組產(chǎn)生的多肽組成的組合物。在這種情況下，用表達載體重復步驟e)，所述表達載體包含可操作連接的編碼第三克氏錐蟲多肽cruzipain的重組dna分子。本發(fā)明的另一方面是用于檢測分離的樣品中對于克氏錐蟲特異性的抗體的方法，其中包含多肽1f8、jl7和至少一種選自cruzipain、kmp-11和par2的多肽的克氏錐蟲多肽的組合物用作所述克氏錐蟲抗體的捕獲試劑和/或結(jié)合配偶體。在一個實施方案中，用于檢測分離的樣品中對于克氏錐蟲特異性的抗體的方法應用由如上進一步描述的三種克氏錐蟲多肽(其為1f8、jl7和cruzipain)組成的組合物。在一個實施方案中，多肽1f8包含seqidno.1，jl7包含seqidno.2且cruzipain包含seqidno.3。在又另一個實施方案中，1f8由seqidno.1組成，jl7由seqidno.2組成，且cruzipain由seqidno.3組成。用于上述克氏錐蟲特異性抗體的檢測的所述克氏錐蟲多肽的組合物也可以通過前述段落的產(chǎn)生多肽的方法獲得。在一個進一步方面，所述方法適用于檢測所有可溶性免疫球蛋白亞類的克氏錐蟲抗體，包括作為查加斯診斷的最相關亞類的igg和igm。用于檢測抗體的免疫測定法是本領域技術人員眾所周知的，用于進行此類測定的方法和實際應用和程序也是如此。根據(jù)本發(fā)明的克氏錐蟲特異性抗原的組合物可用于改進用于檢測抗克氏錐蟲特異性抗體的測定，而不依賴于所使用的標記物且不依賴于檢測模式(例如，放射性同位素測定、酶免疫測定、電化學發(fā)光測定等)或測定原理(例如，測試條測定、夾心測定、間接測試概念或均質(zhì)測定等)。技術人員已知的所有生物液體可用作檢測抗克氏錐蟲抗體的樣品。通常使用的樣品是體液，如全血、血清、血漿、尿液或唾液。本發(fā)明的一個進一步方面是用于檢測分離的樣品中對于克氏錐蟲特異性的抗體的方法，所述方法包括a)通過將體液樣品與如上所定義的克氏錐蟲多肽的組合物或與通過上述方法獲得的克氏錐蟲多肽的組合物混合而形成免疫反應混合物b)將所述免疫反應混合物保持一定時間段，所述時間段足以使體液樣品中存在的針對所述多肽樣品的組合物的抗體與所述克氏錐蟲多肽的組合物免疫反應以形成免疫反應產(chǎn)物；和c)檢測所述免疫反應產(chǎn)物中的任一種的存在和/或濃度。在一個實施方案中，所述用于檢測分離的樣品中對于克氏錐蟲特異性的抗體的方法以雙抗原夾心(dags)形式進行。在此測定中，需要和利用抗體結(jié)合至少兩個具有其兩個(igg、iga、ige)或十個(igm)互補位的給定抗原的不同分子的能力。在所述dags免疫測定中，“固相抗原”和“檢測抗原”的基本結(jié)構基本上相同，使得樣品抗體在兩種特異性抗原之間形成橋。因此，兩種抗原必須是相同的或免疫交叉反應性的，使得一種抗體能夠結(jié)合兩種抗原。進行此測定的基本要求是一種或多種相關表位存在于兩種抗原上。兩種抗原之一可以結(jié)合固相，而另一抗原攜帶可檢測的標記物。根據(jù)本發(fā)明，dags測定程序包括以下步驟：a)向分離的樣品添加可以直接或間接地結(jié)合至固相的克氏錐蟲多肽的第一組合物和克氏錐蟲多肽的第二組合物，所述第一克氏錐蟲多肽各自攜帶作為生物親和(bioaffine)結(jié)合對的一部分的效應基團，且所述第二克氏錐蟲多肽各自攜帶可檢測的標記物，其中所述第一和第二克氏錐蟲多肽特異性結(jié)合所述抗克氏錐蟲抗體，b)形成包含第一克氏錐蟲多肽、樣品抗體和第二克氏錐蟲多肽的免疫反應混合物，其中在形成免疫反應混合物之前、期間或之后添加攜帶所述生物親和結(jié)合對的相應效應基團的固相，c)將所述免疫反應混合物保持一定時間段，所述時間段足以使體液樣品中針對所述第一和第二克氏錐蟲多肽的克氏錐蟲抗體與所述第一和第二克氏錐蟲多肽免疫反應以形成免疫反應產(chǎn)物，d)將液相與固相分離e)檢測所述固相或液相或兩者中所述免疫反應產(chǎn)物中的任一種的存在。在一個實施方案中，所述第一克氏錐蟲多肽攜帶生物素部分作為生物親和結(jié)合對生物素/鏈霉抗生物素蛋白的一部分，且所述第二克氏錐蟲多肽用電化學發(fā)光釕絡合物標記。