滿天星異葒草苷在制備治療免疫性肝纖維化藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥滿天星提取物的用途，具體地說是以滿天星異葒草苷為原料在制 備治療免疫性肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝纖維化(fibrosis of liver)是多種原因引起的慢性肝損害所致的病理改變， 主要表現(xiàn)為肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM)成分過度異常地沉積，并影響肝 臟的功能，是慢性肝病發(fā)展到肝硬化必經(jīng)階段。肝纖維化具有可逆性，然而當(dāng)其發(fā)展成肝硬 化則很難逆轉(zhuǎn)，因此逆轉(zhuǎn)和治療肝纖維化顯得非常重要。
[0003] 豬血清作為一種異種血清通過免疫反應(yīng)可造成免疫性損傷。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腹腔 注射豬血清使得其中的抗原物質(zhì)經(jīng)腹腔內(nèi)吸收產(chǎn)生相應(yīng)抗體，形成抗原抗體復(fù)合物沉積于 肝細(xì)胞中，引起慢性免疫性炎癥反應(yīng)，ECM在肝內(nèi)過度沉積導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生，豬血清建立 的大鼠免疫性肝纖維化模型肝纖維化持久且致纖維化的過程中對(duì)肝細(xì)胞損傷較小，并且該 動(dòng)物模型形成較穩(wěn)定，其分子機(jī)制與人類肝纖維化有一定相似性，因而，是研究肝纖維化較 理想的動(dòng)物模型。目前，臨床對(duì)免疫性肝纖維化的治療仍沒有明確的方案和有效治療藥物。 近些年來，國(guó)內(nèi)外大量研究表明天然藥物和中藥在治療免疫性肝纖維化方面顯示出了可靠 療效和較少不良反應(yīng)的特點(diǎn)。因此采用現(xiàn)代化技術(shù)從天然藥物和中藥中開發(fā)治療免疫性肝 纖維化的新藥具有重要意義。
[0004] 滿天星(Gypsophila elegans Bieb)，又名絲石竹、霞草等，是石竹科石頭花屬植 物[1 ]，是廣西壯民族地區(qū)抗肝臟疾病習(xí)用草藥，其主要活性成分之一滿天星異葒草苷 (isoorientin-2〃-〇-a-L_arabinopyranosyl，Ι0Α)對(duì)豬血清誘導(dǎo)的肝損傷的作用尚無報(bào) 道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是從天然藥物和中藥中開發(fā)治療免疫性肝纖維化的新藥，挖掘草藥 滿天星的新用途。
[0006] 本發(fā)明是基于發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)研究而完成的。研究分兩大部分： 一、滿天星異葒草苷的制備 提取方法:干燥的滿天星10 kg粉碎后，用80L的75%乙醇回流提取3次，合并3次乙醇提 取液，回收乙醇，得到乙醇提取物315.7g。乙醇提取物加入630ml蒸餾水搖勻成懸浮液，接著 分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，萃取方法簡(jiǎn)述如下：首先，用630ml石油醚萃取， 棄石油醚液;接著，用630ml乙酸乙酯萃取，棄乙酸乙酯液;最后，用630ml正丁醇萃取，回收 正丁醇，得正丁醇萃取物177.6 g。
[0007] 純化方法：正丁醇萃取物上D101型大孔樹脂，先用5倍量水洗脫后，再用10倍量 90%的甲醇洗脫，回收甲醇，得粗提物。將粗提物溶于甲醇，與等量硅膠拌樣，上樣于硅膠 柱，以甲醇-乙酸乙脂-水不同比例即3:3:2; 4:3:2; 5:3:2; 6:3:2;7:3:2 ;8:3:2;9:3:2; 10:3:2，進(jìn)行梯度洗脫。薄層色譜跟蹤，合并相似餾分。合并用比例為4:3:2; 5:3:2; 6:3:2; 7:3:2的甲醇-乙酸乙脂-水洗脫的餾分，再經(jīng)3次硅膠柱層析后再次合并相似餾分，回收洗 脫劑，得淡棕色結(jié)晶28.3 mg。
