專利名稱：冷凍干燥的抗原組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改進的抗原組合物和使用其制備免疫原性組合物的方法。尤其是，本發(fā)明涉及包含抗原和Toll樣受體(TLR)9激動劑的冷凍干燥組合物。這種組合物可以與載體重新構(gòu)建到免疫原性組合物中用于接種疫苗，載體選自由脂質(zhì)體、無機鹽、乳液、聚合物和ISCOMs組成的顆粒載體。用本發(fā)明的冷凍干燥組合物來制備免疫原性組合物的方法和其在免疫中的用途也是本發(fā)明的一部分。

背景技術(shù)：
佐劑(adjuvant)有時用于提高對任何給定抗原產(chǎn)生的免疫應答。然而，在疫苗或免疫原性組合物中包含佐劑會提高組分制備的復雜性、以及提高疫苗組合物的分布和制劑的復雜性。每個佐劑組分以及抗原組分的制備必須由配方者來考慮。這是尤其真實的，因為例如佐劑組分在溶液中的pH值可能與給定抗原的最佳pH值差別很大，需要小心地控制這些差別，并且設(shè)法防止例如組分的沉淀或合乎需要的性質(zhì)的喪失?？乖谧⑸溆盟械膒H值可以是例如大約pH7或稍微高一些，并且當加入佐劑時，pH值可以降到pH6.3。當在此pH值下長期保存時，抗原可能例如是不穩(wěn)定的。
然后必須以盡可能穩(wěn)定的形式來配制和分布組分，因為人用藥物在它們被批準上市之前必須被較好地表征、必須是穩(wěn)定的和安全的。為此，對最終的制劑必須進行長期穩(wěn)定性研究，以保證它符合相關(guān)的標準。將在這種長期研究中產(chǎn)生的信息用以支持提交給管理機構(gòu)，例如FDA(聯(lián)邦藥品管理局-在美國負責批準藥物的機關(guān))，以便證明該產(chǎn)品適合于人類使用。
通常使用凍干或冷凍干燥，以提高材料(包括藥學材料，例如疫苗中使用的抗原)的穩(wěn)定性，并由此增加保存期限。
通常，在給予患者之前不久，將冷凍干燥的抗原組合物提供給衛(wèi)生保健部門，使其與稀釋劑(例如注射用水[WFI]，或在有些情況下與液體佐劑制劑)進行重新構(gòu)建。用這種方法，最終疫苗的各種組分維持在非常接近的時間段被減至最小。
當將抗原冷凍干燥形成冷凍(lyo)塊(冷凍干燥的干燥產(chǎn)品)時，必須考慮許多因素。例如，在冷凍干燥形式中應該保持抗原的抗原性/免疫原性。當在冷凍干燥形式時，抗原不能團聚或降解。冷凍塊必須成形良好，并且不斷裂。最后，當重新組成時，當然抗原必須是能夠快速溶解的形式。如果用于重新組成的溶液不是簡單的WFI，例如當抗原與液體佐劑重新組成時，那么需要考慮溶液組分對重新組成產(chǎn)品性質(zhì)的影響。
如所提到的，佐劑已經(jīng)使用了多年，用于提高對疫苗的抗原成分的免疫應答。尤其有效的佐劑組合是包含3脫酰-單磷酰脂質(zhì)A(3D-MPL)和皂草苷的佐劑組合(尤其是QS21，從皂樹的樹皮提取的皂角苷純化餾份)?？梢砸运腿榛?、脂質(zhì)體制劑等等形式提供這種組合物。
在先前對抗原的臨床試驗中，例如對瘧疾抗原例如RTS，S的試驗，提供了冷凍干燥抗原，還提供了單獨的液體佐劑的管瓶，液體佐劑例如MPL和QS21的水包油型制劑，或MPL和QS21的脂質(zhì)體制劑，用于抗原的重新組成。在給予之前不久，將個別組分合并，形成最終的疫苗組合物。
含有未甲基化的CpG二核苷酸(“CpG”)的某些免疫刺激寡核苷酸是TLR9配體，并且當通過系統(tǒng)和粘膜途徑給予時，已經(jīng)將其確定為佐劑(WO 96/02555，EP 468520，Davis等人，J.Immunol，1998，160(2)870-876；McCluskie and Davis，J.Immunol.，1998，161(9)4463-6)。CpG是存在于DNA中的胞嘧啶-鳥苷二核苷酸基序的縮寫。歷史上，人們觀察到BCG的DNA片段可以產(chǎn)生抗腫瘤效果。在進一步研究中，證明衍生自BCG基因序列的合成寡核苷酸能夠引起免疫刺激效果(體外和體內(nèi)兩者)。這些研究的發(fā)起人推斷，某些回文序列(包括中心CG基序)攜帶這種活性。CG基序在免疫刺激中的中心作用后來在出版物(Krieg，Nature 374，p546 1995)中得到了闡明。詳細分析表明，CG基序必須在某一序列范圍內(nèi)，而且這種序列在細菌DNA中是常見的，但在脊椎動物的DNA中卻很稀少。免疫刺激序列通常是嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶；其中二核苷酸CG基序不是甲基化的，但已知其它未甲基化的CpG序列是免疫刺激的，并且可以在本發(fā)明中使用。
還已經(jīng)表明，當鳥苷變異為7-去氮鳥苷基序時，免疫刺激寡核苷酸可以保持免疫活性(WO 03057822)。
認為這種免疫刺激寡核苷酸在溶液中具有酸性pH值，例如低于pH7，例如6.3、6.1或更低。這可以使它們難以結(jié)合進液體疫苗制劑中，因為它們與制劑中的其它組分不相似。正如所討論的那樣，這可以導致沉淀和/或長期穩(wěn)定性問題。
人們認為，這些免疫刺激寡核苷酸很可能是很有效的佐劑，尤其當與現(xiàn)有的佐劑組合物例如3D-MPL和QS21組合使用時。人們期望，這種佐劑可以在迄今為止很難提供有效疫苗的疾病中使用，例如HIV、癌和可能的瘧疾。
可以用許多不同的方式將佐劑包含在疫苗中，必須以不影響本身或抗原組合物的穩(wěn)定性的方式來包含它們，以及以不會對重新組成疫苗的保健行業(yè)造成過度負擔的方式包含它們。獲得這種結(jié)果的最簡單方式是將其它組分放到其它管瓶中，以使它們保持分離，直至臨到重新組成之前為止，由此使組分可以彼此影響的時間最小化。這意味著抗原和免疫刺激寡核苷酸將各自提供于單獨的管瓶中。然后，如果使用其它佐劑組分例如MPL和QS21，可以將這些以液體混合物的形式提供于第三個管瓶中。然而，在以增加數(shù)量的管瓶的方式增加組分數(shù)量，會引起成本、消耗的提高，且重要的是，增加了組成期間出現(xiàn)差錯的可能性。
本發(fā)明概述 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當TLR9配體例如CpG免疫刺激寡核苷酸作為佐劑而是免疫原性組合物的一部分時，可以將所述TLR9配體與抗原一起冷凍干燥，這樣就可以提供包含抗原和TLR9配體佐劑合并在一個凍干塊中的單一管瓶。
本發(fā)明因此提供了包含抗原和TLR9激動劑的冷凍干燥組合物。在一個實施方案中，所述TLR9激動劑是免疫刺激寡核苷酸，可能是包含CpG的寡核苷酸。在一方面，所述包含CpG的寡核苷酸包含嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶序列。在另一個方面，所述免疫刺激寡核苷酸選自SEQ ID NO1；SEQ ID NO2；SEQ ID NO3；SEQ ID NO4；和SEQ IDNO5。
雖然不希望受理論所束縛，但人們認為，與簡單地向MPL和QS21的液體制劑中加入TLR9相比，將抗原和TLR9激動劑在一起提供，可以提供更穩(wěn)定的組分。
本發(fā)明提供了下列優(yōu)點在抗原和TLR9激動劑與WFI進行重新構(gòu)建的情況下，可以提供僅僅一個管瓶，在其中含有冷凍干燥制劑。此外，在抗原和TRL9激動劑與液體制劑例如液體佐劑制劑進行重新構(gòu)建的情況下，那么它具有能夠僅僅提供兩個組分管瓶(而不是三個)的優(yōu)點。這反過來具有成本效益，同時，一旦重新構(gòu)建，可提供適合于使用疫苗的產(chǎn)品。
此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將CpG與抗原(其在重新構(gòu)建緩沖液中不會總體上具有正電荷)共同冷凍干燥，當與注射用水或液體佐劑重新構(gòu)建時，可以提高那些抗原的溶解性。因此，本發(fā)明還提供了提高冷凍干燥的抗原在重新構(gòu)建時的溶解性的方法，其中抗原在重新構(gòu)建緩沖液中不會具有凈正電荷，該方法包括下列步驟將TLR9激動劑、優(yōu)選免疫刺激寡核苷酸、且更優(yōu)選CpG寡核苷酸與抗原共同冷凍干燥。本發(fā)明還提供了TLR9激動劑、優(yōu)選免疫刺激寡核苷酸、且更優(yōu)選CpG寡核苷酸提高冷凍干燥的非帶正電荷的抗原在重新構(gòu)建時的溶解性的用途?！胺菐д姾傻摹笔侵傅鞍椎目傠姾刹皇钦娦浴５鞍卓梢园撾姾?，但蛋白的總電荷是中性或負性。
本發(fā)明還提供了制備免疫原性組合物的方法，該方法包括下面的步驟將本文所描述的冷凍干燥組合物與合適載體進行重新構(gòu)建。在一個實施方案中，所述載體是脂質(zhì)體溶液或水包油乳化液。所述載體可以任選包含一或多種免疫刺激劑，免疫刺激劑可以選自TLR4激動劑，TLR4拮抗劑，皂草苷，TLR7激動劑，TLR8激動劑，TLR9激動劑。在一個實施方案中，所述載體包含兩種或多種免疫刺激劑，且在一方面，這些可以是3-脫酰MPL和QS21。
本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明的冷凍干燥組合物的方法，該方法包括將一或多種目標抗原、TLR9配體和合適賦形劑混合，并將得到的混合物冷凍干燥。
本發(fā)明的詳細說明 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，TLR9配體例如CpG寡核苷酸可以與使人感興趣的抗原一起冷凍干燥，不會影響該抗原的抗原性或穩(wěn)定性。TLR9配體是指可以與TLR9受體相互作用的化合物。Toll樣受體(TLR)家庭的成員(首先在果蠅中發(fā)現(xiàn))已經(jīng)證明是模式(pattern)識別受體，每個成員可以辨別不同的微生物組分并且對其做出反應，以限制/消滅入侵的微生物。病原體相關(guān)分子模式(PAMP)與TLRs的結(jié)合，可以引起反應性氧和氮中間體的產(chǎn)生，引發(fā)前炎癥性細胞因子網(wǎng)絡，并且將連接快速先天響應與獲得性免疫的共同刺激性分子上調(diào)。已經(jīng)知道許多TLR配體可以用作佐劑。已經(jīng)表明，TLR9可以對寡核苷酸激動劑做出反應。因此，本發(fā)明的TLR9配體是免疫刺激寡核苷酸。在本發(fā)明的一個實施方案中，這種TLR9配體包含CpG基序。替代性的免疫刺激寡核苷酸可以包括核苷酸的變體。例如，WO0226757和WO03057822公開了對包含CpG的免疫刺激寡核苷酸的C和G部分進行的修飾。
在一個實施方案中，TLR9配體是CpG寡核苷酸。在該實施方案的一方面，CpG寡核苷酸包含兩個或多個二核苷酸CpG基序，其被至少三個、可能至少六個或更多個核苷酸所分開。本發(fā)明的寡核苷酸典型地是脫氧核苷酸。在一個實施方案中，寡核苷酸中的核苷酸間鍵合是二硫代磷酸酯鍵，或可能是硫代磷酸酯鍵，不過還可以使用磷酸二酯及其它核苷酸間鍵合，包括具有混合核苷酸間鍵合的寡核苷酸。制備硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述在US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204中。還包括含有不同的核苷酸間鍵合的寡核苷酸，例如混合的硫代磷酸磷酸二酯。可以使用能夠穩(wěn)定寡核苷酸的其它核苷酸間鍵合。
CpG寡核苷酸的例子具有下面的序列。在一個實施方案中，這些序列包含硫代磷酸酯改性的核苷酸間鍵合。