本發(fā)明的另一個實施方案是包含多肽1f8、jl7和至少一種選自cruzipain、kmp-11和par2的多肽的克氏錐蟲多肽的組合物在用于檢測抗克氏錐蟲抗體的體外診斷測試中的用途。在一個實施方案中，用于檢測抗克氏錐蟲抗體的體外診斷測試中的組合物由三種克氏錐蟲多肽1f8、jl7和cruzipain組成。所述克氏錐蟲多肽的組合物也可以通過如上進一步描述的產(chǎn)生多肽的方法獲得。本發(fā)明的又另一方面是用于檢測抗克氏錐蟲抗體的試劑盒，其包含多肽1f8、jl7和至少一種選自cruzipain、kmp-11和par2的多肽。在一個實施方案中，存在于所述試劑盒或抗克氏錐蟲抗體的檢測中的多肽由多肽1f8、jl7和cruzipain組成。所述試劑盒可用于檢測抗克氏錐蟲抗體的體外診斷測試，并且可以進一步含有分開小瓶中的對照和標準溶液以及一種或多種溶液中或凍干形式的另外的試劑與通常的添加劑、緩沖液、鹽、洗滌劑等，以及本領域技術人員已知的使用說明書。同樣對于試劑盒，所述克氏錐蟲多肽的組合物也可以通過如上進一步描述的產(chǎn)生多肽的方法獲得。在本發(fā)明的又另一個實施方案中，我們可以顯示克氏錐蟲抗原1f8的反應性取決于鈣離子的存在。如實施例8/表7(圖8)中所述，當1f8是克氏錐蟲抗原組合物的一部分時，鈣離子的添加導致免疫反應性的明顯增加。此外，當克氏錐蟲抗原組合物中使用1f8抗原(鈣結(jié)合蛋白)時，向測定緩沖液中添加鈣離子可以降低作為樣品材料的血漿的回收效應(即血漿取樣管中的抗凝血劑例如檸檬酸鹽、edta或肝素的ca2+絡合效應)。因此，本發(fā)明還涉及適合于檢測分離的生物樣品中針對克氏錐蟲的抗體的多肽的組合物，其包含多肽1f8、jl7和至少一種選自cruzipain、kmp-11和par2的多肽，其中所述組合物含有濃度為0.001至100毫摩爾/升，在一個實施方案中0.1至10毫摩爾/升，在另一個實施方案中0.5至5毫摩爾/升，在另一個實施方案中1至5毫摩爾/升，在又另一個實施方案中5毫摩爾/升的鈣離子。鈣可以以水溶性鹽如例如氯化鈣的形式添加。如上所詳述的鈣離子的添加也適用于適合于檢測分離的生物樣品中針對克氏錐蟲的抗體的三種多肽的組合物，其中所述多肽為1f8、jl7和cruzipain。在一個實施方案中，多肽1f8包含seqidno.1，多肽jl7包含seqidno.2且多肽cruzipain包含seqidno.3。在又另一個實施方案中，所述多肽1f8、jl7和cruzipain分別由seqidno.1、2和3組成。鈣離子的添加和限定的濃度范圍也是上面進一步描述的包含多肽1f8、jl7和至少一種選自cruzipain、kmp-11和par2的多肽的試劑盒以及具有由1f8、jl7和cruzipain組成的三種克氏錐蟲特異性多肽的試劑盒的實施方案。所述試劑盒可以含有如以前定義的濃度范圍內(nèi)，在一個實施方案中，0.1至10毫摩爾/升的濃度的鈣離子。本發(fā)明通過實施例部分進一步舉例說明。具體而言，實施例舉例說明，我們已經(jīng)開發(fā)并生成了克氏錐蟲特異性多肽的變體，其當作為至少三種不同抗原(在一個實施方案中，由三種抗原組成)的新型組合物應用時，在用于檢測克氏錐蟲特異性抗體的免疫測定中顯示就特異性和靈敏度而言優(yōu)異的結(jié)果。實施例1具有分子伴侶融合的克氏錐蟲抗原的克隆和純化編碼表1中用前綴“ecss”表示的克氏錐蟲抗原的合成基因購自eurofinsmwgoperon(ebersberg,germany)?；趎ovagen(madison,wi,usa)的pet24a表達質(zhì)粒，進行以下克隆步驟。用ndei和xhoi消化載體，并插入包含串聯(lián)-slyd和各自克氏錐蟲抗原的半合成盒。將所得質(zhì)粒的插入物測序，并發(fā)現(xiàn)其編碼所需融合蛋白。產(chǎn)生融合蛋白的克氏錐蟲多肽(seqidno.1-5)和大腸桿菌slyd分子伴侶部分(seqidno.6)的氨基酸序列顯示于本發(fā)明的序列方案中。將兩個slyd單元(串聯(lián)slyd)融合至各自克氏錐蟲多肽的n端末端。所有重組克氏錐蟲融合多肽變體含有c末端六組氨酸標簽(seqidno.8)，以促進ni-nta輔助的純化和重折疊。seqidno.概述于表1中。所有克氏錐蟲分子伴侶融合抗原都根據(jù)相同的方案純化和重折疊，而無論特定多肽鏈中是否存在半胱氨酸殘基。