[0008] 二、滿天星異葒草苷治療免疫性肝纖維化藥效學(xué)實(shí)驗(yàn) 將SD雄性大鼠以豬血清誘導(dǎo)大鼠免疫性肝纖維化模型，觀察滿天星異葒草苷治療免疫 性肝纖維化的作用。結(jié)果表明滿天星異葒草苷能明顯降低肝組織白細(xì)胞介素-l(IL-l)，人 腫瘤壞死因子-a(TNF-a)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子jl(TGF-m)，升高白細(xì)胞介素-IO(IL-IO)，含量， 降低肝組織及血清丙二醛(MDA)的水平，顯著提高肝組織及血清超氧化物歧化酶(S0D)的活 性，提示滿天星異葒草苷具有抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的作用;此外，滿天星異葒草苷可明顯降低 血清透明質(zhì)酸(HA)，層粘連蛋白（LN)，羥脯氨酸(Hyp)，ΙΠ 型前膠原氨基端肽(ΡΙΠΝΡ)，I型膠 原(Col-I)，IV型膠原(Col-IV)的含量，說明滿天星異葒草苷具有抑制膠原沉積的作用。
[0009] 通過病理學(xué)檢查顯示，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰且完整，肝細(xì)胞索以中央靜脈 為中心，向四周呈放射狀排列，肝細(xì)胞未見變性、無炎細(xì)胞浸潤(rùn)，未見病理性改變，只有極 少量細(xì)小的藍(lán)色纖維。模型組大鼠匯管區(qū)炎性細(xì)胞、壞死細(xì)胞增多，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞 索排列紊亂，纖維間隔增厚，成纖維細(xì)胞大量增生，大量纖維生成，并可見假小葉形成。滿天 星異葒草苷組大鼠可觀察到肝組織病理損傷比模型模型組明顯減輕。
[0010] 免疫組化法測(cè)定大鼠肝細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-KB p50(NF-KB p50)、TNF-a、基質(zhì)金屬蛋 白酶-9(MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-Ι(??ΜΡ-Ι)和細(xì)胞間粘附分子-l(ICAM-l)的表達(dá)， 結(jié)果表明，與模型組比較，滿天星異葒草苷可明顯抑制NF-kB p50蛋白、ICAM-1、HMP-1、 TNF-a蛋白的表達(dá)，升高M(jìn)MP-9蛋白的表達(dá)。
[0011] RT-PCR法檢測(cè)肝組織I型膠原（c〇i-i)、m型膠原（c〇i-m)、細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-κΒ P65(NF-kB ρ65)、核因子κΒ抑制蛋白a亞基（ΙκΒ-α)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-01(TGF_m)mRNA的表 達(dá)，結(jié)果表明，與模型組比較，滿天星異葒草苷可明顯抑制(：〇1-1、(：〇1-111、冊(cè)-仙？65、1仙- a、TGF-m mRNA 的表達(dá)。
[0012] Western blot法檢測(cè)肝組織NF-κΒ p65、磷酸化NF-κΒ p65、NF_KB ρ50、ΙκΒ_α、磷 酸化ΙκΒ-α、核因子κΒ抑制物激酶β(ΙΚΚ-β)、Col_I蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，與模型組比較，滿 天星異葒草苷可明顯抑制肝組織NF-κΒ p65、磷酸化NF-κΒ P65、NF-kB ρ50、ΙκΒ-α、磷酸化I κΒ-a、ΙΚΚ-β、Co 1 -1 蛋白的表達(dá)。
[0013] 結(jié)論:滿天星異葒草苷可應(yīng)用于治療免疫性肝臟炎癥;滿天星異葒草苷可應(yīng)用于 治療免疫性慢性肝損傷;滿天星異葒草苷可應(yīng)用于治療免疫性肝纖維化。
