專利名稱：利用一維微流控生物芯片檢測細(xì)胞中基因突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微全分析系統(tǒng)的生物學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，尤其涉及一維微流控生物芯片在細(xì)胞基因突變分析中的應(yīng)用開發(fā)。
背景技術(shù)：
美、英、中等七國已于2001年二月宣布完成人類基因組序列的分析初稿，使人類生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域從基因組時代轉(zhuǎn)入了后基因組時代，即功能基因組時代。遺傳學(xué)家普遍認(rèn)為后基因組時代的一個重要努力方向便是分析人類基因序列的變異，因?yàn)檠芯咳祟怐NA序列的突變，有助于更加深入的了解人類疾病的產(chǎn)生、發(fā)展以及對藥物治療的反應(yīng)，因此突變的分析檢測方法就顯得非常重要。1985以前，利用Southern印跡法，可以篩選出基因的缺失、插入和移碼重組等突變形式。對于用該法不能檢測的突變，只能應(yīng)用復(fù)雜費(fèi)時的DNA序列測定分析法。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)是突變研究中的最重大進(jìn)展，使基因突變檢測技術(shù)有了長足的發(fā)展，但是PCR技術(shù)的費(fèi)時、容易出現(xiàn)假陽性而且不能同時檢測多個靶位點(diǎn)等缺點(diǎn)限制了PCR方法在突變檢測中的應(yīng)用。微陣列芯片(Microarray)的出現(xiàn)為突變檢測提供了一種十分高效的檢測平臺，直接實(shí)現(xiàn)了突變分析的高通量和信息集成，然而該方法的分析儀器非常昂貴，而且檢測靈敏度低。微流控技術(shù)為實(shí)現(xiàn)突變檢測的微量化、快速化及高靈敏度提供了可能，但是在高通量性能上還有待進(jìn)一步發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種可應(yīng)用于細(xì)胞基因突變的識別和分析的新型檢測方法，以解決當(dāng)前基因突變分析方法中存在的微量檢測、高靈敏度以及高通量分析等特點(diǎn)難以并存的缺陷，并促進(jìn)該技術(shù)領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的利用一維微流控生物芯片檢測細(xì)胞中基因突變的方法，包括一維微流控生物芯片上二氧化硅微珠用堿活化，再用生物素與親和素進(jìn)行預(yù)處理，然后分別加入生物素修飾的突變檢測捕獲探針，將修飾了突變檢測捕獲探針的二氧化硅微珠逐個移入所述生物芯片微通道的小室，形成功能化微珠陣列；將總RNA或靶DNA樣品于包含有熒光探針的雜交緩沖液中稀釋，并在壓力驅(qū)動下流過微通道進(jìn)入功能化微珠陣列，雜交后將含有甲酰胺的高嚴(yán)謹(jǐn)洗脫液注入通道進(jìn)行洗脫，最后通過熒光倒置顯微鏡觀察及拍攝微珠表面熒光，并用軟件對顆粒的表面熒光強(qiáng)度進(jìn)行估算，根據(jù)熒光強(qiáng)度的差別判斷該檢測位點(diǎn)的突變類型。
所述總RNA與熒光探針的比例為1.5×107克∶1摩爾，DNA與熒光探針的比例大于或等于56克∶1摩爾；所述壓力驅(qū)動下雜交緩沖液的流速為0.1μl/min；所述熒光探針為四甲基羅丹明修飾的信號探針；所述高嚴(yán)謹(jǐn)洗脫液含有體積百分?jǐn)?shù)為60％的甲酰胺。


圖1為一維微流控生物芯片用于檢測細(xì)胞基因突變的流程圖；圖2為本發(fā)明中采用的三明治雜交模型圖；1-二氧化硅微珠， 2-包被的生物素化的牛血清白蛋白，3-鏈酶親和素，4-生物素修飾的捕獲探針，5-突變檢測基因的核酸片斷，6-四甲基羅丹明修飾的信號探針。
圖3為一維微流控生物芯片檢測基因突變的靈敏度結(jié)果；圖4為一維微流控生物芯片檢測CNE2、A549和SKBr-3三種腫瘤細(xì)胞p53基因175位密碼子突變情況的結(jié)果。