使攜帶表達質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)細胞在加有卡那霉素(30μg/ml)的lb培養(yǎng)基中生長至od600為1，并通過添加異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至1mm的最終濃度而誘導細胞溶質(zhì)過表達，生長溫度為37℃。誘導后4小時，通過離心(5000xg，20分鐘)而收獲細胞，冷凍并儲存于-20℃。對于細胞裂解，將冷凍的沉淀物重懸浮于每50ml緩沖液(蛋白酶抑制劑混合物)25mm磷酸鈉ph8.5、6mmmgcl2、10u/mlbenzonase?、1片complete?和1片complete?edta-free中，并通過高壓均質(zhì)化來裂解所得懸浮液。將粗裂解物補充直至7mguhcl(鹽酸胍)、50mm磷酸鈉、5mm咪唑，并攪拌1小時。離心后，將上清液施加至預先平衡于緩沖液a(50mm磷酸鈉ph8.5、7.0mguhcl、5mm咪唑)中的ni-nta(鎳-次氮基三乙酸)柱上。為了防止過早的二硫化物橋聯(lián)和二硫化物改組，特別是對于ss-c-cruzipain，在洗滌緩沖液中包括5mmtcep作為與金屬螯合物柱相容的還原劑。洗滌步驟后，將離液緩沖液a替換為每50ml緩沖液(蛋白酶抑制劑混合物)50mm磷酸鈉ph8.5、100mm氯化鈉、10mm咪唑、5mmtcep、1片complete?edta-free，以誘導基質(zhì)結(jié)合蛋白的構象重折疊。隨后，通過用每50ml緩沖液50mm磷酸鈉ph8.5、100mm氯化鈉、10mm咪唑、1片complete?edta-free洗滌來誘導氧化折疊(即，半胱氨酸殘基的氧化橋聯(lián))。由于二價ni2+離子的高有效濃度，基質(zhì)結(jié)合融合蛋白內(nèi)二硫化物橋的形成是非?？焖俚倪^程。洗脫前，將咪唑濃度提高至40mm，以除去污染蛋白。然后通過應用50mm磷酸鈉ph8.5、100mm氯化鈉中的250mm的咪唑濃度來洗脫天然融合蛋白。通過sds-page評價含蛋白級分的純度并合并。最后，將蛋白進行大小排阻色譜，并將含蛋白級分合并并濃縮。實施例2無分子伴侶融合的克氏錐蟲抗原的克隆和純化編碼如表1中所列的克氏錐蟲抗原的合成基因購自eurofinsmwgoperon(ebersberg,germany)?；趎ovagen(madison,wi,usa)的pet24a表達質(zhì)粒，進行以下克隆步驟。對于克氏錐蟲抗原1f8、jl7、kmp-11或c-cruzipain，用分別ndei或bamh1和xhoi消化載體，并插入包含各自克氏錐蟲抗原(seqidno.1-4)的盒。將所得質(zhì)粒的插入物測序，并發(fā)現(xiàn)其編碼所需蛋白。所得蛋白的氨基酸序列顯示于本發(fā)明的序列方案中。所有重組克氏錐蟲多肽變體含有c末端六組氨酸標簽，以促進ni-nta輔助的純化和重折疊。seqidno.概述于表1中。所有無分子伴侶融合的克氏錐蟲抗原都根據(jù)以下方案純化。使攜帶表達質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)細胞在加有卡那霉素(30μg/ml)的lb培養(yǎng)基中生長至od600為1，并通過添加異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至1mm的最終濃度而誘導細胞溶質(zhì)過表達，生長溫度為37℃。誘導后4小時，通過離心(5000xg，20分鐘)而收獲細胞，冷凍并儲存于-20℃。對于細胞裂解，將冷凍的沉淀物重懸浮于每50ml緩沖液(蛋白酶抑制劑混合物)25mm磷酸鈉ph8.5、6mmmgcl2、10u/mlbenzonase?、1片complete?和1片complete?edta-free中，并通過高壓均質(zhì)化來裂解所得懸浮液。將粗裂解物補充直至50mm磷酸鈉、10mm咪唑。離心后，將上清液施加至預先平衡于緩沖液a(50mm磷酸鈉ph8.5、100mm氯化鈉、10mm咪唑)中的ni-nta(鎳-次氮基三乙酸酯)柱上。洗脫前，將咪唑濃度提高至40mm，以除去污染蛋白。