本發(fā)明涉及藥物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)石通片指紋圖譜的建立方法。

背景技術(shù)：
中藥復(fù)方控制是制約中藥現(xiàn)代化發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題之一。中醫(yī)理論強(qiáng)調(diào)中藥的整體效應(yīng)，重視在藥效上的協(xié)同作用，以中藥內(nèi)一、二個(gè)有效成分作為定性、定量指標(biāo)遠(yuǎn)不能有效地控制和評(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量，更難以反映其安全性和有效性。中藥復(fù)方是兩味以上中藥組合應(yīng)用于疾病治療的復(fù)方制劑，其質(zhì)量控制的難度較單味中藥更甚。近年來(lái)，中藥指紋圖譜和特征指紋圖譜已廣泛應(yīng)用于質(zhì)量控制，其中中藥特征圖譜系指從中藥指紋圖譜中選取若干專屬性強(qiáng)的色譜峰或色譜峰組合特征指紋圖譜，通過(guò)特征指紋峰的有無(wú)及變化來(lái)監(jiān)控中藥質(zhì)量。結(jié)石通片由廣金錢草、石韋、車前草、茯苓等多味藥材組成，具有清熱利尿、通淋排石、鎮(zhèn)痛止血之功效。臨床多用于治療泌尿系統(tǒng)感染，膀胱炎，腎炎水腫，尿路結(jié)石，血尿，淋瀝混濁，尿道灼痛等，收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十三冊(cè)。目前結(jié)石通片的質(zhì)量控制方法主要依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-2589-97質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有性狀和檢查項(xiàng)，難以控制藥品的質(zhì)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)行結(jié)石通片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)落后，僅有性狀、檢查項(xiàng)目，不能有效的控制成藥質(zhì)量的問(wèn)題，提供一種結(jié)石通片指紋圖譜的建立方法，通過(guò)結(jié)石通片指紋圖譜方法的建立，以及由此方法得到的結(jié)石通片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，有效地控制結(jié)石通片的質(zhì)量，彌補(bǔ)現(xiàn)有質(zhì)量控制技術(shù)的不足，從而確保結(jié)石通片的有效性、安全性和穩(wěn)定性。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的：一種結(jié)石通片指紋圖譜的建立方法，該方法包括采用高效液相色譜法對(duì)結(jié)石通片進(jìn)行檢測(cè)，其中色譜條件包括；色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.2％磷酸水溶液，流動(dòng)相C為甲醇；采用梯度洗脫，洗脫程序如下，其中流動(dòng)相比例均為體積百分比體積：0～10min，流動(dòng)相A為10％，流動(dòng)相B為85％；流動(dòng)相C為5％；10～20min，流動(dòng)相A為10％；流動(dòng)相B為85％→82％；流動(dòng)相C為5％→8％；20～30min，流動(dòng)相A為10％→12％；流動(dòng)相B為82％→80％；流動(dòng)相C為8％；30～60min，流動(dòng)相A為12％→17％；流動(dòng)相B為80％→75％；流動(dòng)相C為8％；檢測(cè)波長(zhǎng)為272；理論塔板數(shù)按夏佛塔苷計(jì)算不低于3000。所述結(jié)石通片指紋圖譜的建立方法，還包括通過(guò)以下步驟制備對(duì)照品溶液：取夏佛塔苷對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成每ml含夏佛塔苷0.05mg的溶液，即得。所述結(jié)石通片指紋圖譜的建立方法，還包括通過(guò)以下步驟制備供試品溶液：結(jié)石通片粉末1g，加60％甲醇30ml，回流提取40min，放冷，補(bǔ)重，濾過(guò)，濾液用30ml石油醚萃取2次，棄去石油醚，用乙酸乙酯搖提2次，每次15ml，合并濾液，水浴蒸干，殘?jiān)?0ml60％甲醇溶液溶解，過(guò)濾，補(bǔ)足重量，0.45um微孔濾膜過(guò)濾，即得。