OLIGO 1(SEQ ID NO1)TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826) OLIGO 2(SEQ ID NO2)TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758) OLIGO 3(SEQ ID NO3)ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG OLIGO 4(SEQ ID NO4)TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006) OLIGO 5(SEQ ID NO5)TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668) 替代性的CpG寡核苷酸可以包含上面的序列，在其中它們具有不重要的缺失或填加。
在本發(fā)明中使用的CpG寡核苷酸可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法(例如EP 468520)來合成。這種寡核苷酸可以使用自動合成器來方便地合成。
在本說明書的范圍內(nèi)，術(shù)語“抗原”指的是適合于提高特異性免疫應答和適合于包含到疫苗或免疫原性組合物中的免疫原性組分，例如用于包含在HIV-1疫苗、癌疫苗、瘧疾疫苗、TB疫苗等等中的抗原。具體抗原詳述如下。
在一個實施方案中，抗原具有9.6或更小的等電點。在一個實施方案中，抗原具有9或更小的等電點。在一個實施方案中，抗原具有8.5或更小的等電點。在一個實施方案中，抗原具有8.0或更小的等電點。在一個實施方案中，抗原具有7.5的等電點。在一個實施方案中，抗原具有范圍7至8的等電點。
當在緩沖液中重新構(gòu)建時，蛋白的凈電荷取決于蛋白中的正電荷數(shù)目相對于負電荷數(shù)目，這種電荷當然會根據(jù)重新構(gòu)建緩沖液的pH值來變化，等電點是蛋白的凈電荷是中性時的pH值。如果重新構(gòu)建緩沖液的pH值低于抗原的等電點，蛋白趨向于攜帶凈的正電荷。如果重新構(gòu)建緩沖液的pH值大于抗原的等電點，蛋白趨向于攜帶凈的負電荷。本發(fā)明在冷凍干燥和重新構(gòu)建符合下列條件的抗原時是尤其有用的該抗原在預定的重新構(gòu)建緩沖液中具有可以使蛋白攜帶凈負電荷的等電點。在這種情況(參見實施例3)下，在冷凍干燥組合物中存在CpG就可以增加抗原在重新構(gòu)建緩沖液中的溶解性。
在一個實施方案中，冷凍干燥的抗原和TLR9激動劑以一個劑量的形式提供在例如一個管瓶中。
在一個實施方案中，冷凍干燥抗原的存在數(shù)量應該在重新構(gòu)建時能夠提供10至250μg范圍內(nèi)的抗原濃度。
在一個實施方案中，TRL9激動劑的存在數(shù)量應該在重新構(gòu)建時能夠提供10至1000μg范圍內(nèi)例如500μg的濃度。
在本發(fā)明的一個實施方案中，與TLR9配體結(jié)合在冷凍干燥組合物中的抗原可以是腫瘤抗原。因此，使用本發(fā)明的冷凍干燥抗原組合物制備的免疫原性組合物可有效用于癌的免疫治療。例如，可以用本文所描述的癌抗原、腫瘤抗原或腫瘤排斥抗原來制備冷凍干燥組合物，例如，在前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、腎癌、卵巢癌、肝癌和頭與頸癌(還有其它的)中表達的那些蛋白。
可以在本發(fā)明中使用的癌睪丸抗原包括抗原的MAGE A家族MAGE-A1，A2，A3，A4，A5，A6，A7，A8，A9，A10，A11和A12；亦稱為MAGE-1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12)，MAGE B抗原MAGE B1，B2，B3和B4，MAGE C抗原MAGE-C1和MAGE-C2，LAGE 1抗原，LAGE 2抗原(亦稱為NY-ESO-1)和GAGE抗原。
在本發(fā)明中還可以使用前列腺特異性抗原。可以融合的前列腺特異性抗原的例子包括前列腺的六個跨膜上皮抗原(STEAP)，前列腺特異性抗原(PSA)，前列腺酸性磷酸酶(PAP)，前列腺干細胞抗原(PSCA)，前列腺特異性膜抗原(PSMA)或被稱為前列腺酶的抗原(亦稱為P703P)。
在一個實施方案中，前列腺抗原是P501S或其片段。P501S(還稱為prostein)是553個氨基酸的蛋白。包含至少20、50或100個連續(xù)氨基酸的P501S的免疫原性片段和部分、或包含20-50或50-100個之間的連續(xù)氨基酸的片段可以用作本發(fā)明的腫瘤相關(guān)的抗原或衍生物。在一個實施方案中，腫瘤相關(guān)的抗原或衍生物是PS108抗原(公開在WO98/50567中)或前列腺癌相關(guān)的蛋白(參見WO99/67384)。在一些實施方案中，片段是全長P501S蛋白的氨基酸51-553、34-553或55-553。這些可以在酵母系統(tǒng)中表達，例如編碼這種多肽的DNA序列可以在酵母系統(tǒng)中表達。
在一個實施方案中，抗原可以包含或由WT-1(由Wilm′s腫瘤基因表達)或它的N端片段WT-1F(大約或大致包含氨基酸1-249)組成。WT1是最初發(fā)現(xiàn)在兒科腎癌(Wilm′s腫瘤)中被過度表達的蛋白?？梢允褂玫目乖ㄗ鳛榭乖咏L的蛋白。在一個實施方案中，抗原可以包含或由WT1-A10蛋白(其是292 AA重組融合蛋白，由WT1序列的12mer截短的tat序列和氨基酸編號2-281組成)組成。
在本發(fā)明的一個實施方案中，腫瘤相關(guān)的抗原或衍生物是乳癌抗原，例如Her-2/neu，乳腺球蛋白或B305D抗原。
用于本發(fā)明的Her-2/neu抗原可以包括整個胞外域(ECD；例如大致包含Her-2/neu的氨基酸序列的氨基酸1-645的序列)或其片段。或者或另外，該構(gòu)成可以包含至少或整個胞內(nèi)區(qū)域的免疫原性部分例如Her-2/neu序列的大約C端580氨基酸。
可以用作本發(fā)明的腫瘤相關(guān)的抗原衍生物的一種構(gòu)成是ECD的融合蛋白和Her-2/neu的磷酸化區(qū)域(PD)(ECD-PD)。可以使用的其它構(gòu)成是ECD的融合蛋白和Her-2/neu的磷酸化區(qū)域的片段(ECD-ΔPD)。所描述的Her-2/neu融合蛋白和構(gòu)成可以衍生自人、大鼠、小鼠或猿/猴子的Her-2/neu。Her-2/neu的示范性的序列和構(gòu)成描述在WO00/44899中。
PRAME(亦稱DAGE)是可以用作本發(fā)明的腫瘤相關(guān)的抗原的另一種抗原。還可以使用包含PRAME抗原的本文所描述的融合蛋白。尤其是，本文所描述的PRAME抗原的融合物和本文所描述的蛋白D融合伙伴蛋白或衍生物可以在本發(fā)明中使用。
通過一些群組已經(jīng)表明PRAME抗原可以在黑素瘤和很多種腫瘤(包括肺、腎和頭和頸癌)中表達。有趣的是，它看來還可以在40-60％的血癌例如急性淋巴細胞性白血病和急性骨髓性白血病中表達，參見例如Exp Hematol.2000 Dec；28(12)1413-22。已經(jīng)在患者中觀察到，同沒有過度表達該蛋白的患者相比較，PRAME的過度表達似乎與較高的存活率和較低的惡化速度有關(guān)。
抗原和其制備描述在美國專利US 5，830,753中。在Annotated HumanGene Database H-Inv DB中的下列登錄號項下可以發(fā)現(xiàn)PRAME U65011.1，BC022008.1，AK129783.1，BC014974.2，CR608334.1，AF025440.1， CR591755.1，BC039731.1，CR623010.1，CR611321.1，CR618501.1，CR604772.1， CR456549.1，和CR620272.1。
在一方面，本發(fā)明的抗原可以包含PRAME抗原或其免疫原性片段或由其組成。通常，PRAME蛋白具有509個氨基酸，和在一個實施方案中，PRAME的所有509個氨基酸可以包括在抗原中。
結(jié)腸直腸抗原也可以用作本發(fā)明的腫瘤相關(guān)的抗原?？梢允褂玫慕Y(jié)腸直腸抗原的例子包括C1585P(MMP 11)和C1491(E1A EnhancerBinding Protein)，CASB618(如WO00/53748所述)；CASB7439(如WO01/62778所述)；和C1584(Cripto)。
用于本發(fā)明范圍的其它腫瘤相關(guān)的抗原包括Plu-1 J Biol.Chem274(22)15633-15645，1999，HASH-1，HASH-2，Cripto(Salomon等人Bioessays 199，2161-70，美國專利US5654140)Criptin美國專利US5981215。另外，尤其與癌治療所用疫苗相應的抗原還包含酪氨酸酶和存活素。
粘蛋白衍生的肽例如Muc1，參見例如US 5744,144、US 5827,666、WO 8805054、US 4,963,484。具體包括的是Muc 1衍生的肽，其包含Muc 1肽的至少一個重復單元，優(yōu)選至少兩個這種重復單元，并且可以通過SM3抗體來對其進行識別(US 6054438)。其它粘蛋白衍生的肽包括得自于Muc 5的肽。
其它腫瘤特異性抗原適合于在本發(fā)明的冷凍干燥組合物中使用，并且包括但不局限于腫瘤特異性神經(jīng)節(jié)糖苷，例如GM2和GM3或其與載體蛋白的共軛物；或所述抗原可以是自身肽激素，例如全長促性腺激素釋放因子(GnRH，WO 95/20600)，短的10個氨基酸長度的肽，用于治療許多癌，或用于免疫去勢。
在本發(fā)明的方面中，本發(fā)明還延伸至上述抗原、免疫原性衍生物和免疫原性片段和包含其的融合蛋白的用途。
衍生物、片段和融合蛋白 可以以衍生物或其片段(而不是天然存在的抗原)形式使用本發(fā)明的腫瘤相關(guān)的抗原。
本文使用的術(shù)語“衍生物”是指相對于其抗原的天然存在形式進行改性的抗原。衍生物可以包括突變，例如點突變。在一個實例中，衍生物可以改變蛋白的性質(zhì)，例如通過在原核系統(tǒng)中提高表達，或通過除去不合需要的活性，例如酶活性。本發(fā)明的衍生物與天然抗原十分類似，從而保持了抗原的性質(zhì)，并且保持能夠提高針對天然抗原的免疫應答。不管所給定衍生物是否能夠提高免疫應答，這種免疫應答都可以用適合的免疫試驗來測定，例如ELISA或流式細胞術(shù)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的腫瘤相關(guān)抗原的衍生物是包含與異源融合伙伴蛋白相聯(lián)接的腫瘤相關(guān)抗原的融合蛋白。有關(guān)與腫瘤相關(guān)抗原的“異源”，是用來描述一種蛋白或多肽序列，其實際上不會與腫瘤相關(guān)的抗原連接，即通過故意的人為干預與腫瘤相關(guān)抗原連接。