然后通過應用250mm的咪唑濃度來洗脫蛋白。最后，將蛋白進行大小排阻色譜，并將含蛋白級分合并并濃縮。-在表1中，作為前綴的ecss或ss表示與克氏錐蟲多肽n-末端融合的串聯(lián)slyd部分。表1：根據(jù)實施例1和2獲得的克氏錐蟲抗原克氏錐蟲抗原包含查加斯抗原seqidno.ecss-1f8(cys)1ecss-1f8(cys殘基被替換為ala)1ecss-jl72ecss-c-cruzipain3ecss-kmp114ecss-c-par251f81jl72c-cruzipain3kmp-114實施例3生物素和釕部分與克氏錐蟲抗原的偶聯(lián)重組蛋白的賴氨酸ε-氨基分別用n-羥基-琥珀酰亞胺活化的生物素和釕標記物以～10mg/ml的蛋白濃度進行修飾。根據(jù)各自的蛋白，標記物/蛋白摩爾比從3:1至30:1變化。反應緩沖液為50mm磷酸鉀(ph8.5)、150mmkcl、0.5mmedta。反應在室溫下進行30分鐘，并通過添加緩沖的l-賴氨酸至10mm的最終濃度來終止。偶聯(lián)反應后，通過將粗蛋白綴合物通過凝膠過濾柱(superdex200hiload)來除去未反應的游離標記物。實施例4在免疫診斷測試中評價重組克氏錐蟲抗原的免疫反應性；檢測人血清中的抗克氏錐蟲抗體在自動化cobas?e601分析儀(rochediagnosticsgmbh)中評價不同蛋白的免疫反應性。以雙抗原夾心形式進行測量。由此，將生物素-綴合物(即捕獲抗原)固定在鏈霉抗生物素蛋白-包被的磁珠的表面上，而檢測-抗原攜帶絡合的釕陽離子作為信號傳導部分。cobas?e601中的信號檢測基于電化學發(fā)光。在特異性免疫球蛋白分析物存在的情況下，顯色釕絡合物橋接至固相，并在鉑電極處激發(fā)后發(fā)射620nm的光。信號輸出為任意光單位。用購自幾個來源的抗克氏錐蟲陽性和陰性人血清和血漿樣品進行測量。根據(jù)各制造商的說明，使用三種商購的查加斯測定(來自abbottlaboratories的architectchagas，來自biokits.a.的bioelisachagas，來自novatec的novalisachagasiggelisa)測試所有樣品。architectchagas測定使用幾種多表位融合多肽，其各自包含幾種含有抗原pep-2、tcd、tce、tclo1.2、tcr27、fcabp(=1f8)、tcr39、fra(=jl7)、sapa和map的重組克氏錐蟲多肽，得到10種不同的抗原。bioelisachagas使用重組抗原pep-2、tcd、tce和tclo1.2。novalisachagasiggelisa使用包含抗原pep-2、tcd、tce和tclo1.2的多表位融合多肽tcf。注意，在克氏錐蟲抗原命名法中，相同或非常相似的抗原通常攜帶幾個同義詞，諸如例如fcabp=1f8或pep-2與b13和ag2以及tcr39同義，對于綜述，參見例如silveira等人,trendsinparasitol.2001,vol.17no.6或marcipar等人,currenttopicsintrop.med16march2012,p.273-398。根據(jù)本發(fā)明的重組克氏錐蟲抗原變體以雙抗原夾心(dags)免疫測定形式成對評價。例如，ss-1f8-生物素綴合物與含有50mmmes(ph6.5)、150mmnacl、0.1%聚多卡醇、0.2％牛白蛋白、0.01％n-甲基異噻唑酮、0.1%oxy-pyrion的測定緩沖液中各濃度為800ng/ml的ss-1f8-釕絡合物綴合物一起進行評價。在所有測量中，化學聚合和未標記的ecslyd-ecslyd(ss)在反應緩沖液中作為抗干擾物質(zhì)以大量過量(20μg/ml)進行，以避免經(jīng)由分子伴侶融合單元的免疫交叉反應。抗克氏錐蟲陰性人血清用作對照。使用的樣品體積為49μl。在表2(圖1a和1b)中，顯示了克氏錐蟲抗原分子伴侶融合變體(參見序列表和序列概述，同上)的免疫活性。前五種樣品是正常人血清，以下樣品是證明的克氏錐蟲抗體陽性樣品。評價所述查加斯抗原的工作截止值被任意選擇為五種正常人血清的六倍平均值，以充分區(qū)分查加斯陽性和陰性樣本。所有判斷為陽性的結(jié)果都用粗體字母書寫。顯然，克氏錐蟲抗原變體的反應性強烈取決于個體患者血清。