優(yōu)選地，所述結(jié)石通片指紋圖譜的建立方法，包括以下步驟：(1)制備對(duì)照品溶液：取夏佛塔苷對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成每ml含夏佛塔苷0.05mg的溶液，即得；(2)制備供試品溶液：結(jié)石通片粉末1g，加60％甲醇30ml，回流提取40min，放冷，補(bǔ)重，濾過(guò)，濾液用30ml石油醚萃取2次，棄去石油醚，用乙酸乙酯搖提2次，每次15ml，合并濾液，水浴蒸干，殘?jiān)?0ml60％甲醇溶液溶解，過(guò)濾，補(bǔ)足重量，0.45um微孔濾膜過(guò)濾，即得；(3)測(cè)定：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10ul注入高效液相色譜儀，根據(jù)以下條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，得到結(jié)石通片指紋圖譜；其中，色譜條件包括：色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.2％磷酸水溶液，流動(dòng)相C為甲醇；采用梯度洗脫，洗脫程序如下，其中流動(dòng)相比例均為體積百分比體積：0～10min，流動(dòng)相A為10％，流動(dòng)相B為85％；流動(dòng)相C為5％；10～20min，流動(dòng)相A為10％；流動(dòng)相B為85％→82％；流動(dòng)相C為5％→8％；20～30min，流動(dòng)相A為10％→12％；流動(dòng)相B為82％→80％；流動(dòng)相C為8％；30～60min，流動(dòng)相A為12％→17％；流動(dòng)相B為80％→75％；流動(dòng)相C為8％；檢測(cè)波長(zhǎng)為272；理論塔板數(shù)按夏佛塔苷計(jì)算不低于3000。所述結(jié)石通片指紋圖譜的建立方法，還包括：對(duì)多個(gè)結(jié)石通片指紋圖譜進(jìn)行比較，選出共有特征峰，得到結(jié)石通片特征指紋圖譜。所述結(jié)石通片指紋圖譜的建立方法，在于結(jié)石通片指紋圖譜或結(jié)石通片特征指紋圖譜中包含20個(gè)特征峰，各特征峰保留時(shí)間為：峰1:10.72min、峰2:11.35min、峰3:14.44min、峰4:15.36min、峰5:19.58min、峰6:20.56min、峰7:21.18min、峰8:22.43min、峰9:25.68min、峰10:26.57min、峰11:27.22min、峰12：29.35min、峰13:30.44min、峰14:31.36min、峰15:34.58min、峰16:35.56min、峰17:39.18min、峰18:43.43min、峰19:45.68min、峰20:50.57min。所述結(jié)石通片指紋圖譜的建立方法，在于結(jié)石通片指紋圖譜或結(jié)石通片特征指紋圖譜中，以夏佛塔苷為參照峰，各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間為：峰1：0.5438、峰2:0.5642、峰3:0.7514、峰4：0.7907、峰5:1、峰6:1.0686、峰7:1.0891、峰8:1.1732、峰9:1.3583、峰10:1.3812、峰11:1.4547、峰12:1.5358、峰13:1.5742、峰14：1.6397、峰15:1.7273、峰16:1.7909、峰17:1.9850、峰18:2.1555、峰19:2.2651、峰20:2.5118所述結(jié)石通片指紋圖譜或結(jié)石通片特征指紋圖譜中，5號(hào)鋒為夏佛塔苷對(duì)照峰。色譜條件的對(duì)比(1)色譜柱：比較C18柱、苯基柱、氨基柱等常用色譜柱，發(fā)現(xiàn)C8柱與苯基柱對(duì)結(jié)石通片中成分保留極差，不能全面反映結(jié)石通片成分。氨基柱為正向分配體系，不適合本次實(shí)驗(yàn)。選擇C18柱進(jìn)行分離，得到了較好的效果。(2)流動(dòng)相：通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，單純使用乙腈-磷酸水體系或者甲醇-磷酸水體系，其樣品溶液不出峰或出峰很少，上述體系的分離效果差，無(wú)法將藥品中的成分盡可能的分離，從而很難依據(jù)其圖譜進(jìn)行鑒別，同時(shí)由于結(jié)石通里面成分極性相差較大，使用單一體系比不能照顧全部的成分，單純使用水來(lái)做無(wú)機(jī)相，分離效果差，峰形難看，保留時(shí)間波動(dòng)較大，根本不能滿足特征圖譜的建立要求。