抗原和異源融合伙伴蛋白在化學上可以是共軛物，或可以表示為重組融合蛋白。在一個實施方案中，相比于非融合蛋白，本發(fā)明的融合蛋白可以使表達系統(tǒng)中所產(chǎn)生的融合蛋白的水平提高。由此，融合伙伴蛋白可以幫助提供T輔助表位，例如，人能夠識別的T輔助表位(即，融合伙伴蛋白充當免疫融合伙伴)。與天然重組蛋白質(zhì)相比，融合伙伴可以有助于高產(chǎn)率地表達蛋白(即，融合伙伴蛋白充當表達增強劑)。在一個實施方案中，融合伙伴蛋白可以充當免疫融合伙伴和表達增強伙伴二者。
融合伙伴蛋白可以例如源自于蛋白D。蛋白D是一種脂蛋白(暴露在革蘭氏陰性細菌流感嗜血桿菌表面上的42kDa免疫球蛋白D結(jié)合蛋白)。以具有18個氨基酸殘基信號序列(包含對于細菌脂蛋白的交感序列)的前體物形式合成該蛋白(參見WO 91/18926)。天然前體蛋白D蛋白是在分泌和信號序列斷裂期間加工的。加工的蛋白D的Cys(在前體物分子中的19位)變成所加工蛋白的N末端殘基，并且伴隨有通過酯連接的和酰胺連接的脂肪酸兩者的共價連接所造成的改性。然后，與氨基-端部半胱氨酸殘基連接的脂肪酸起到膜固著點的作用。
在一個實施方案中，用于本發(fā)明的腫瘤相關(guān)的抗原衍生物可以包含蛋白D或其衍生物作為融合伙伴蛋白。
本文所描述的蛋白D或其衍生物可以包含例如加工蛋白D的第一個或N端第三個，或加工蛋白D的近似地或大約第一個或N端。在一個實施方案中，蛋白D或其衍生物可以包含加工蛋白D的第一個或N端第100至115個氨基酸；或加工蛋白D的第一個或N端第109個氨基酸。在一個實施方案中，天然的加工蛋白D氨基酸2-Lys和2-Leu可以用氨基酸2-Asp和3-Pro代替。
在一個實施方案中，蛋白D或其衍生物可以進一步包括前體蛋白D的第18或19個氨基酸信號序列。在一個實施方案中，衍生自蛋白D的融合伙伴蛋白包含前體蛋白D的氨基酸20至127或由其組成。在本發(fā)明的一個實施方案中，前體蛋白D融合伙伴蛋白的兩個氨基酸21-Lys和22-Leu可以用氨基酸21-Asp和22-Pro代替。
當與野生型前體物或加工蛋白D序列相比時，本文所描述的蛋白D融合伙伴蛋白可以在氨基酸序列之內(nèi)另外替代性地包括缺失、取代或嵌入。在一個實施方案中，可以嵌入、取代或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多個氨基酸。氨基酸可以用本文所定義的保守性置換來替代，或可以使用其它氨基酸。
在一個實施方案中，融合伙伴蛋白可以包含如SEQ ID NO1所示的蛋白D序列或由其組成。在一個實施方案中，融合伙伴蛋白可以包含

圖1中帶下劃線的氨基酸或由其組成，即SEQ ID NO12的氨基酸殘基20至127。在一個實施方案中，用于本發(fā)明的抗原可以是蛋白-D-MAGE-3，其中MAGE-3抗原由MAGE-3的氨基酸3至314組成，且其中蛋白D融合伙伴蛋白由示于圖1中的氨基酸序列組成。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，融合伙伴蛋白可以選自如下所述的NS1或LytA或它們的衍生物。
NS1是得自于流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。在一個實施方案中，本發(fā)明的腫瘤相關(guān)的抗原衍生物可以包含NS1或其衍生物作為融合伙伴蛋白。NS1或其衍生物可以包含其N端1至81氨基酸。
LytA源自于肺炎鏈球菌。LytA蛋白的C端區(qū)域負責與膽堿或與一些膽堿類似物例如DEAE的親合性。在一個實施方案中，本發(fā)明的腫瘤相關(guān)的抗原衍生物可以包含LytA或其衍生物作為融合伙伴蛋白。LytA或其衍生物可以包含LytA分子的重復部分，LytA分子可在起始于殘基178的C末端中發(fā)現(xiàn)。在一個實施方案中，LytA或其衍生物包含C-LytA的殘基188-305。
用于本發(fā)明的免疫原性多肽典型地是重組蛋白，其是例如通過在異源宿主例如在細菌宿主中、在酵母或在培養(yǎng)的哺乳動物細胞中表達而產(chǎn)生的。
術(shù)語“腫瘤相關(guān)抗原衍生物”是指多肽，其部分地或完全包含天然出現(xiàn)在腫瘤相關(guān)抗原中的序列，或其攜帶與其高度的序列同一性(例如，超過至少10例如至少20個氨基酸的伸長時，具有95％以上的同一性)。衍生物還包括具有保守置換的序列。保守置換是眾所周知的，并且在順序排列計算機程序中通常建立成默認計分陣列。
一般地說，在下面的組之內(nèi)的替換是保守置換，但認為在下面的組之間的替換是非保守置換。基團是 i)天冬氨酸/天冬酰胺/谷氨酸/谷氨酰胺 ii)絲氨酸/蘇氨酸 iii)賴氨酸/精氨酸 iv)苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸 v)亮氨酸/異亮氨酸/纈氨酸/甲硫氨酸 vi)甘氨酸/丙氨酸 本發(fā)明的衍生物還可以包括化學處理的序列，例如用醛(例如甲醛或戊二醛)處理，羧甲基化，羧酰胺化，乙?；捌渌Ｒ?guī)化學處理。在本發(fā)明中，還可以使用具有衍生化的游離硫醇殘基的本發(fā)明的構(gòu)成。尤其是可以使用羧酰胺化的或羧甲基化的硫醇衍生物。
在本發(fā)明的一個實施方案中，腫瘤相關(guān)抗原衍生物可以是本文所描述的、具有衍生化的游離硫醇殘基的MAGE抗原。衍生化的游離硫醇殘基可以是羧酰胺或羧甲基化的衍生物。
本發(fā)明的腫瘤相關(guān)抗原衍生物也可以包括含有一個以上腫瘤相關(guān)抗原的構(gòu)成。在本發(fā)明的一個實施方案中，腫瘤相關(guān)抗原衍生物可以包括兩種或多種腫瘤相關(guān)抗原。
本文使用的術(shù)語“片段”是指包含至少一個表位的腫瘤相關(guān)抗原或抗原的衍生物的片段，例如CTL表位，典型地是至少8個氨基酸的肽。認為長度至少為8個例如8-10個氨基酸或最高達20、50、60、70、100、150或200個氨基酸的片段屬于本發(fā)明范圍，只要該片段具有抗原性即可，就是說，通過該片段保持主要表位(例如CTL表位)，并且該片段能夠引起與天然存在的腫瘤相關(guān)抗原進行交叉反應的免疫應答。示范性的片段可以是8-10、10-20、20-50、50-60、60-70、70-100、100-150、150-200個氨基酸殘基長度(包括這些范圍內(nèi)的任何值)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，將包含Her 2 neu抗原和CpG寡核苷酸的冷凍干燥組合物與包含3D-MPL和QS21的脂質(zhì)體或水包油乳化液載體重新構(gòu)建。這種重新構(gòu)建制劑可產(chǎn)生體液和細胞介導的響應二者。
本發(fā)明的冷凍干燥組合物可以包含與腫瘤支持機理(例如血管生成，腫瘤侵入)相關(guān)的抗原，例如tie 2、VEGF。
在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的冷凍干燥組合物中的抗原是選自HIV衍生的抗原的抗原，尤其是HIV-1衍生的抗原。下面的段落描述了可以衍生自HIV-1的抗原。
HIV Tat和Nef蛋白是早期蛋白，即它們在感染初期和在沒有結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的情況下表達。
Nef基因編碼早期輔助HIV蛋白(已經(jīng)表明其具有一些活性)。例如，已經(jīng)知道Nef蛋白可以導致CD4(HIV受體)從細胞表面除去，雖然這種功能的生物學重要性還在進行爭論。另外，Nef與T細胞的信號途徑相互作用，并且引起激活態(tài)，隨后可以促進更有效的基因表達。一些HIV獨立型在該區(qū)域中具有突變或缺失，導致它們不能編碼功能蛋白，并且在它們的復制和體內(nèi)發(fā)病原理過程中受到嚴重損害。
Gag基因是由全長RNA轉(zhuǎn)譯的，得到前體多蛋白，其隨后斷裂為3-5個衣殼蛋白；基質(zhì)蛋白質(zhì)p17，衣殼蛋白p24和核酸結(jié)合蛋白(Fundamental Virology，F(xiàn)ields BN，Knipe DM and Howley M 1996 2.Fields Virology vol 2 1996)。
Gag基因產(chǎn)生55千道爾頓(Kd)Gag前體蛋白，還稱為p55，其是由未拼接病毒mRNA來表達的。在轉(zhuǎn)譯期間，p55的N端被豆蔻?；l(fā)其與細胞膜的胞質(zhì)方面進行結(jié)合。膜結(jié)合的Gag多蛋白與其它病毒和細胞蛋白(其引發(fā)受感染細胞表面的病毒顆粒的芽殖)一起補充病毒基因組RNA的兩個復制品。芽殖之后，在病毒成熟為四個較小蛋白(稱為MA(基質(zhì)[p17])，CA(衣殼[p24])，NC(核衣殼[p9])和p6)的過程期間，通過病毒編碼的蛋白酶(Pol基因的產(chǎn)物)將p55斷裂。
除了3個主要Gag蛋白(p17、p24和p9)之外，所有Gag前體物還包含一些其它區(qū)域，其被斷裂，并以各種大小的肽的形式保留在病毒體中。這些蛋白具有不同的作用，例如，p2蛋白具有在調(diào)節(jié)蛋白酶活性方面具有推薦的作用，并且可以有助于蛋白酶解加工的正確時間。
MA多肽源自于p55的N端(豆蔻?；亩瞬?。大部分MA分子保持與病毒體脂雙層的內(nèi)表面的連接，從而使顆粒穩(wěn)定。MA的亞型被補充(recruite)到病毒體的更深一層的內(nèi)部，在其中，它變成護送(escort)病毒DNA至核心的復合物的一部分。這些MA分子可促進病毒基因組的核轉(zhuǎn)運，這是因為MA上的親核(karyophilic)信號是通過細胞核引入機構(gòu)來辨別的。這種現(xiàn)象使HIV感染未分裂細胞，這是逆轉(zhuǎn)錄病毒的特殊性質(zhì)。
p24(CA)蛋白形成病毒顆粒的錐形核。已經(jīng)證明親環(huán)素A可與p55的p24區(qū)域相互作用，導致其結(jié)合到HIV顆粒中。在Gag和親環(huán)素A之間的相互作用是必要的，這是因為通過環(huán)孢靈來破環(huán)這種相互作用可抑制病毒復制。
Gag的NC區(qū)域負責具體辨別所謂的HIV的包裝信號。包裝信號由四個位于接近病毒RNA的5′端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)組成，并且足以介導異源RNA結(jié)合到HIV-1病毒體中。通過兩個鋅指(zinc-finger)基序介導的相互作用，NC與包裝信號結(jié)合。NC還促進逆轉(zhuǎn)錄。
p6多肽區(qū)域介導p55 Gag和輔助蛋白Vpr之間的相互作用，導致Vpr結(jié)合到組裝病毒體中。p6區(qū)域還包含所謂的晚(late)域，從受感染細胞中有效釋放芽殖病毒體需要這種晚域。
Pol基因編碼具有感染初期的病毒所需要活性的三個蛋白，即病毒DNA積累到細胞DNA中所需要的逆轉(zhuǎn)錄酶RT、蛋白酶和整合酶蛋白。Pol的初產(chǎn)物被病毒體蛋白酶斷裂，得到氨基末端RT肽，其具有DNA合成(RNA和DNA引導的DNA聚合酶、核糖核酸酶H)和羧基端整合酶蛋白所必需的活性。HIV RT是全長RT(p66)和分裂產(chǎn)物(p51)(缺少羧基端RN酶H區(qū)域)的雜二聚體。
RT是通過逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組編碼的大部分高度保守的蛋白之一。RT的兩個主要活性是DNA Pol和核糖核酸酶H。RT的DNA Pol活性可互換地使用RNA和DNA作為模板，并且象所有已知的DNA聚合酶一樣，其不能從頭(de novo)引發(fā)DNA合成，需要預先存在分子作為引物(RNA)。