一維微流控生物芯片采用三明治模型作為雜交檢測方法，該模型原理是如圖2所示，生物素化的牛血清白蛋白2通過物理吸附作用結(jié)合到固相界面二氧化硅微珠1上，鏈酶親和素3與生物素發(fā)生有力結(jié)合并固定在二氧化硅微珠表面，生物素修飾的捕獲探針4通過修飾的生物素與二氧化硅微珠表面的親和素3特異性結(jié)合并固定在二氧化硅微珠上，生物素修飾的捕獲探針4能特異性的選擇識別靶核酸序列5中的互補(bǔ)匹配序列，而另外一條四甲基羅丹明修飾的信號探針6能與靶核酸序列5匹配結(jié)合，三者結(jié)合后形成了類似于三明治的雜交結(jié)構(gòu)，可以實(shí)現(xiàn)靶核酸序列非標(biāo)記情況下的特異性檢測。
本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明過程利用mRNA與DNA為檢測對象，不需要常規(guī)方法中采用的PCR過程，從而避免了PCR過程中因?yàn)槲廴緦?dǎo)致假陽性的情況；同時由于一維微流控生物芯片具有微量檢測和高通量檢測的雙重特性，因此常規(guī)突變分析方法中微量檢測、高靈敏度以及高通量分析等特點(diǎn)難以并存的缺陷得到較好的解決；本發(fā)明方法在40pM靶濃度條件下仍然能區(qū)分單堿基突變的區(qū)，采用一次進(jìn)樣就可以進(jìn)行多個目標(biāo)的同時檢測；此外本發(fā)明方法在CCD以及計算機(jī)軟件的輔助下可以實(shí)時檢測和觀察探針的雜交和洗脫過程，并有望使用本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平上的基因突變分析，為研究人類疾病的發(fā)生、發(fā)展以及個性化醫(yī)療提供一種高效的分析方法。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1，一維微流控突變檢測芯片以DNA序列為對象檢測p53基因突變1.制備突變檢測二氧化硅微珠取直徑40μm的二氧化硅微珠約10～20mg置于1.5ml的Ep管中，加入500μl 0.01M的NaOH活化表面20min，用TE清洗3次，去除上清液；加入80μl 0.1～1.0mg/ml的生物素化的牛血清白蛋白(Biotin-BSA)，置于低溫?fù)u床上4℃，350rpm搖蕩12～48h，然后用TE清洗3次，Biotin-BSA通過物理吸附作用結(jié)合到顆粒表面；加入80μl 0.1～1.0mg/ml的鏈酶親和素(Streptavidin)，置于低溫?fù)u床上4℃，350rpm搖蕩4～8h，鏈酶親和素能與顆粒表面的生物素發(fā)生有力結(jié)合并固定在顆粒表面，用TE清洗3次；分別加入50μl 0.1～1.0μM生物素修飾的突變檢測捕獲探針Capture-C、Capture-G、Capture-T和Capture-A(如表1所示)，于4℃，350rpm搖蕩12～48h，用TE清洗后4℃保存?zhèn)溆?。捕獲探針通過修飾的生物素與顆粒表面的親和素特異性結(jié)合并固定在顆粒上，從而形成了具有p53基因突變檢測能力的功能化二氧化硅顆粒。
2.制備一維微流控突變檢測芯片將聚二甲基硅氧烷與固化劑充分混合后于真空泵中除去氣泡，然后平鋪在芯片陽模板上，置于75℃烘箱中20～40min，待固化后取出，最后將聚二甲基硅氧烷(PDMS)片基從陽模板上剝離下來，該片基中包含有許多用于容納微珠的小室；將該片基放置在倒置熒光顯微鏡上，通過顯微操作的方法將直徑在40μm左右的修飾有突變檢測探針的功能化微珠放置在片基微通道中的小室中首先，使用一套進(jìn)口的燒針、拉針及磨針系統(tǒng)制備顯微操作微吸管，將微吸管固定在倒置熒光顯微鏡的顯微操作系統(tǒng)上，然后在顯微條件下，將不同的功能化微珠按照位置編碼的方式放入通道中的小室內(nèi)，每個小室對應(yīng)不同的功能化微珠用于樣品的多目標(biāo)檢測；最后用潔凈的玻片與片基緊密結(jié)合完成芯片的封裝。