結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)的流動(dòng)相及其分離的結(jié)石通片中未知成分的峰的特點(diǎn)，通過(guò)創(chuàng)造性勞動(dòng)，最終確定使用乙腈-磷酸水-甲醇的三元體系，此條件下，各色譜峰峰形尖銳，分離度較好，保留時(shí)間適中。(3)檢測(cè)波長(zhǎng)：通過(guò)DAD色譜掃描技術(shù)，本發(fā)明選取了272nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，在此波長(zhǎng)下，色譜法較多，基線平穩(wěn)，各峰分離度較好。本發(fā)明還提供一種結(jié)石通片的鑒定方法，該方法包括將根據(jù)上述方法建立待測(cè)樣品指紋圖譜或特征指紋圖譜與根據(jù)上述方法建立的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜或特征指紋圖進(jìn)行比較，以鑒別真?zhèn)?。結(jié)石通片質(zhì)量控制：利用中藥指紋圖譜計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)軟件，將結(jié)石通片指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行比較，結(jié)石通片指紋圖譜以20個(gè)特征峰計(jì)算相似度不低于0.8的結(jié)石通片為質(zhì)量合格，本發(fā)明將結(jié)石通片作為一個(gè)整體對(duì)待，通過(guò)比較其特征峰可以找出不同批次之間的細(xì)微差異，適于對(duì)結(jié)石通片品質(zhì)的鑒別和控制。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：1、現(xiàn)行《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》中，結(jié)石通片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀、檢查項(xiàng)目，不能有效的控制結(jié)石通片質(zhì)量。指紋圖譜技術(shù)是中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵技術(shù)之一，是中藥質(zhì)量控制的最先進(jìn)技術(shù)，我們運(yùn)用指紋圖譜技術(shù)有效的控制結(jié)石通片的質(zhì)量，彌補(bǔ)了現(xiàn)有質(zhì)量控制技術(shù)的不足，只要供選擇的制劑中出現(xiàn)本申請(qǐng)所指定的指紋圖譜，即可確認(rèn)為結(jié)石通片，從而確保結(jié)石通片的有效性，安全性。2、采用高效液相色譜法確定結(jié)石通片指紋圖譜的過(guò)程中，通過(guò)流動(dòng)相、分離條件及參數(shù)的選擇，最終選用乙腈有機(jī)相，可減少由于梯度變化引起的梯度峰，選擇體積分?jǐn)?shù)比為0.2的磷酸為流動(dòng)相B進(jìn)行調(diào)節(jié)峰前沿，通過(guò)具體時(shí)間程序改變流動(dòng)相比例，以上過(guò)程的具體參數(shù)相互配合，使目標(biāo)峰均能與雜質(zhì)峰有很好的分離，同時(shí)能很好的相應(yīng)及相對(duì)穩(wěn)定的保留時(shí)間，從而得到一個(gè)良好的特征圖譜。3、本發(fā)明采用結(jié)石通片指紋圖譜作為結(jié)石通片制劑的質(zhì)量控制手段，既避免了因只測(cè)定一、二個(gè)化學(xué)成分而判定制劑整體質(zhì)量的片面性，又減少了為質(zhì)量達(dá)標(biāo)而人為處理的可能性，本發(fā)明為完整、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)結(jié)石通片的質(zhì)量提供了有效方法，從而使產(chǎn)品的質(zhì)量和療效得到保證。4、本發(fā)明具有簡(jiǎn)便，易于掌握，穩(wěn)定，精密度高，重現(xiàn)性好的特點(diǎn)。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例1中所述結(jié)石通片20個(gè)特征峰的指紋圖譜。圖2為實(shí)施例2中結(jié)石通片十批樣品指紋圖譜。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：結(jié)石通片HPLC特征圖譜建立實(shí)驗(yàn)1.