在所有RT蛋白中固有的核糖核酸酶H活性，在進行DNA合成時消除RNA基因組的復制初期起到必要的作用。它從所有的RNA-DNA雜交體分子中選擇性地降解RNA。在覆蓋Pol的氨基三分之二之內(nèi)的Pol中，聚合酶和核糖核酸酶H結(jié)構(gòu)上占據(jù)分開的、不相重疊的區(qū)域。
p66催化亞單位折疊成5個獨特的子域。這些的氨基末端23包含具有RT活性的部分。這些的羧基端是RN酶H區(qū)域。
宿主細胞感染之后，逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組通過逆轉(zhuǎn)錄酶(其存在于感染顆粒中)復制到直鏈雙股DNA中。整合酶(在Skalka AM′99 Advin Virus Res 52 271-273中進行綜述)識別病毒DNA的端部，修飾它們，并伴隨病毒DNA進入到宿主染色體的位點中，進行催化整合。宿主DNA中的許多位點可以是整合的靶向。雖然整合酶足以體外催化整合，但它不是與體內(nèi)病毒DNA相關(guān)的唯一蛋白-從受感染細胞中分離的大蛋白-病毒DNA復合物已經(jīng)代表了預先整合復合物。這可以通過子代病毒基因組來促進宿主細胞基因的采集。
整合酶由3個獨特的區(qū)域組成，N端區(qū)域、催化核心和C端區(qū)域。催化核心區(qū)域包括多核苷酸(polynucleotidyl)轉(zhuǎn)移化學的所有要求。
由此，用于本發(fā)明的HIV-1衍生的抗原可以選自例如Gag(例如全長Gag)，p17(Gag的一部分)，p24(Gag的另一部分)，p41，p40，Pol(例如全長Pol)，RT(Pol的一部分)，p51(RT的一部分)，整合酶(Pol的一部分)，蛋白酶(Pol的一部分)，Env，gp120，gp140或gp160，gp41，Nef，Vif，Vpr，Vpu，Rev，Tat和其免疫原性衍生物和其免疫原性片段，尤其是，包含p17、p24、RT和整合酶的Env、Gag、Nef和Pol和其免疫原性衍生物和其免疫原性片段。HIV疫苗可以包含多肽和/或多核苷酸(其將相當于許多不同HIV抗原的多肽編碼，例如選自上述列表的2或3或4或更多種HIV抗原)。一些不同的抗原可以例如包括在單一融合蛋白中?？梢允褂靡粋€以上的第一個免疫原性多肽和/或一個以上的第二個免疫原性多肽(其每個是HIV抗原或一個以上抗原的融合物)。
例如，抗原可以包含Gag或其免疫原性衍生物或免疫原性片段，與RT或其免疫原性衍生物或其免疫原性片段融合，與Nef或其免疫原性衍生物或其免疫原性片段融合，其中融合蛋白的Gag部分存在于多肽的5′端上。
按照本發(fā)明使用Gag序列可以排除Gag p6多肽編碼序列。用于本發(fā)明的Gag序列的具體例子包括p17和/或p24編碼序列。
RT序列可以包括突變，以便使任何逆轉(zhuǎn)錄酶活性基本上失活(參見WO03/025003)。
RT基因是在HIV基因組中較大pol基因的組分?？梢岳斫?，按照本發(fā)明使用的RT序列可以存在于Pol的范圍內(nèi)，或至少與RT對應的Pol的片段內(nèi)。Pol的這種片段保持了Pol的主要CTL表位。在一個具體實例中，RT僅僅作為RT的p51或p66片段被包括在內(nèi)。
按照本發(fā)明的融合蛋白或組合物的RT組分任選包含突變，以便消除在原核表達系統(tǒng)中充當內(nèi)部起動位點的位點。
任選地，將用于本發(fā)明的Nef序列截短，以消除編碼N端區(qū)域的序列，即，除去30至85的氨基酸，例如60至85的氨基酸，尤其是N端65氨基酸(后面的截短本文指的是trNef)?；蛘呋蛄硗?，可以將Nef改性，以消除十四烷基化位點。例如，可以通過缺失或置換來消除Gly 2十四烷基化位點?；蛘呋蛄硗?，可以將Nef改性，通過一種或兩者亮氨酸的缺失或置換，改變Leu 174和Leu 175的雙亮氨酸基序。雙亮氨酸基序在CD4下調(diào)方面的重要性描述在例如下列中Bresnahan P.A.等人(1998)Current Biology，8(22)1235-8。
Env抗原可以以gp160形式存在于它的全長中，或截短的gp140形式，或更短的形式(任選具有合適的突變，以破壞gp120和gp41之間的裂解位點基序)。Env抗原還可以以gp120和gp41形式存在于它的天然存在的加工形式中。gp160的這兩個衍生物可以單獨使用或以組合形式一起使用。上述Env抗原可以進一步顯示缺失(尤其是可變環(huán))和截短。也可以使用Env的片段。
示范性的gp120序列示于SEQ ID No 6中。示范性的gp140序列示于SEQ ID No 7中。
在按照本發(fā)明的冷凍干燥組合物中使用的免疫原性多肽可以包含Gag、Pol、Env和Nef，在其中，存在這些天然抗原的CTL表位至少75％、或至少90％或至少95％，例如96％。
在包含免疫原性多肽(其包含上述的p17/p24 Gag、p66 RT和截短的Nef)的凍干組合物中，適合地存在96％的天然Gag、Pol和Nef抗原的CTL表位。
本發(fā)明的一個實施方案提供了冷凍干燥組合物，其包含TLR9配體和免疫原性多肽，該免疫原性多肽以Gag、RT、Nef的順序包含p17、p24 Gag、p66 RT、截短的Nef(缺少(devoid)編碼端部氨基-酸1-85-“trNef”的核苷酸)。
在按照本發(fā)明的冷凍干燥組合物中使用的特定多核苷酸構(gòu)成和對應的多肽抗原包括 1.p17，p24(密碼子優(yōu)化)Gag-p66 RT(密碼子優(yōu)化)-截短的Nef； 2.截短的Nef-p66 RT(密碼子(codon)優(yōu)化)-p17，p24(密碼子優(yōu)化)Gag； 3.截短的Nef-p17，p24(密碼子優(yōu)化)Gag-p66 RT(密碼子優(yōu)化)； 4.p66 RT(密碼子優(yōu)化)-p17，p24(密碼子優(yōu)化)Gag-截短的Nef； 5.p66 RT(密碼子優(yōu)化)-截短的Nef-p17，p24(密碼子優(yōu)化)Gag； 6.p17，p24(密碼子優(yōu)化)Gag-截短的Nef-p66 RT(密碼子優(yōu)化)。
示范性的融合是Gag、RT和Nef的融合，尤其是以Gag-RT-Nef的順序(參見例如SEQ ID No 8或SEQ ID NO9)。另一個示范性的融合是p17、p24、RT和Nef的融合，尤其是以p24-RT-Nef-p17的順序。這種融合被稱作F4，并且描述在WO2006/013106中。F4是HIV抗原的優(yōu)選例子，其可以在本發(fā)明的冷凍干燥組合物中得到。在SEQ ID NO10中給出了F4的核苷酸序列，其中p24序列是粗體，Nef序列帶下劃線，方框是遺傳結(jié)構(gòu)所引入的核苷酸。在SEQ ID NO11中給出了F4的氨基酸序列，其中 P24序列氨基酸1-232(粗體) RT序列氨基酸235-795 Nef序列氨基酸798-1002 P17序列氨基酸1005-1136 方框遺傳結(jié)構(gòu)引入的氨基酸 K(賴氨酸)代替色氨酸(W)。引入突變，以除去酶活性 在另一個實施方案中，冷凍干燥組合物包含Gag、RT、整合酶和Nef，特別是以Gag-RT-整合酶-Nef的順序(參見例如SEQ ID No 11)。
在其它實施方案中，HIV抗原可以是融合多肽，該融合多肽包含Nef或其免疫原性衍生物或其免疫原性片段，和p17 Gag和/或p24 Gag或其免疫原性衍生物或其免疫原性片段，其中，當p17和p24 Gag兩者都存在時，在它們之間至少有一個HIV抗原或免疫原性片段。
例如，Nef合適地是全長Nef。
例如，p17 Gag和p24 Gag合適地分別是全長p17和p24。
在一個實施方案中，冷凍干燥組合物包含免疫原性多肽，該多肽包含p17和p24 Gag或其免疫原性片段。在這種構(gòu)成中，p24 Gag組分和p17 Gag組分被至少一個其它的HIV抗原或免疫原性片段所分離，例如Nef和/或RT或其免疫原性衍生物或其免疫原性片段。更多細節(jié)參見WO2006/013106。
在包含p24和RT的融合蛋白中，優(yōu)選，在構(gòu)成中，p24在RT前面，因為當在大腸桿菌中單獨表達抗原時，可以觀察到，p24能夠比RT更好地得到表達。
在按照本發(fā)明的冷凍干燥組合物中使用的一些構(gòu)成包括下列 1.p24-RT-Nef-p17 2.p24-RT＊-Nef-p17 3.p24-p51RT-Nef-p17 4.p24-p51RT＊-Nef-p17 5.p17-p51RT-Nef 6.p17-p51RT＊-Nef 7.Nef-p17 8.Nef-p17帶有連接基 9.p17-Nef 10.p17-Nef帶有連接基 *代表RT甲硫氨酸592突變?yōu)橘嚢彼? 在另一個方面，本發(fā)明提供了包含HIV抗原的融合蛋白的冷凍干燥組合物，HIV抗原包括至少四個HIV抗原或免疫原性片段，其中該四個抗原或片段是Nef、Pol和Gag或源自于Nef、Pol和Gag。優(yōu)選，Gag以兩個單獨組分的形式存在，在融合物中，兩個單獨組分被至少一個其它抗原所分離。優(yōu)選，Nef是全長Nef。優(yōu)選，Pol是p66或p51RT。優(yōu)選，Gag是p17和p24 Gag。在本發(fā)明的這方面，融合物的抗原組分的其它優(yōu)選特征和性質(zhì)如本文所描述。
本發(fā)明該方面的優(yōu)選實施方案是上面已經(jīng)列出的四個組分融合物 1.p24-RT-Nef-p17 2.p24-RT＊-Nef-p17 3.p24-p51RT-Nef-p17 4.p24-p51RT＊-Nef-p17 在本發(fā)明的冷凍干燥組合物內(nèi)使用的免疫原性多肽可以具有連接基序列，其存在于相當于具體抗原例如Gag、RT和Nef的序列之間。這種連接基序列可以例如至多20個氨基酸長度。在具體實施例中，它們可以是1至10個氨基酸，或1至6個氨基酸，例如4-6個氨基酸。
這種合適HIV抗原的進一步說明可以在WO03/025003中得到。
用于本發(fā)明的HIV抗原可以衍生自任何HIV進化枝，例如進化枝A、進化枝B或進化枝C。例如，HIV抗原可以衍生自進化枝A或B，特別是B。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，冷凍干燥組合物包含一個以上免疫原性多肽。在該實施方案的一方面，第一個免疫原性多肽是包含Gag和/或Pol和/或Nef或它們之中任一項的片段或衍生物的多肽(例如p24-RT-Nef-p17)。在本發(fā)明的該實施方案的一個具體方面，第二個免疫原性多肽是包含Gag和/或Pol和/或Nef或它們之中任一項的片段或衍生物的多肽(例如Gag-RT-Nef或Gag-RT-整合酶-Nef)。
由此，在一個具體實施方案中，包含Gag和/或Pol和/或Nef或它們之中任一項的片段或衍生物的多肽(例如p24-RT-Nef-p17)是第一個免疫原性多肽，和包含Gap和/或Pol和/或Nef或它們之中任一項的片段或衍生物的多肽(例如Gag-RT-Nef或Gag-RT-整合酶-Nef)是第二個免疫原性多肽。