根據(jù)本發(fā)明的所有抗原變體都表現(xiàn)出顯著的抗原性。表3(圖2)顯示用三種商購的查加斯測定(architectchagas、bioelisachagas和novalisachagasiggelisa；成分抗原參見上文)測試的樣本的結(jié)果。根據(jù)大多數(shù)方法，所有樣品都被確定為查加斯陽性。這意味著如果三種測定中的兩種提供陽性結(jié)果且第三種測定為陰性，則將樣品判斷為陽性，因為大多數(shù)測定結(jié)果(2:1)為陽性。所有判斷為陽性的個別結(jié)果都以粗體字母印刷。從表3可見，只有少數(shù)樣本與本發(fā)明中所述的所有重組抗原反應。盡管ecss-c-cruzipain是能夠與表3中研究的所有查加斯陽性樣品反應的唯一抗原(圖2)，但人血清中查加斯抗體的可靠檢測需要包含多于一種特異性抗原的組合物。實施例5重組克氏錐蟲抗原混合物的特異性為了評價上述重組查加斯抗原的特異性(即，真實陰性率)，產(chǎn)生具有不同抗原混合物的兩種原型試劑盒。試劑盒變體1由ecss-1f8、ecss-jl7和ecss-c-cruzipain構建。試劑盒變體2另外包括ecss-kmp-11。以各100ng/ml的濃度應用克氏錐蟲抗原的多肽變體的生物素和釕綴合物。在所有測量中，化學聚合和未標記的抗干擾劑ecslyd-ecslyd(ss)在反應緩沖液中大量過量(20μg/ml)進行。使用的樣品體積為30μl。表4：重組克氏錐蟲抗原混合物相比于商購抗查加斯測定的特異性。用兩種試劑盒變體測試來自巴伐利亞紅十字會的494名獻血者(正常樣品)，且結(jié)果概述于上文表4中。494個樣品中只有一個與本發(fā)明的兩個試劑盒變體反應。通過來自novatec的novalisachagasiggelisa進一步研究了該樣品，未發(fā)現(xiàn)反應。所得99.80％的特異性與其他商業(yè)抗查加斯測定法一致。實施例6重組克氏錐蟲抗原混合物的靈敏度通過測量人血清基質(zhì)中查加斯抗體的兩種不同who標準品(tci和tcii，tci=克氏錐蟲基因型i；tcii=克氏錐蟲基因型ii)的線性稀釋度行來將實施例5中描述的兩種試劑盒變體的靈敏度(即真陽性率)與兩種商購的查加斯測定法(來自biokits.a.的bioelisachagas，來自ortho-clinicaldiagnostics的ortho克氏錐蟲elisa測試系統(tǒng))進行比較(表5，圖3)。所有判斷為陽性的結(jié)果都以粗體字母印刷。本發(fā)明的試劑盒變體1和2在稀釋靈敏度實驗中沒有顯著差異。然而，兩種試劑盒變體比競爭測定法bioelisachagas、ortho克氏錐蟲elisa或architectchagas更靈敏4至6個線性稀釋步驟。實施例4中描述了bioelisachagas和architectchagas的成分克氏錐蟲抗原。ortho克氏錐蟲elisa基于克氏錐蟲細胞裂解物，且不含重組抗原。通過本發(fā)明實現(xiàn)的增加的稀釋靈敏度意味著在非常低的抗體濃度下，可以可靠地檢測抗體的存在。實施例7有和無分子伴侶融合的重組克氏錐蟲抗原的免疫反應性的比較在以前的實施例中顯示了具有分子伴侶融合的重組克氏錐蟲抗原的免疫反應性。為了顯示根據(jù)本發(fā)明的克氏錐蟲抗原的免疫反應性獨立于融合配偶體的存在，還關于其免疫反應性評價了如實施例2中所述的無分子伴侶融合的重組克氏錐蟲抗原。表6(圖4)概述了測量結(jié)果。以各100ng/ml的濃度應用克氏錐蟲抗原的多肽變體的生物素和釕綴合物。在所有測量中，化學聚合和未標記的抗干擾劑ecslyd-ecslyd(ss)在反應緩沖液中大量過量(20μg/ml)進行。使用的樣品體積為30μl。從表6(圖4)的測量數(shù)據(jù)可以得出結(jié)論，無分子伴侶融合配偶體的克氏錐蟲抗原變體也表現(xiàn)出顯著的抗原性。觀察到的信號的差異可以通過作為不同數(shù)量的可及賴氨酸殘基(有或無slyd融合)的結(jié)果的不同的標記率來解釋。另一方面可能是不同的標記位點，這可導致表位的不同損傷。另外，無分子伴侶融合的抗原的摩爾濃度高于其含有所述融合配偶體的對應物。綜上，克氏錐蟲多肽用于檢測克氏錐蟲抗體的適用性不依賴于分子伴侶融合配偶體。