3.按圖1的操作流程，將含有濃度為1pM～10nMp53-G樣品和10nM四甲基羅丹明修飾信號探針(F-probe)的雜交緩沖液(所述雜交緩沖液的成分為10mM磷酸鉀緩沖液(pH7.6)、300mMNaCl、體積百分?jǐn)?shù)為0.1％的吐溫20和體積百分?jǐn)?shù)為30％的甲酰胺)在壓力驅(qū)動下以0.1μl/min的流速通過一維生物芯片微通道中放置的突變檢測功能化微珠陣列，雜交20min后，用5μl的TE清洗通道；然后在壓力驅(qū)動下以2μl/min的流速通入含有體積百分?jǐn)?shù)為60％甲酰胺的高嚴(yán)謹(jǐn)洗脫緩沖液(所述洗脫緩沖液的成分為10mM磷酸鉀緩沖液(pH7.6)、150mMNaCl、體積百分?jǐn)?shù)為0.1％的吐溫20和體積百分?jǐn)?shù)為60％的甲酰胺)，利用匹配(Capture-C與p53-G)與單堿基不匹配(Capture-G，Capture-T，Capture-A與p53-G)序列間熱動力學(xué)差別進(jìn)行洗脫識別，5min后再次用TE清洗通道。將反應(yīng)后的芯片按照圖1所示的流程置于熒光倒置顯微鏡中的CCD成像系統(tǒng)下，對顆粒進(jìn)行觀察拍攝，并用熒光圖像分析軟件進(jìn)行分析，可獲得如圖3所示的突變檢測靈敏性能的結(jié)果。結(jié)果表明，當(dāng)靶序列濃度在0.04nM時，信噪比為4(信噪比定義為完全匹配性雜交所產(chǎn)生的熒光信號除以單堿基不匹配性雜交產(chǎn)生的熒光信號，同時認(rèn)為只有完全匹配性雜交所產(chǎn)生的熒光信號除以單堿基不匹配性雜交產(chǎn)生的熒光信號大于4時數(shù)據(jù)有效)，隨著靶序列濃度的提高，完全匹配性雜交產(chǎn)生的熒光也不斷提高，當(dāng)靶序列濃度達(dá)到3nM時，完全匹配性雜交產(chǎn)生的熒光信號達(dá)到最大，由此可見利用本發(fā)明方法能在0.04nM靶序列濃度下識別單堿基突變。
表1合成的用于檢測p53基因突變的寡核苷酸探針

實(shí)施例2，一維微流控突變檢測芯片以mRNA序列為對象檢測p53基因突變1.制備突變檢測二氧化硅微珠取直徑40μm的二氧化硅微珠約10～20mg置于1.5ml的Ep管中，加入500μl 0.01M的NaOH活化表面20min，用TE清洗3次，去除上清液；加入80μl 0.1～1.0mg/ml的生物素化的牛血清白蛋白(Biotin-BSA)，置于低溫?fù)u床上4℃，350rpm搖蕩12～48h，然后用TE清洗3次，Biotin-BSA通過物理吸附作用結(jié)合到顆粒表面；加入80μl 0.1～1.0mg/ml的鏈酶親和素(Streptavidin)，置于低溫?fù)u床上4℃，350rpm搖蕩4～8h，鏈酶親和素能與顆粒表面的生物素發(fā)生有力結(jié)合并固定在顆粒表面，用TE清洗3次；分別加入50μl 0.1～1.0μM的生物素修飾的突變檢測捕獲探針Capture-C、Capture-G、Capture-T和Capture-A(如表1所示)，于4℃，350rpm搖蕩12～48h，用TE清洗后4℃保存?zhèn)溆?。捕獲探針通過修飾的生物素與顆粒表面的親和素特異性結(jié)合并固定在顆粒上，從而形成了具有p53基因突變檢測能力的功能化二氧化硅顆粒。
2.制備一維微流控突變檢測芯片將聚二甲基硅氧烷與固化劑充分混合后于真空泵中除去氣泡，然后平鋪在芯片陽模板上，置于75℃烘箱中20～40min，待固化后取出，最后將PDMS片基從陽模板上剝離下來，該片基中包含有許多用于容納微珠的小室。將用聚二甲基硅氧烷澆鑄的一維微流控生物芯片片基放置在倒置熒光顯微鏡上，通過顯微操作的方法將直徑在40μm左右的修飾有突變檢測探針的功能化微珠放置在微通道中的小室中首先，使用一套進(jìn)口的燒針、拉針及磨針系統(tǒng)制備顯微操作微吸管，將微吸管固定在倒置熒光顯微鏡的顯微操作系統(tǒng)上，然后在顯微條件下，將不同的功能化微珠按照位置編碼的方式放入通道中的小室內(nèi)，每個小室對應(yīng)不同的功能化微珠用于樣品的多目標(biāo)檢測；最后用潔凈的玻片與片基緊密結(jié)合完成芯片的封裝。