[0014]總之，本發(fā)明首次對(duì)滿天星異葒草苷治療免疫性肝損傷進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)表明，滿 天星異葒草苷可作用于免疫性肝損傷的多個(gè)環(huán)節(jié)或多個(gè)靶點(diǎn)，主要通過NF-κΒ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通 路達(dá)到作用?？捎行У囊种浦|(zhì)過氧化反應(yīng)、減輕肝組織病理損傷、抑制膠原沉積、調(diào)芐基 質(zhì)金屬蛋白酶的活性、阻斷NF-κΒ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使肝損傷明顯減輕，對(duì)防治肝損傷具有獨(dú) 特優(yōu)勢(shì)。滿天星異葒草苷對(duì)豬血清引起的肝損傷具有明顯抑制作用，是治療免疫性肝纖維 化的一種非常有潛在價(jià)值的新藥。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 一、滿天星異葒草苷的制備 提取方法:干燥的滿天星10 kg粉碎后，用80L的75%乙醇回流提取3次，合并3次乙醇提 取液，回收乙醇，得到乙醇提取物315.7g。乙醇提取物加入630ml蒸餾水搖勻成懸浮液，接著 分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，萃取方法簡(jiǎn)述如下：首先，用630ml石油醚萃取， 棄石油醚液;接著，用630ml乙酸乙酯萃取，棄乙酸乙酯液;最后，用630ml正丁醇萃取，回收 正丁醇，得正丁醇萃取物177.6 g。
[0016] 純化方法：正丁醇萃取物上D101型大孔樹脂，先用5倍量水洗脫后，再用10倍量 90%的甲醇洗脫，回收甲醇，得粗提物。將粗提物溶于甲醇，與等量硅膠拌樣，上樣于硅膠 柱，以甲醇-乙酸乙脂-水不同比例即3:3:2; 4:3:2; 5:3:2; 6:3:2;7:3:2 ;8:3:2;9:3:2; 10:3:2，進(jìn)行梯度洗脫。薄層色譜跟蹤，合并相似餾分。合并用比例為4:3:2; 5:3:2; 6:3:2; 7:3:2的甲醇-乙酸乙脂-水洗脫的餾分，再經(jīng)3次硅膠柱層析后再次合并相似餾分，回收洗 脫劑，得淡棕色結(jié)晶28.3 mg。
[0017] 光譜檢測(cè)數(shù)據(jù)：ESI-MS(m/z):604[M+Na] + ; 1H 匪R (500 MHz，CD30D) δ: 7.33 (lH，s，H-2'），7.30 (lH，d， J = 8.0 Hz，H-6'），6.87(lH，d，J = 8.0 Ηζ，Η-5'），6·47 (1Η， s，H-3)，6.41(lH，s，H-8)，4.99 (lH，d，J = 9.5 Hz，H-l〃），4.37 (1H，J = 5.5 Hz，H-Γ''）； 13C 匪R(125 MHz， CD30D)S: 166.7 (C-2)，104.2 (C-3)，184.4 (C-4)，159.2 (C-5)，109.3(C-6)，165.9(C-7)，95.2(C-8)，163.1(C-9)，105.4(C-10)，123.3(C-1，），114.3(C-2，），147.1(C-3，），151.5(C-4，），117.6(C-5，），120.6(C-6，），73.4(C-1〃），82.5(C-2〃），74.3(C-3〃），73.5(C-4〃），82.9(C-5〃），63.4(C-6〃），107.4(C-Γ''），72·2 (C-2'''），80.8 (C-3'''），69.1 (C-4'''），67.2 (C-5'''）。最后鑒定為:異葒 草苷-2〃- 〇-α- L_阿拉伯糖（isoorientin-2〃-〇-a-L-arabinopyranosyl)，簡(jiǎn)稱滿天星異 葒草苷，其分子式為C26015H28，分子量為580.48。
[0018] 二、滿天星異葒草苷治療免疫性肝損傷藥效學(xué)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)方案： (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備、分組及處理 90只雄性SD大鼠，（120 ± 20g)，SPF級(jí)，隨機(jī)分為2組:造模組75只，正常組15只。造模組 大鼠采用豬血清腹腔注射每只0.5ml，造成免疫性肝纖維化模型，正常對(duì)照組腹腔注射等量 的生理鹽水，每周2次，連續(xù)注射16周。分別于造模后12周和16周末，抽取肝纖維化大鼠及正 常對(duì)照組大鼠，進(jìn)