專利名稱：一種微流控單細(xì)胞活性氧自動分析儀的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微流控分析平臺技術(shù)，尤其涉及一種可以自動實現(xiàn)微流控芯片上細(xì)胞熒光標(biāo)記、細(xì)胞上樣、單細(xì)胞捕獲、溶膜、電泳分離和胞內(nèi)活性氧檢測的微流控單細(xì)胞活性氧自動分析儀。
背景技術(shù)：
細(xì)胞是生物體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動的基本單元。在細(xì)胞的代謝過程中會不斷產(chǎn)生各種活性氧(ROS)，例如超氧陰離子(Of)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(0H ·)、脂自由基(R00 ·)、過氧亞硝基陰離子(0N00-)等。適當(dāng)水平的活性氧對生物正常的生理過程是重要的，它們參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長調(diào)節(jié)、重要生物物質(zhì)的合成及細(xì)胞代謝。當(dāng)生物處于氧化脅迫、外源性藥物或毒素刺激條件下，過量活性氧的產(chǎn)生并積累則會誘導(dǎo)一系列有害的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生各種疾病及老化。近幾年細(xì)胞水平上活性氧的分析研究非常令人關(guān)注，但由于細(xì)胞尺度小(通常直徑在μ m級、體積在pL級)、胞內(nèi)活性氧含量低 (一般為amol zmol級)、生化反應(yīng)快(通常在ms級)，使得目前一些分析方法多是將各種活性氧作為一個整體獲得的結(jié)果多是基于靜態(tài)、宏觀的觀察和整體平均而推導(dǎo)出來的。 因此，發(fā)展高選擇性、高靈敏度、能同時識別和檢測單個細(xì)胞內(nèi)不同活性氧的儀器裝置及分析方法，對于發(fā)現(xiàn)宏觀檢測所不能獲得的寶貴信息，進(jìn)一步闡明活性氧種類、水平與生物生理、病理的相互關(guān)系，乃至疾病的早期診斷具有十分重要的意義。目前，用于細(xì)胞水平上活性氧分析的商品化儀器，主要有激光掃描共聚焦顯微鏡、 掃描隧道顯微鏡和流式細(xì)胞儀。激光掃描共聚焦顯微鏡和掃描隧道顯微鏡的優(yōu)點是可以對細(xì)胞內(nèi)活性氧進(jìn)行原位、實時動態(tài)和空間上的觀察與分析；其不足是受其質(zhì)量測限高、分辨力低等因素限制，難以定量檢測單細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量。流式細(xì)胞儀作為半個世紀(jì)以來科學(xué)研究和工程技術(shù)不斷進(jìn)步的結(jié)晶，被廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。例如美國 Bekman-Coulter公司的Cytomics FC500流式細(xì)胞儀，其優(yōu)點是可以對直線流動的細(xì)胞進(jìn)行快速分選和單細(xì)胞內(nèi)多參數(shù)的測量。其不足是由于其測量數(shù)據(jù)是與生物樣本比較的相對值，抗體非特異性結(jié)合直接影響細(xì)胞陽性、陰性的界定，因此需要在使用前對系統(tǒng)進(jìn)行方法校準(zhǔn)或標(biāo)定，存在操作繁瑣、細(xì)胞耗量大、儀器體積龐大、價格昂貴等問題。近年來，以微流控芯片為核心的微流控分析在核酸、蛋白質(zhì)、小分子等方面的應(yīng)用研究發(fā)展迅猛，并正在向單細(xì)胞、單分子等領(lǐng)域滲透。