在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，第一個免疫原性多肽是Env或其片段或衍生物，例如gp120、gp140或gp160(特別是gp120)。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，第二個免疫原性多肽是包含Gag和/或Pol和/或Nef或它們之中任一項的片段或衍生物的多肽(例如p24-RT-Nef-p17)。
由此，在一個具體實施方案中，Env或其片段或衍生物例如gp120、gp140或gp160(特別是gp120)是第一個免疫原性多肽，和包含Gag和/或Pol和/或Nef或它們之中任一項的片段或衍生物的多肽(例如p24-RT-Nef-p17)是第二個免疫原性多肽。
在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，第一個免疫原性多肽是包含Gag和/或Pol和/或Nef或它們之中任一項的片段或衍生物的多肽(例如p24-RT-Nef-p17)。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，第二個免疫原性多肽是Env或其片段或衍生物，例如gp120、gp140或gp160(特別是gp120)。
由此，在一個具體實施方案中，包含Gag和/或Pol和/或Nef或它們之中任一項的片段或衍生物的多肽(例如p24-RT-Nef-p17)是第一個免疫原性多肽，且Env或其片段或衍生物例如gp120、gp140或gp160(特別是gp120)是第二個免疫原性多肽。
冷凍干燥組合物可以包含一個抗原，或可以包含一個以上抗原。
在本發(fā)明的一方面，TLR9配體用于提高非帶正電荷抗原的溶解性。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，尤其是對于帶負電荷的抗原，Cpg的共同冷凍干燥可以提高它們在重新構(gòu)建時的溶解性。在TLR9配體是免疫刺激寡核苷酸的情況下，抗原是帶有凈負電荷的分子。在這種配體與帶有凈正電荷的抗原共同冷凍干燥的情況下，當將冷凍干燥組合物重新構(gòu)建時，TLR9配體有可能與抗原相互作用，可能導致抗原的沉淀。這是不合乎需要的，但通過使組合物包含已知在這種情況下可提高溶解性的冷凍干燥賦形劑(佐劑)例如L-精氨酸，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以避免這種現(xiàn)象發(fā)生。
將TLR9配體和一或多種抗原與合適賦形劑混合，形成可以冷凍干燥的最終的本體制劑。最好的是，賦形劑包含防凍劑(cryoprotectant)，以便在冷凍干燥初期階段期間保護蛋白不變性，和包含凍干保護劑(lyoprotectant)，以便在干燥期間防止蛋白失活。可以使用兩種不同的分子，或可以使用具有兩種性能的一種分子，例如二糖。任選地，還可以加入結(jié)晶性的擴充劑，例如甘露糖醇或甘氨酸。還可以加入非離子型表面活性劑例如聚山梨酸酯或

以幫助防止蛋白的團聚。賦形劑還可以包括緩沖鹽，以改變最終本體的pH值。
合適賦形劑包括下列糖，例如蔗糖，海藻糖，棉子糖和麥芽糖糊精例如麥芽三糖，麥芽四糖，麥芽五糖或麥芽六糖；多元醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；聚合物，例如葡聚糖(dextran)，聚乙二醇(PEG)，或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；氨基酸，例如甘氨酸，丙氨酸或精氨酸。
還可以將賦形劑進行結(jié)合，這樣就可以一起使用兩種或多種例如三或四種賦形劑。合適的組合包括糖和葡聚糖，例如蔗糖和葡聚糖或海藻糖和葡聚糖；糖和PEG，例如PEG8000和糖；糖和PVP，例如蔗糖和PVP；糖和氨基酸，例如甘氨酸和蔗糖；兩種糖一起，例如蔗糖和葡糖或蔗糖和棉子糖；蔗糖和多元醇，例如蔗糖和山梨糖醇或蔗糖和甘露糖醇；多元醇和氨基酸，例如甘露糖醇和甘氨酸。
表面活性劑例如聚山梨酸酯或

可以加入到賦形劑的任何組合中。
為了形成可以用于接種的免疫原性組合物，需要將包含抗原和TLR9配體的冷凍干燥組合物與可藥用稀釋劑進行重新構(gòu)建。本發(fā)明的優(yōu)選方面是，這種稀釋劑應該是顆粒稀釋劑，例如金屬鹽顆粒的溶液，或脂質(zhì)體，或水包油乳化液。
在一個實施方案中，稀釋劑進一步包含免疫刺激劑。這意味著，除了在冷凍干燥組合物中得到的TLR9配體之外，最終的重新構(gòu)建免疫原性組合物還包含其它免疫刺激劑。
有許多已知的單獨或組合形式的免疫刺激劑(已知其是佐劑)。不需要預先接觸，先天或天生的免疫系統(tǒng)就可以識別很寬的病原體譜。負責先天免疫的主要細胞(單核白細胞/巨噬細胞和嗜中性白細胞)可以吞噬微生物致病體，并且引發(fā)先天的、炎癥性的和特異性的免疫反應。
脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性細菌的外膜的外小葉的主要的表面分子，并且僅僅出現(xiàn)在革蘭氏陰性細菌的外膜的外小葉中。已經(jīng)證明LPS是TLR4配體。通過血清補充和吞噬細胞，LPS妨礙細菌的破壞，并且涉及到集群現(xiàn)象的吸附性。LPS是一組結(jié)構(gòu)上相關(guān)的復合分子(規(guī)格大致是10,000道爾頓)，并且由三個共價連接的區(qū)域組成 (i)O-特異性多糖鏈(O抗原)，在外區(qū) (ii)核心寡糖中心區(qū)域 (iii)脂質(zhì)A-在最內(nèi)部區(qū)域，其充當疏水錨，它包含攜帶長鏈脂肪酸的葡糖胺二糖單元。
LPS的生物學活性，例如致命毒性、致熱原性和佐劑性，已經(jīng)證明其與脂質(zhì)A部分相關(guān)。相反，免疫原性與O-特異性多糖組分(O抗原)有關(guān)。長久以來，LPS和脂質(zhì)A兩者的強烈佐劑效果是已知的，但這些分子的高毒性妨礙了它們在疫苗制劑中的使用。因此，朝著降低LPS或脂質(zhì)A的毒性、同時保持它們的佐劑性的目標而進行了大量的工作。
在1966年，從母體(光滑(smooth))株的培養(yǎng)物中分離出沙門氏菌minnesota突變株R595(Luderitz等人1966Ann.N.Y.Acad.Sci.133349-374)。根據(jù)被一組噬菌體(phages)溶解的敏感性，對所選擇的菌落進行篩選，并且只選擇那些表明窄靈敏范圍(僅僅對一或兩種噬菌體敏感)的菌落用于進一步研究。這種工作導致較粗制的(deep rough)突變株(其在LPS生物合成中是有缺陷的)的分離，并且稱為S.minnesotaR595。
與其它LPS相比，通過突變株S.minnesota R595產(chǎn)生的那些LPS具有相對簡單的結(jié)構(gòu)。
(i)它們不包含O-特異性區(qū)域這種特征導致從野型光滑表型變?yōu)橥蛔冎甏植诒硇停⑶覍е露拘缘膯适? (ii)中心區(qū)域很短該特征可以提高菌株對各種化學制劑的敏感性 (iii)脂質(zhì)A部分是高度?；模瑤в兄炼?個脂肪酸。
4′-單磷酰脂質(zhì)A(MPL)(其可以通過LPS的酸水解來獲得，LPS是從革蘭氏陰性細菌的深度粗糙的突變株提取的)保持了LPS的佐劑性能，同時證明毒性降低達1000以上的系數(shù)(在雞胚蛋中用致死劑量測定)(Johnson等人1987 Rev.Infect.Dis.9 SupplS512-S516)。一般將LPS在中等強度的無機酸溶液(例如0.1M HCl)中回流大約30分鐘。這種過程導致1位的脫磷酸、和6′位的脫糖基化(decarbohydration)，得到MPL。
3-O-脫酰單磷酰脂質(zhì)A(3D-MPL)(其可以通過MPL的溫和堿水解來獲得)具有進一步降低的毒性，同時又保持了佐劑性，參見US4,912,094(Ribi Immunochemicals)。堿水解一般在有機溶劑中進行，例如在氯仿/甲醇的混合物中，通過用弱堿水溶液進行飽和，例如0.5M碳酸鈉(pH10.5)。
制備3D-MPL的進一步的資料可以在例如US4,912,094和WO02/078637(Corixa Corporation)中得到。
已經(jīng)表明，一些不是TLR配體的分子具有佐劑活性。皂甙(Quillajasaponins)是三萜烯糖苷的混合物，從皂樹皮中提取的。粗品皂甙(saponins)已經(jīng)廣泛地用作獸用佐劑。Quil-A是部分純化的皂甙(Quillaja saponins)物質(zhì)的水提取物。QS21是Quil A的Hplc純化的無毒片段，并且它的制備方法公開(作為QA21形式)在美國專利US5,057,540中。
在本發(fā)明的一方面，稀釋劑包含一種其它的免疫刺激劑。在本發(fā)明的另一個方面，稀釋劑包含一種以上其它的免疫刺激劑。這種免疫刺激劑可以是TLR4配體、皂甙(saponins)、TLR7配體、TLR8配體或TLR9配體。在本發(fā)明的一個實施方案中，其它免疫刺激劑是TLR4配體，例如本文所描述的3D-MPL。在本發(fā)明的進一步實施方案中，其它免疫刺激劑是本文所描述的QS21。在本發(fā)明的還進一步實施方案中，稀釋劑包含QS21和3D-MPL。在該實施方案的一方面，稀釋劑是包含QS21和3D-MPL的水包油乳化液。在該實施方案的另一個方面，稀釋劑是包含QS21和3D-MPL的脂質(zhì)體溶液。
現(xiàn)在參考下列非限制性實施例來進一步描述本發(fā)明。
實施例 實施例1CpG寡核苷酸和作為抗原的CPC-P501S的冷凍干燥 使用的抗原是CPC-P501S。該抗原用圖解法示于圖1中，其中，表明TM2至TM12的部分代表P501S抗原；左邊的橢圓形代表CPC融合伙伴，His尾部展示在右邊。
用釀酒酵母中所示的His標簽制備抗原，然后使用Tris(5mM pH7.5)和Tween80(0.3％)的緩沖液使其濃度為700μg/ml。
為了制備最終的本體，將蔗糖(35％)加入到注射用水中，并達到6.3％的最終濃度。然后加入Tris(1M pH8.8)，而后加入Tween 80(25％)，以達到0.2％的最后濃度。將該混合物在室溫下磁力攪拌5分鐘。加入CPC-P501S，并在室溫下將該混合物磁力攪拌4分鐘。然后加入SEQ IDNo4的CpG寡聚體，并在室溫下將得到的混合物磁力攪拌15分鐘，得到最終的本體。該組合物分析如下 將0.5ml組合物填充到玻璃管瓶中，對其完成冷凍干燥循環(huán)，如圖2所示。
在37℃，對三個管瓶的組合物通過肉眼觀察進行餅塊表征，并在T0、1周、2周、3周和4周進行直徑測定(參見圖3)。在相同時點和溫度下，使用熱重法(TG)或Karl Fischer(KF)測定殘余含濕量。如下面所示，餅塊可穩(wěn)定高達兩周。
冷凍干燥的餅塊
KF卡爾費希爾法 TG熱重法 nd未做 OK既不聚集也不降解 Specs3％(熱重法) 在37℃保存期間(為了加快穩(wěn)定性分析)，將最終容器中的濕度提高。在37℃，1個月之后，餅塊包含1.3％水，并且收縮。在該實驗中，濕度增加是由于吸濕性的粉末從塞子吸收水。用新型塞子來替換該塞子，可以有助于防止這種收縮。
然后將餅塊與注射用水或與下面的載液重新構(gòu)建佐劑系統(tǒng)A(按照WO2005/112991中所列出的方法制備的脂質(zhì)體佐劑)，佐劑系統(tǒng)E(按照WO2005/112991中所列出的方法制備的水包油乳化液佐劑)或佐劑系統(tǒng)F(按照WO2005/112991中所列出的方法制備的水包油乳化液佐劑)。