純粹的克氏錐蟲特異性多肽抗原序列是檢測克氏錐蟲特異性抗體所必需的。實施例8鈣離子對重組克氏錐蟲抗原1f8的免疫反應性的影響為了研究鈣離子對重組克氏錐蟲抗原1f8(也稱為tc24、tc28或fcabp(鞭毛鈣結(jié)合蛋白)，克氏錐蟲的已知鈣結(jié)合蛋白)的免疫反應性的影響，如實施例4中所述的測定緩沖液用1mm的濃度的氯化鈣補充。以各200ng/ml的濃度應用ecss-1f8的生物素和釕綴合物。在所有測量中，化學聚合和未標記的抗干擾劑ecslyd-ecslyd(ss)在反應緩沖液中大量過量(20μg/ml)進行。使用的樣品體積為30μl。表7(圖5)中查加斯感染患者的大多數(shù)血清顯示，由于向測定緩沖液中添加鈣離子，克氏錐蟲1f8抗原的免疫反應性明顯增加。對于一些查加斯陽性血清，信號可翻倍。觀察到的信號差異可以通過個體患者的免疫應答的異質(zhì)模式來解釋，也如表2(圖1a和1b)中所示。當應用由三種多肽1f8、jl7和cruzipain組成的根據(jù)本發(fā)明的多肽組合物時，也可以觀察到由于添加鈣離子而導致的克氏錐蟲1f8抗原的免疫反應性的增加(數(shù)據(jù)未顯示)。序列表<110>rochediagnosticsgmbh<120>用于檢測查加斯病的抗原組合物<130>p32403wo-ir<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>211<212>prt<213>人工序列<220><223>衍生自具有變化的uniprotq4d1q2克氏錐蟲1f8x=cys,ala或ser<220><221>misc_feature<222>(4)..(4)<223>xaa可以是cys,ala或ser<220><221>misc_feature<222>(66)..(66)<223>xaa可以是cys,ala或ser<220><221>misc_feature<222>(74)..(74)<223>xaa可以是cys,ala或ser<220><221>misc_feature<222>(124)..(124)<223>xaa可以是cys,ala或ser<400>1metglyalaxaaglyserlysglyserthrserasplysglyleuala151015serasplysaspglylysasnalalysasparglysglualatrpglu202530argileargglnalaileproargglulysthralaglualalysgln354045argargilegluleuphelyslyspheasplysasngluthrglylys505560leuxaatyraspgluvalhisserglyxaaleugluvalleulysleu65707580aspgluphethrproargvalargaspilethrlysargalapheasp859095lysalaargalaleuglyserlysleugluasnlysglysergluasp100105110phevalglupheleuglupheargleumetleuxaatyriletyrasp115120125phephegluleuthrvalmetpheaspgluileaspalaserglyasn130135140metleuvalaspgluglugluleulysargalavalprolysleuglu145150155160alatrpglyalalysvalgluaspproalaalaleuphelysgluleu165170175asplysasnglythrglyservalthrpheaspgluphealaalatrp180185190alaseralavallysleuaspalaaspglyaspproaspasnvalpro195200205gluserala210<210>2<211>226<212>prt<213>克氏錐蟲<400>2metgluglngluargargglnleuleuglulysaspproargargasn151015alaarggluilealaalaleugluglusermetasnalaargalagln202530gluleualaargglulyslysleualaaspargalapheleuaspgln354045lysprogluglyvalproleuarggluleuproleuaspaspaspser505560aspphevalalametgluglngluargargglnleuleuglulysasp65707580proargargasnalalysgluilealaalaleugluglusermetasn859095alaargalaglngluleualaargglulyslysleualaaspargala100105110pheleuaspglnlysprogluglyvalproleuarggluleuproleu115120125aspaspaspseraspphevalsermetgluglngluargargglnleu130135140leuglulysaspproargargasnvalglnlysilealaaspleuglu145150155160glusermetasnalaargalaglngluleualaargglulyslysleu165170175alaaspargalapheleuaspglnlysprogluglyvalserleuarg180185190gluleuproleuaspaspaspseraspphevalsermetgluglnglu195200205argargglnleuleuglulysaspproarglysasnvalglnileval210215220alaasp225<210>3<211>130<212>prt<213>克氏錐蟲<400>3glyproglyprothrprogluprothrthrthrthrthrthrserala151015proglyproserprosertyrphevalglnmetsercysthraspala202530alacysilevalglycysgluasnvalthrleuprothrglyglncys354045leuleuthrthrserglyvalseralailevalthrcysglyalaglu505560thrleuthrglugluvalpheleuthrserthrhiscysserglypro65707580servalargserservalproleuasnlyscysasnargleuleuarg859095glyservalgluphephecysglyserserserserglyargleuala100105110aspvalaspargglnargarghisglnprotyrhisserarghisarg115120125argleu130<210>4<211>92<212>prt<213>克氏錐蟲<400>4metalathrthrleugluglupheseralalysleuaspargleuasp151015alagluphealalyslysmetglugluglnasnlyslysphepheala202530asplysproaspgluserthrleuserproglumetlysgluhistyr354045glulyspheglulysmetileglngluhisthrasplyspheasnlys505560lysmethisgluhissergluhisphelysalalysphealagluleu65707580leugluglnglnlysasnalaglnpheproglylys8590<210>5<211>324<212>prt<213>克氏錐蟲<400>5pheglngluthrseralailelysaspalalysargargleulysgln151015argcysgluaspaspleulysasnleuhisaspalaileglnlysala202530aspmetgluaspalaglualametlysargphealathrglnlysglu354045lysserglulyspheileglngluasnleuaspargglnaspgluala505560trpargargileglngluleugluargvalleuglnargleuglythr65707580gluargpheglugluvallysargargileglugluasnaspargglu859095glulysarglysvalglutyrglnglnpheleuaspvalcysglygln100105110hislyslysleuleugluleuservaltyrasncysaspleualamet115120125argcysileglymetmetglugluleuvalalagluglycysserala130135140ilelysserarghisasplysthrasnglugluleuglyaspleuarg145150155160leuglnvalhisglnglutyrleuglualapheargargleutyrlys165170175thrleuglyglnleuvaltyrlyslysglulysargleuglugluile180185190aspargasnileargthrthrhisileglnleugluphealaileglu195200205thrpheaspproasnalalyslyshisseraspalalyslysgluleu210215220tyrlysleuargalaglnvalgluglugluleuglumetleulysasp225230235240lysmetalaglnalaleuglumetpheglyprothrgluaspalaleu245250255asnglnalaglyilegluphevalhisproalaglugluvalgluasp260265270glyasnleuthrargargserlysmetvalglutyrargalahisleu275280285alalysglnglugluvallysilealaalagluargglugluleulys290295300argserlysthrleuglnserglnglntyrargglylysthrvalgln305310315320glnilethrgln<210>6<211>196<212>prt<213>大腸桿菌<400>6metlysvalalalysaspleuvalvalserleualatyrglnvalarg151015thrgluaspglyvalleuvalaspgluserprovalseralaproleu202530asptyrleuhisglyhisglyserleuileserglyleugluthrala354045leugluglyhisgluvalglyasplyspheaspvalalavalglyala505560asnaspalatyrglyglntyraspgluasnleuvalglnargvalpro65707580lysaspvalphemetglyvalaspgluleuglnvalglymetargphe859095leualagluthraspglnglyprovalprovalgluilethralaval100105110gluaspasphisvalvalvalaspglyasnhismetleualaglygln115120125asnleulyspheasnvalgluvalvalalaileargglualathrglu130135140glugluleualahisglyhisvalhisglyalahisasphishishis145150155160asphisasphisaspglycyscysglyglyhisglyhisasphisgly165170175hisgluhisglyglygluglycyscysglyglylysglyasnglygly180185190cysglycyshis195<210>7<211>23<212>prt<213>人工序列<220><223>富含甘氨酸的接頭序列<400>7glyglyglyserglyglyglyserglyglyglyserglyglyglyser151015glyglyglyserglyglygly20<210>8<211>15<212>prt<213>人工序列<220><223>六組氨酸標簽<400>8glyglyglyserglyglyglyleugluhishishishishishis151015當前第1頁12