儀器、試藥和供試樣品儀器：高效液相色譜儀：waterse2695泵，UV2998檢測(cè)器電子天平：CP214奧豪斯儀器對(duì)照品：夏佛塔苷(四川省維克奇生物科技有限公司制，HPLC大于98)，批號(hào)：121015樣品：結(jié)石通片(廣西梧州制藥(集團(tuán))股份有限公司提供)，批號(hào)分別為：140603、140204、140605、140703、140704、140705、140706、140707、140802、140803、1408052.色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A；以0.2％磷酸水溶液為流動(dòng)相B；以甲醇為流動(dòng)相C，溫度為室溫，流速為1.0ml/min，按以下程序進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為272nm；理論塔板數(shù)按夏佛塔苷計(jì)應(yīng)不低于3000；0～10min，流動(dòng)相A為10％，流動(dòng)相B為85％；流動(dòng)相C為5％；10～20min，流動(dòng)相A為10％；流動(dòng)相B為85％→82％；流動(dòng)相C為5％→8％；20～30min，流動(dòng)相A為10％→12％；流動(dòng)相B為82％→80％；流動(dòng)相C為8％；30～60min，流動(dòng)相A為12％→17％；流動(dòng)相B為80％→75％；流動(dòng)相C為8％。即，0分鐘至10分鐘內(nèi)，流動(dòng)相A體積比例為10％，流動(dòng)相B體積比例為85％；流動(dòng)相C體積比例為5％；10分鐘至20分鐘內(nèi)，流動(dòng)相A體積比例為10％；流動(dòng)相B體積比例由85％漸變至體積比例82％；流動(dòng)相C體積比例由5％漸變至體積比例8％；20分鐘至30分鐘內(nèi)，流動(dòng)相A體積比例由10％漸變至體積比例12％；流動(dòng)相B體積比例由82％漸變至體積比例80％；流動(dòng)相C體積比例為8％；30分鐘至60分鐘內(nèi)，流動(dòng)相A體積比例由12％漸變至體積比例17％；流動(dòng)相B體積比例由80％漸變至體積比例75％；流動(dòng)相C體積比例為8％。3.對(duì)照品溶液的制備取夏佛塔苷對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成每ml含夏佛塔苷0.05mg的溶液，即得。4.供試品溶液的制備:結(jié)石通片粉末1g，加60％甲醇30ml，回流提取40min，放冷，補(bǔ)重，濾過(guò)，濾液用30ml石油醚萃取2次，棄去石油醚，用乙酸乙酯搖提2次，每次15ml，合并濾液，水浴蒸干，殘?jiān)?0ml60％甲醇溶液溶解，過(guò)濾，補(bǔ)足重量，0.45um微孔濾膜過(guò)濾，即得。5.結(jié)石通片標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定取結(jié)石通片10批，按照供試品溶液的制備方法制備供試品，在上述液相色譜條件下，分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各10ul，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。依據(jù)10批樣品的指紋圖譜，制定特征圖譜。供試品特征圖中應(yīng)呈現(xiàn)20個(gè)特征峰，其中1個(gè)峰應(yīng)與相應(yīng)的對(duì)照品峰保留時(shí)間相一致；以夏佛塔苷參照峰為S峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果表明，各共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2％，符合指紋圖譜分析要求。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，相對(duì)保留時(shí)間規(guī)定值為峰1：0.5438、峰2:0.5642、峰3:0.7514、峰4：0.7907、峰5:1、峰6:1.0686、峰7:1.0891、峰8:1.1732、峰9:1.3583、峰10:1.3812、峰11:1.4547、峰12:1.5358、峰13:1.5742、峰14：1.6397、峰15:1.7273、峰16:1.7909、峰17:1.9850、峰18:2.1555、峰19:2.2651、峰20:2.5118。