用注射用水、佐劑系統(tǒng)E或佐劑系統(tǒng)F，沒有看到蛋白聚集或降解現(xiàn)象。用佐劑系統(tǒng)A，看到一些聚集和降解。推斷這種現(xiàn)象是由于低于CPC-P501S的等電點下pH值降低。使Tris賦形劑的濃度增加至50mM，可以解決該問題，然后用佐劑系統(tǒng)A就不會看到聚集現(xiàn)象。還發(fā)現(xiàn)，當與佐劑系統(tǒng)A重新構(gòu)建時，在凍干(lyo)餅塊中存在CpG(即共同冷凍干燥的抗原和CpG寡核苷酸)可有助于防止抗原的聚集。在有和沒有CpG條件下使用佐劑系統(tǒng)A，將凍干(lyo)餅塊的重新構(gòu)建進行比較，顯示了在共同冷凍干燥之后聚集降低(數(shù)據(jù)未顯示)。
還研究了賦形劑對佐劑系統(tǒng)A中脂質(zhì)體大小的影響，人們發(fā)現(xiàn)，在單獨佐劑系統(tǒng)A的管瓶中得到的脂質(zhì)體、和在包含抗原、CpG、Tris與Tween的凍干(lyo)餅塊重新構(gòu)建之后的佐劑系統(tǒng)A的管瓶中得到的脂質(zhì)體之間的大小沒有差別。因此，我們可以斷定，凍干(lyo)餅塊的組分不影響佐劑系統(tǒng)(圖4) 最后，研究了制劑的抗原性，人們發(fā)現(xiàn)，就淋巴組織增生和胞內(nèi)細胞素(IFNγ)產(chǎn)物而言，在液體與CPC-P501S的凍干(lyo)制劑之間沒有差別(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，我們可以斷定，抗原的免疫原性不受與CpG的共同冷凍干燥所影響。
實施例2CpG寡核苷酸和作為抗原的Mage-3的冷凍干燥 使用的抗原是與MAGE-3連接的蛋白D蛋白的一部分，其接著與His尾部連接，從而便于PD-Mage3-His的純化(參見圖5SEQ ID NO13)。
在大腸桿菌中，用His標簽制備純化的本體抗原，然后使用NaH2PO4.2H2O/K2HPO4.2H2O(2mM)和Tween80(大約0.2％v/v(理論))的緩沖液(pH7.5)，使其濃度變?yōu)?50μg/ml。
為了制備最終的本體，將蔗糖(30％)加入到注射用水中，得到3.15％的最終濃度。然后加入NaH2PO4.2H2O/K2HPO4.2H2O(100mm，pH7.5)，得到5mM的最終PO4濃度，將抗原緩沖液中的磷酸鹽考慮進去。還加入Tween 80(3％)，得到0.15％的最后濃度，將抗原緩沖液中的Tween算進去。將該混合物在室溫下磁力攪拌5至15分鐘。加入PD-Mage3-His(750μg/ml)，并在室溫下將混合物磁力攪拌5-15分鐘。然后加入SEQ ID No4的CpG寡聚物，并在室溫下將得到的混合物磁力攪拌15分鐘(+/-5分鐘)，得到最終的本體。用NaOH(0.05M或0.5M)或HCl(0.03M或0.3M)將pH值調(diào)節(jié)至pH7.5+/-0.1。
該組合物分析如下
將0.5ml這種組合物填充到玻璃管瓶中，對其完成冷凍干燥循環(huán)，如圖6所示。
將餅塊在37℃儲存7至9天之后，分析賦形劑和冷凍-干燥循環(huán)對餅塊組合物的影響。
餅塊外觀和殘余濕度 能夠看出，在第7天，餅塊不存在任何破裂現(xiàn)象，并且到第8天，應力穩(wěn)定性沒有改變。
在37℃保存7至9天的餅塊的殘余濕度低于3％的標準。
在37℃儲存7至9天之后，直徑?jīng)]有變化。
然后將餅塊與佐劑系統(tǒng)A(按照WO2005/112991所列出的方法制備的脂質(zhì)體佐劑)進行重新構(gòu)建。沒有看到蛋白聚集或降解現(xiàn)象，由此證明，抗原可以與CpG共同冷凍干燥，不會影響它的重新構(gòu)建能力。
研究了制劑的抗原性。人們發(fā)現(xiàn)，在佐劑系統(tǒng)A中重新構(gòu)建之后，24小時之后，抗原性隨時間的增加而降低。人們認為，這是由于重新構(gòu)建之后得到的酸性pH值(6.2+/-0.1)造成的。當發(fā)現(xiàn)抗原性的降低可以通過提高pH值而減小時，可以證明這個結(jié)論。然而，隨著時間的推移，抗原性還是有一些降低。因此，將該制劑進行試驗，以便看看是否這種降低會對體內(nèi)效能試驗有影響。將人劑量的3/10、1/10和1/30的稀釋物給予幾組小鼠，每組10個小鼠，如圖7所示。將小鼠在第28天進行放血。
T0、4h和24h是餅塊與佐劑系統(tǒng)A重新構(gòu)建之后的時間。如圖7所示，對效能沒有影響。
實施例3CpG對重新構(gòu)建之后抗原溶解性的影響 1.WT1是最初發(fā)現(xiàn)在兒科腎癌(Wilm′s腫瘤)中過度表達的蛋白。在目前情況下，可以使用的候選抗原使用了接近全長的蛋白作為抗原。WT1-A10蛋白是在大腸桿菌中表達的292 AA重組融合蛋白，由12mer截短的tat序列(前導序列)和WT1序列的氨基酸數(shù)目2-281組成。將這種抗原單獨冷凍干燥之后，如果與佐劑系統(tǒng)A重新構(gòu)建，由于它的等電點(5.85至7.5)接近佐劑系統(tǒng)A的pH值(6.1)并且在佐劑系統(tǒng)A中存在氯化鈉，這種抗原沉淀。
制備WT1-A10的兩個制劑。重新構(gòu)建劑量包含400μg/ml WT1-A10抗原、10％蔗糖、100mM Tris和0.2％ Tween 80，加上或減去840μg/mlCpG。
將兩個制劑與500μl佐劑系統(tǒng)A進行重新構(gòu)建。將得到的液體離心，對未離心液體(NC)、上清液(SN)和球粒(P)進行Western印跡(blot)。結(jié)果示于圖8中。
正如在圖8中所看到的那樣，在CpG的存在下，重新構(gòu)建之后的抗原的溶解性提高，這可以由沉淀球粒中缺乏抗原而得到證明?？梢栽谥匦聵?gòu)建冷凍干燥組合物(其中凍干(lyo)餅塊不包含CpG)的球粒中看到沉淀的抗原。這證明，在非帶正電荷的抗原的情況下，CpG的共同冷凍干燥可以在重新構(gòu)建時提高抗原的溶解性。
2.PRAME 制備PRAME的兩個制劑。重新構(gòu)建劑量包含1000μg/ml PRAME抗原、3.15％蔗糖、5mM硼酸鹽、150nM氯化鈉，加上或減去840μg/mlCpG。將兩個制劑與500μl佐劑系統(tǒng)A進行重新構(gòu)建。將得到的液體離心，對未離心液體(NC)、上清液(SN)和球粒(P)進行Western印跡。結(jié)果示于圖9中，其中NC＝未離心，SN＝上清液，P＝球粒 正如在圖9中所看到的那樣，在CpG的存在下，重新構(gòu)建之后的抗原的溶解性提高，這可以由沉淀球粒中缺乏抗原而得到證明。可以在重新構(gòu)建冷凍干燥組合物(其中凍干(lyo)餅塊不包含CpG)的球粒中看到沉淀的抗原。這進一步證明，在非帶正電荷的抗原的情況下，CpG的共同冷凍干燥可以在重新構(gòu)建時提高抗原的溶解性。
SEQ ID NO1
TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT
SEQ ID NO2
TCT CCC AGC GTG CGC CAT
SEQ ID NO3
ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
SEQ ID NO4
TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT
SEQ ID NO5
TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT
SEQ ID NO6
MKVKETRKNY QHLWRWGTML LGMLMICSAA EQLWVTVYYG VPVWKEATTT 50
LFCASDAKAY DTEVHNVWAT HACVPTDPNP QEVVLGNVTE YFNMWKNNMV100
DQMHEDIISL WDQSLKPCVK LTPLCVTLDC DDVNTTNSTT TTSNGWTGEI150
RKGEIKNCSF NITTSIRDKV QKEYALFYNL DVVPIDDDNA TTKNKTTRNF200
RLIHCNSSVM TQACPKVSFE PIPIHYCAPA GFAILKCNNK TFDGKGLCTN250
VSTVQCTHGI RPVVSTQLLL NGSLAEEEVV IRSDNFMDNT KTIIVQLNES300
VAINCTRPNN NTRKGIHIGP GRAFYAARKI IGDIRQAHCN LSRAQWNNTL350
KQIVIKLREH FGNKTIKFNQ SSGGDPEIVR HSFNCGGEFF YCDTTQLFNS400
TWNGTEGNNT EGNSTITLPC RIKQIINMWQ EVGKAMYAPP IGGQIRCSSN450
ITGLLLTRDG GTEGNGTENE TEIFRPGGGD MRDNWRSELY KYKVVKVEPL500
GVAPTRAKRR VVQR 514
SEQ ID NO7
1 MRVMEIQRNC QHLLRWGIMI LGMIIICSTA DNLWVTVYYG VPVWRDAETT
51 LFCASDAKAY STEKHNVWAT HACVPTDPNP QEIPLDNVTE EFNMWKNNMV
101 DQMHEDIISL WDQSLKPCVQ LTPLCVTLNC SNARVNATFN STEDREGMKN
151 CSFNMTTELR DKKQQVYSLF YRLDIEKINS SNNNSEYRLV NCNTSAITQA
201 CPKVTFEPIP IHYCAPAGFA ILKCNDTEFN GTGPCKNVST VQCTHGIKPV
251 VSTQLLLNGS LAEREVRIRS ENIANNAKNI IVQFASPVKI NCIRPNNNTR
301 KSYRIGPGQT FYATDIVGDI RQAHCNVSRT DWNNTLRLVA NQLRKYFSNK
351 TIIFTNSSGG DLEITTHSFN CGGEFFYCNT SGLFNSTWTT NNMQESNDTS
401 NGTITLPCRI KQIIRMWQRV GQAMYAPPIE GVIRCESNIT GLILTRDGGN
451 NNSANETFRP GGGDIRDNWR SELYKYKVVK IEPLGVAPTR AKRRVVEREK
501 RAVGIGAVFL GFLGAAGSTM GAASITLTVQ ARQLLSGIVQ QQSNLLRAIE
551 AQQQLLKLTV WGIKQLQARV LAVERYLRDQ QLLGIWGCSG KLICTTNVPW
601 NSSWSNKSYD DIWQNMTWLQ WDKEISNYTD IIYSLIEESQ NQQEKNEQDL
651 LALDKWANLW NWFDISKWLW YIRS
SEQ ID NO8
1 MGARASVLSG GELDRWEKIR LRPGGKKKYK LKHIVWASRE LERFAVNPGL
51 LETSEGCRQI LGQLQPSLQT GSEELRSLYN TVATLYCVHQ RIEIKDTKEA
101 LDKIEEEQNK SKKKAQQAAA DTGHSNQVSQ NYPIVQNIQG QMVHQAISPR