3.對鼻咽癌細(xì)胞(CNE2)、肺癌細(xì)胞(A549)和乳腺癌細(xì)胞(SKBr-3)這三種細(xì)胞分別抽提總RNA，并通過紫外吸收方法進(jìn)行定量；分別取3μg(所述三種細(xì)胞的)總RNA于20μl的雜交緩沖液中(所述雜交緩沖液成分為10mM磷酸鉀緩沖液(pH7.6)、300mMNaCl、體積百分?jǐn)?shù)為0.1％的吐溫20和體積百分?jǐn)?shù)為30％的甲酰胺)進(jìn)行稀釋，同時加入四甲基羅丹明修飾的信號探針且使其在雜交緩沖液中的終濃度為10nM，；然后在壓力驅(qū)動下以0.1μl/min的流速通過一維生物芯片中的功能化微珠陣列，雜交反應(yīng)20min后，用TE清洗通道并在壓力驅(qū)動下用高嚴(yán)謹(jǐn)洗脫緩沖液洗脫5min(所述洗脫緩沖液的成分為10mM磷酸鉀緩沖液(pH7.6)、150mMNaCl、體積百分?jǐn)?shù)為0.1％的吐溫20和體積百分?jǐn)?shù)為60％的甲酰胺)，流速為2μl/min；將反應(yīng)后的芯片置于熒光倒置顯微鏡中的CCD成像系統(tǒng)下，對顆粒進(jìn)行觀察拍攝，并用熒光圖像分析軟件進(jìn)行分析，可獲得如圖4所示的突變檢測靈敏性能的結(jié)果。結(jié)果顯示，三種腫瘤細(xì)胞中只有SKBr-3細(xì)胞發(fā)生了(CGC＞CAC)的堿基轉(zhuǎn)換，而其他兩種細(xì)胞p53基因的175位密碼子沒有發(fā)生突變，仍然為野生型。該結(jié)果與傳統(tǒng)的序列測定結(jié)果是一致的。
權(quán)利要求
1.一種利用一維微流控生物芯片檢測細(xì)胞中基因突變的方法，包括一維微流控生物芯片上二氧化硅微珠用堿活化，再用生物素與親和素進(jìn)行預(yù)處理，然后分別加入生物素修飾的突變檢測捕獲探針，將修飾了突變檢測捕獲探針的二氧化硅微珠逐個移入所述生物芯片微通道的小室，形成功能化微珠陣列，其特征在于將總RNA或靶DNA樣品于包含有熒光探針的雜交緩沖液中稀釋，并在壓力驅(qū)動下流過微通道進(jìn)入功能化微珠陣列，雜交后將含有甲酰胺的高嚴(yán)謹(jǐn)洗脫液注入通道進(jìn)行洗脫，最后通過熒光倒置顯微鏡觀察及拍攝微珠表面熒光，并用軟件對顆粒的表面熒光強(qiáng)度進(jìn)行估算，根據(jù)熒光強(qiáng)度的差別判斷該檢測位點(diǎn)的突變類型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用一維微流控生物芯片檢測細(xì)胞中基因突變的方法，其特征在于所述總RNA與熒光探針的比例為1.5×107克∶1摩爾，DNA與熒光探針的比例大于或等于56克∶1摩爾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用一維微流控生物芯片檢測細(xì)胞中基因突變的方法，其特征在于所述壓力驅(qū)動下的流速為0.1μl/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用一維微流控生物芯片檢測細(xì)胞中基因突變的方法，其特征在于所述熒光探針為四甲基羅丹明修飾的信號探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用一維微流控生物芯片檢測細(xì)胞中基因突變的方法，其特征在于所述高嚴(yán)謹(jǐn)洗脫液含有體積百分?jǐn)?shù)為60％的甲酰胺。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用一維微流控生物芯片檢測細(xì)胞中基因突變的方法，其特征在于構(gòu)建基于一維微流控微珠陣列芯片的功能化的突變檢測芯片，將總RNA或靶DNA樣品于包含有熒光探針的雜交緩沖液中稀釋，并在壓力驅(qū)動下流過微通道進(jìn)入功能化微珠陣列，雜交后將含有甲酰胺的高嚴(yán)謹(jǐn)洗脫液注入通道進(jìn)行洗脫，最后通過熒光倒置顯微鏡觀察及拍攝微珠表面熒光，并用軟件對顆粒的表面熒光強(qiáng)度進(jìn)行估算，根據(jù)熒光強(qiáng)度的差別判斷該檢測位點(diǎn)的突變類型。本發(fā)明方法解決了基因突變分析方法中微量檢測、高靈敏度以及高通量分析等特點(diǎn)難以并存的缺陷，并有望實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平上的基因突變分析。
文檔編號G01N33/48GK101046448SQ200710034888
公開日2007年10月3日 申請日期2007年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月8日
發(fā)明者王柯敏, 張何, 羊小海, 文建輝, 譚蔚泓 申請人:湖南大學(xué)