在20個(gè)特征峰中，5號(hào)峰與夏佛塔苷對(duì)應(yīng)的峰，其保留時(shí)間一致。表1共有特征峰相對(duì)保留時(shí)間表峰號(hào)相對(duì)保留時(shí)間10.543820.564230.751440.79075161.068671.089181.173291.3583101.3812111.4547121.5328131.5742141.6397151.7273161.7909171.985182.1555192.2651202.5118實(shí)施例2：結(jié)石通片HPLC特征圖譜建立結(jié)石通片由廣西梧州制藥(集團(tuán))股份有限公司提供。照高效液相色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄VID)測(cè)定：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A；以0.2％磷酸水溶液為流動(dòng)相B；以甲醇為流動(dòng)相C，溫度為室溫，流速為1.0ml/min，按以下程序進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為272nm；理論塔板數(shù)按夏佛塔苷計(jì)應(yīng)不低于3000；0～10min，流動(dòng)相A為10％，流動(dòng)相B為85％；流動(dòng)相C為5％；10～20min，流動(dòng)相A為10％；流動(dòng)相B為85％→82％；流動(dòng)相C為5％→8％；20～30min，流動(dòng)相A為10％→12％；流動(dòng)相B為82％→80％；流動(dòng)相C為8％；30～60min，流動(dòng)相A為12％→17％；流動(dòng)相B為80％→75％；流動(dòng)相C為8％；即，0分鐘至10分鐘內(nèi)，流動(dòng)相A體積比例為10％，流動(dòng)相B體積比例為85％；流動(dòng)相C體積比例為5％；10分鐘至20分鐘內(nèi)，流動(dòng)相A體積比例為10％；流動(dòng)相B體積比例由85％漸變至體積比例82％；流動(dòng)相C體積比例由5％漸變至體積比例8％；20分鐘至30分鐘內(nèi)，流動(dòng)相A體積比例由10％漸變至體積比例12％；流動(dòng)相B體積比例由82％漸變至體積比例80％；流動(dòng)相C體積比例為8％；30分鐘至60分鐘內(nèi)，流動(dòng)相A體積比例由12％漸變至體積比例17％；流動(dòng)相B體積比例由80％漸變至體積比例75％；流動(dòng)相C體積比例為8％。對(duì)照品溶液的制備：取夏佛塔苷對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成每ml含夏佛塔苷0.05mg的溶液，即得。供試品溶液的制備：結(jié)石通片粉末1g，加60％甲醇30ml，回流提取40min，放冷，補(bǔ)重，濾過(guò)，濾液用30ml石油醚萃取2次，棄去石油醚，用乙酸乙酯搖提2次，每次15ml，合并濾液，水浴蒸干，殘?jiān)?0ml60％甲醇溶液溶解，過(guò)濾，補(bǔ)足重量，0.45um微孔濾膜過(guò)濾，即得。測(cè)定法：分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各10ul，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品特征圖中應(yīng)呈現(xiàn)20個(gè)特征峰，其中1個(gè)峰應(yīng)與相應(yīng)的對(duì)照品峰保留時(shí)間相一致；以夏佛塔苷參照峰為S峰，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果表明，各共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2％，符合指紋圖譜分析要求。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，相對(duì)保留時(shí)間規(guī)定值為峰1：0.5438、峰2:0.5642、峰3:0.7514、峰4：0.7907、峰5:1、峰6:1.0686、峰7:1.0891、峰8:1.1732、峰9:1.3583、峰10:1.3812、峰11:1.4547、峰12:1.5358、峰13:1.5742、峰14：1.6397、峰15:1.7273、峰16:1.7909、峰17:1.9850、峰18:2.1555、峰19:2.2651、峰20:2.5118。在20個(gè)特征峰中，5號(hào)峰與夏佛塔苷對(duì)應(yīng)的峰，其保留時(shí)間一致。