151 TLNAWVKVVE EKAFSPEVIP MFSALSEGAT PQDLNTMLNT VGGHQAAMQM
201 LKETINEEAA EWDRVHPVHA GPIAPGQMRE PRGSDIAGTT STLQEQIGWM
251 TNNPPIPVGE IYKRWIILGL NKIVPMYSPT SILDIRQGPK EPFRDYVDRF
301 YKTLRAEQAS QEVKNWMTET LLVQNANPDC KTILKALGPA ATLEEMMTAC
351 QGVGGPGHKA RVLMGPISPI ETVPVKLKPG MDGPKVKQWP LTEEKIKALV
401 EICTEMEKEG KISKIGPENP YNTPVFAIKK KDSTKWRKLV DFRELNKRTQ
451 DFWEVQLGIP HPAGLKKKKS VTVLDVGDAY FSVPLDEDFR KYTAFTIPSI
501 NNETPGIRYQ YNVLPQGWKG SPAIFQSSMT KILEPFRKQN PDIVIYQYMD
551 DLYVGSDLEI GQHRTKIEEL RQHLLRWGLT TPDKKHQKEP PFLKMGYELH
601 PDKWTVQPIV LPEKDSWTVN DIQKLVGKLN WASQIYPGIK VRQLCKLLRG
651 TKALTEVIPL TEEAELELAE NREILKEPVH GVYYDPSKDL IAEIQKQGQG
701 QWTYQIYQEP FKNLKTGKYA RMRGAHTNDV KQLTEAVQKI TTESIVIWGK
751 TPKFKLPIQK ETWETWWTEY WQATWIPEWE FVNTPPLVKL WYQLEKEPIV
801 GAETFYVDGA ANRETKLGKA GYVTNRGRQK VVTLTDTTNQ KTELQAIYLA
851 LQDSGLEVNI VTDSQYALGI IQAQPDQSES ELVNQIIEQL IKKEKVYLAW
901 VPAHKGIGGN EQVDKLVSAG IRKVLMVGFP VTPQVPLRPM TYKAAVDLSH
951 FLKEKGGLEG LIHSQRRQDI LDLWIYHTQG YFPDWQNYTP GPGVRYPLTF
1001 GWCYKLVPVE PDKVEEANKG ENTSLLHPVS LHGMDDPERE VLEWRFDSRL
1051 AFHHVARELH PEYFKNC
SEQID NO9
atggttatcgtgcagaacatccaggggcaaatggtacatcaggccatatcacctagaactttaaatgcatggg
taaaagtagtagaagagaaggctttcagcccagaagtaatacccatgttttcagcattatcagaaggagccac
cccacaagatttaaacaccatgctaaacacagtggggggacatcaagcagccatgcaaatgttaaaagagacc
atcaatgaggaagctgcagaatgggatagagtacatccagtgcatgcagggcctattgcaccaggccagatga
gagaaccaaggggaagtgacatagcaggaactactagtacccttcaggaacaaataggatggatgacaaataa
tccacctatcccagtaggagaaatttataaaagatggataatcctgggattaaataaaatagtaagaatgtat
agccctaccagcattctggacataagacaaggaccaaaagaaccttttagagactatgtagaccggttctata
aaactctaagagccgagcaagcttcacaggaggtaaaaaattggatgacagaaaccttgttggtccaaaatgc
gaacccagattgtaagactattttaaaagcattgggaccagcggctacactagaagaaatgatgacagcatgt
cagggagtaggaggacccggccataaggcaagagttttg
ggccccattagccctattgagactgtgt
cagtaaaattaaagccaggaatggatggcccaaaagttaaacaatggccattgacagaagaaaaaataaaagc
attagtagaaatttgtacagagatggaaaaggaagggaaaatttcaaaaattgggcctgaaaatccatacaat
actccagtatttgccataaagaaaaaagacagtactaaatggagaaaattagtagatttcagagaacttaata
agagaactcaagacttctgggaagttcaattaggaataccacatcccgcagggttaaaaaagaaaaaatcagt
aacagtactggatgtgggtgatgcatatttttcagttcccttagatgaagacttcaggaaatatactgcattt
accatacctagtataaacaatgagacaccagggattagatatcagtacaatgtgcttccacagggatggaaag
gatcaccagcaatattccaaagtagcatgacaaaaatcttagagccttttagaaaacaaaatccagacatagt
tatctatcaatacatggatgatttgtatgtaggatctgacttagaaatagggcagcatagaacaaaaatagag
gagctgagacaacatctgttgaggtggggacttaccacaccagacaaaaaacatcagaaagaacctccattcc
ttaaaatgggttatgaactccatcctgataaatggacagtacagcctatagtgctgccagaaaaagacagctg
gactgtcaatgacatacagaagttagtggggaaattgaattgggcaagtcagatttacccagggattaaagta
aggcaattatgtaaactccttagaggaaccaaagcactaacagaagtaataccactaacagaagaagcagagc
tagaactggcagaaaacagagagattctaaaagaaccagtacatggagtgtattatgacccatcaaaagactt
aatagcagaaatacagaagcaggggcaaggccaatggacatatcaaatttatcaagagccatttaaaaatctg
aaaacaggaaaatatgcaagaatgaggggtgcccacactaatgatgtaaaacaattaacagaggcagtgcaaa
aaataaccacagaaagcatagtaatatggggaaagactcctaaatttaaactgcccatacaaaaggaaacatg
ggaaacatggtggacagagtattggcaagccacctggattcctgagtgggagtttgttaatacccctccttta
gtgaaattatggtaccagttagagaaagaacccatagtaggagcagaaaccttctatgtagatggggcagcta
acagggagactaaattaggaaaagcaggatatgttactaatagaggaagacaaaaagttgtcaccctaactga
cacaacaaatcagaagactgagttacaagcaatttatctagctttgcaggattcgggattagaagtaaacata
gtaacagactcacaatatgcattaggaatcattcaagcacaaccagatcaaagtgaatcagagttagtcaatc
aaataatagagcagttaataaaaaaggaaaaggtctatctggcatgggtaccagcacacaaaggaattggagg
aaatgaacaagtagataaattagtcagtgctggaatcaggaaagtgcta
ggtggcaagtggtcaaaa
agtagtgtggttggatggcctactgtaagggaaagaatgagacgagctgagccagcagcagatggggtgggag
cagcatctcgagacctggaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgcttgtgc
ctggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgact
tacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaac
gaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattggcagaactacacacc
agggccaggggtcagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggta
gaagaggccaataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatggaatggatgaccctgaga
gagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccggagta
cttcaagaactgc
atgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaa
attcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaac
gattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatc
ccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaagg
atagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaaaaaagcac
agcaagcagcagctgacacaggacacagcaatcaggtcagccaaaattactaa
SEQ ID NO10
MVIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATP 50
QDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREP100
RGSDIAGTTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTS150
ILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCK200
TILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVL
GPISPIETVSVKLKPG250
MDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKK300
KDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAY350
FSVPLDEDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMT400
KILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGLT450
TPDKKHQKEPPFL
MGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLN500
WASQIYPGIKVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVH550
GVYYDPSKDLIAEIQKQGQGQWTYQIYQEPFKNLKTGKYARMRGAHTNDV600
KQLTEAVQKITTESIVIWGKTPKFKLPIQKETWETWWTEYWQATWIPEWE650
FVNTPPLVKLWYQLEKEPIVGAETFYVDGAANRETKLGKAGYVTNRGRQK700
VVTLTDTTNQKTELQAIYLALQDSGLEVNIVTDSQYALGIIQAQPDQSES750
ELVNQIIEQLIKKEKVYLAWVPAHKGIGGNEQVDKLVSAGIRKV
MGGK800
WSKSSVVGWPTVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNAA850
CAWLEAQEEEEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQ900
RRQDILDLWIYHTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPDKVE950
EANKGENTSLLHPVSLHGMDDPEREVLEWRFDSRLAFHHVARELHPEYFK 1000
NC
MGARASVLSGGELDRWEKIRLRPGGKKKYKLKHIVWASRELERFAV 1050
NPGLLETSEGCRQILGQLQPSLQTGSEELRSLYNTVATLYCVHQRIEIKD 1100
TKEALDKIEEEQNKSKKKAQQAAADTGHSNQVSQNY 1136
SEQ ID NO11
1 MAARASILSG GKLDAWEKIR LRPGGKKKYR LKHLVWASRE LDRFALNPSL
51 LETTEGCQQI MNQLQPAVKT GTEEIKSLFN TVATLYCVHQ RIDVKDTKEA
101 LDKIEEIQNK SKQKTQQAAA DTGDSSKVSQ NYPIIQNAQG QMIHQNLSPR
151 TLNAWVKVIE EKAFSPEVIP MFSALSEGAT PQDLNVMLNI VGGHQAAMQM
201 LKDTINEEAA EWDRLHPVQA GPIPPGQIRE PRGSDIAGTT STPQEQLQWM
251 TGNPPIPVGN IYKRWIILGL NKIVRMYSPV SILDIKQGPK EPFRDYVDRF
301 FKALRAEQAT QDVKGWMTET LLVQNANPDC KSILKALGSG ATLEEMMTAC
351 QGVGGPGHKA RVLAEAMSQA QQTNIMMQRG NFRGQKRIKC FNCGKEGHLA
401 RNCRAPRKKG CWKCGKEGHQ MKDCTERQAN FLGKIWPSSK GRPGNFPQSR
451 PEPTAPPAEL FGMGEGIASL PKQEQKDREQ VPPLVSLKSL FGNDPLSQGS
501 PISPIETVPV TLKPGMDGPK VKQWPLTEEK IKALTEICTE MEKEGKISKI
551 GPENPYNTPI FAIKKKDSTK WRKLVDFREL NKRTQDFWEV QLGIPHPAGL
601 KKKKSVTVLD VGDAYFSVPL DENFRKYTAF TIPSTNNETP GVRYQYNVLP
651 QGWKGSPAIF QSSMTKILEP FRSKNPEIII YQYMAALYVG SDLEIGQHRT
701 KIEELRAHLL SWGFTTPDKK HQKEPPFLWM GYELHPDKWT VQPIMLPDKE
751 SWTVNDIQKL VGKLNWASQI YAGIKVKQLC RLLRGAKALT DIVTLTEEAE
801 LELAENREIL KDPVHGVYYD PSKDLVAEIQ KQGQDQWTYQ IYQEPFKNLK
851 TGKYARKRSA HTNDVRQLAE VVQKVAMESI VIWGKTPKFK LPIQKETWET
901 WWMDYWQATW IPEWEFVNTP PLVKLWYQLE KDPILGAETF YVDGAANRET
951 KLGKAGYVTD RGRQKVVSLT ETTNQKTELH AILLALQDSG SEVNIVTDSQ
1001 YALGIIQAQP DRSESELVNQ IIEKLIGKDK IYLSWVPAHK GIGGNEQVDK
1051 LVSSGIRKVL FLDGIDKAQE DHERYHSNWR TMASDFNLPP IVAKEIVASC
1101 DKCQLKGEAM HGQVDCSPGI WQLACTHLEG KVILVAVHVA SGYIEAEVIP
1151 AETGQETAYF LLKLAGRWPV KVVHTANGSN FTSAAVKAAC WWANIQQEFG
1201 IPYNPQSQGV VASMNKELKK IIGQVRDQAE HLKTAVQMAV FIHNFKRKGG
1251 IGGYSAGERI IDIIATDIQT KELQKQITKI QNFRVYYRDS RDPIWKGPAK
1301 LLWKGEGAVV IQDNSDIKVV PRRKAKILRD YGKQMAGDDC VAGRQDEDRS
1351 MGGKWSKGSI VGWPEIRERM RRAPAAAPGV GAVSQDLDKH GAITSSNINN
1401 PSCVWLEAQE EEEVGFPVRP QVPLRPMTYK GAFDLSHFLK EKGGLDGLIY
1451 SRKRQEILDL WVYHTQGYFP DWQNYTPGPG VRYPLTFGWC FKLVPMEPDE
1501 VEKATEGENN SLLHPICQHG MDDEEREVLI WKFDSRLALK HRAQELHPEF
1551 YKDC
SEQ ID NO12
蛋白D_H流感(1)MKLKTLALSLLAAGVLAGCSSHSSNMANTQMKSDKIIIAHRGASGYLPEH
51)TLESKALAFAQQADYLEQDLAMTKDGRLVVIHDHFLDGLTDVAKKFPHRH(101)RKDGRYYVIDFTLKEIQSLEMTENFET
權(quán)利要求
1.冷凍干燥組合物，其包含一種或多種抗原和TLR9激動劑。
2.按照權(quán)利要求1的組合物，其中所述TLR9激動劑是免疫刺激寡核苷酸。
3.按照權(quán)利要求2的組合物，其中所述免疫刺激寡核苷酸是包含CpG的寡核苷酸。
4.按照權(quán)利要求3的組合物，其中所述免疫刺激寡核苷酸包含嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶序列。
5.權(quán)利要求2至4所要求的組合物，其中所述免疫刺激寡核苷酸選自包含下列的組
TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(SEQ ID NO1)；
TCT CCC AGC GTG CGC CAT(SEQ ID NO2)；
ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG(SEQ ID NO3)；
TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(SEQ ID NO4)；
TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(SEQ ID NO5)。
6.按照權(quán)利要求2至4的任一項的組合物，其中免疫刺激寡核苷酸包含至少兩個未甲基化的CG重復單元，其至少被3個核苷酸分離。
7.按照權(quán)利要求6的組合物，其中免疫刺激寡核苷酸包含至少兩個未甲基化的CG重復單元，其被6個核苷酸分離。
8.按照權(quán)利要求1至8的任一項的組合物，其中所述抗原不是帶正電荷的抗原。
9.按照權(quán)利要求1至8的任一項的組合物，其中一種或多種所述抗原是腫瘤相關(guān)的抗原。
10.按照權(quán)利要求9的組合物，其中所述抗原選自MAGE-3、CPC-P501S、WT-1。
11.按照權(quán)利要求1至8的任一項的組合物，其中至少一種所述抗原是HIV-1衍生的抗原。
12.按照權(quán)利要求11的組合物，其中一種所述抗原是F4。
13.按照權(quán)利要求11或12的組合物，其中所述抗原是F4和gp120。
14.按照權(quán)利要求1至12的任一項的冷凍干燥組合物的制備方法，其包括下面的步驟將目標抗原和TLR9配體與合適賦形劑混合，并且對得到的制劑進行冷凍干燥循環(huán)。
15.制備免疫原性組合物的方法，其包括下面的步驟將權(quán)利要求1至12的任一項的冷凍干燥組合物與合適載體進行重新構(gòu)建。
16.按照權(quán)利要求14的方法，其中所述載體是選自包含下述的組的顆粒無機鹽，乳液，聚合物，脂質(zhì)體，ISCOMs。
17.按照權(quán)利要求15的方法，其中所述載體是脂質(zhì)體溶液或水包油乳化液。
18.按照權(quán)利要求14至16的任一項的方法，其中所述載體進一步包含一或多種免疫刺激劑。
19.按照權(quán)利要求17的方法，其中上述一或多種免疫刺激劑選自TLR4激動劑，TLR4拮抗劑，皂草苷，TLR7激動劑，TLR8激動劑，TLR9激動劑。
20.按照權(quán)利要求18的方法，其中所述TLR 4拮抗劑是3-脫?；腗PL。
21.按照權(quán)利要求18或19的方法，其中所述皂草苷是QS21。
22.按照權(quán)利要求17的方法，其中所述載體包含兩種免疫刺激劑。
23.按照權(quán)利要求21的方法，其中所述免疫刺激劑是3-脫?；腗PL和QS21。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含抗原和Toll樣受體(TLR)9激動劑的冷凍干燥組合物。這種組合物可以與載體重新構(gòu)建到免疫原性組合物中，用于接種，載體選自由脂質(zhì)體、無機鹽、乳液、聚合物和ISCOMs組成的顆粒載體。本發(fā)明提供了用本發(fā)明的冷凍干燥組合物來制備免疫原性組合物的方法，本文還提供了其在免疫中的用途。
文檔編號A61K39/00GK101678091SQ200880017245
公開日2010年3月24日 申請日期2008年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月24日
發(fā)明者D·I·勒穆瓦納 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司