與傳統(tǒng)的宏觀研究體系相比，微流控芯片作為單細(xì)胞研究平臺具有以下優(yōu)勢1)芯片通道尺寸(通常10-100 μ m)與典型晡乳類細(xì)胞的直徑大小(一般為10-40 μ m)相匹配，便于細(xì)胞操縱；2)芯片通道的二維或三維網(wǎng)絡(luò)式封閉結(jié)構(gòu)，便于形成與細(xì)胞生理狀態(tài)相接近的特定空間環(huán)境；3)芯片的平板式幾何構(gòu)型，容易對細(xì)胞進(jìn)行觀察、檢測；4)芯片通道尺寸的減小，降低了細(xì)胞試樣與試劑的消耗，同時可使分析速度成十倍、百倍地提高，便于實現(xiàn)高通量分析力)將各種細(xì)胞操縱單元與電泳分離、檢測技術(shù)組合，便于實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)、尤其是單個細(xì)胞內(nèi)多種化學(xué)組分的分離與定性、定量分析。迄今為止，已開展的微流控芯片細(xì)胞研究工作，其絕大部分集中在細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞分選、體外細(xì)胞微環(huán)境模擬、細(xì)胞生命過程鑒定等。少量報道的微流控單細(xì)胞組分分析是一種創(chuàng)新性嘗試，其單個目標(biāo)細(xì)胞的獲得(即單細(xì)胞捕獲)仍需要借助顯微鏡等觀察裝置，存在手工操作、速度慢、檢測靈敏度低、裝置復(fù)雜等問題。微流控單細(xì)胞組分分析通常包括單細(xì)胞進(jìn)樣(細(xì)胞上樣、單細(xì)胞捕獲)、溶膜、電泳分離及胞內(nèi)組分檢測等操作步驟。目前，微流控單細(xì)胞組分分析所面臨的主要技術(shù)問題是1)缺少有效操縱單細(xì)胞的手段；2) 缺少自動獲知單個目標(biāo)細(xì)胞已被捕獲的適配技術(shù)；幻檢測靈敏度有待進(jìn)一步提高；4)缺少自動實現(xiàn)整個分析過程的儀器聯(lián)用技術(shù)。對于微流控單細(xì)胞活性氧分析來講，新型熒光探針及其裝載方法的發(fā)展，為單細(xì)胞內(nèi)活性氧的特異性識別與熒光檢測奠定了基礎(chǔ)。然而，由于受上述技術(shù)瓶頸和芯片上細(xì)胞活性氧標(biāo)記技術(shù)的限制，目前還沒有出現(xiàn)能夠檢測單個細(xì)胞內(nèi)活性氧的微流控分析儀器。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種微流控單細(xì)胞活性氧自動分析儀。利用本發(fā)明可以實現(xiàn)微流控芯片上細(xì)胞熒光標(biāo)記、細(xì)胞上樣、單細(xì)胞捕獲、溶膜、電泳分離和胞內(nèi)活性氧檢測等操作，達(dá)到無需借助顯微境以及手工操作即可自動實現(xiàn)單細(xì)胞內(nèi)活性氧分析的目的。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)措施來實現(xiàn)所述的分析儀由系統(tǒng)控制模塊、細(xì)胞熒光標(biāo)記模塊、細(xì)胞/流體電動操縱模塊、細(xì)胞/流體液壓操縱模塊、微流控芯片與芯片操作平臺、單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊、熒光檢測模塊、信號處理與數(shù)據(jù)采集模塊、程序軟件組成；所述的系統(tǒng)控制模塊的核心是一單片機(jī)；所述的細(xì)胞熒光標(biāo)記模塊包括細(xì)胞熒光標(biāo)記所需微區(qū)溫度的控制與監(jiān)測；所述的細(xì)胞 /流體電動操縱模塊由六路直流高壓組成；所述的細(xì)胞/流體液壓操縱模塊由二路微注射泵組成；所述的熒光檢測模塊由激發(fā)光學(xué)模塊、熒光收集光學(xué)模塊、激發(fā)光與芯片通道對中成像光學(xué)模塊組成；所述的程序軟件由單片機(jī)控制程序和PC機(jī)應(yīng)用程序組成。本發(fā)明的目的還可通過如下技術(shù)措施來實現(xiàn)所述的單片機(jī)通過RS-485通訊接口與PC機(jī)的串行口相連，組成通訊、運算、控制、
顯示/記錄等功能；細(xì)胞熒光標(biāo)記所需微區(qū)溫度的控制與監(jiān)測單片機(jī)順序連接溫控電路、微型熱敏電阻，組成細(xì)胞熒光標(biāo)記的微區(qū)溫度控制；微型熱敏電阻順序連接A/D轉(zhuǎn)換與溫度補償電路、單片機(jī)，組成細(xì)胞熒光標(biāo)記的微區(qū)溫度監(jiān)測；六路直流高壓分別通過高壓導(dǎo)線、鉬絲電極與微流控芯片的貯液池對應(yīng)連接，實現(xiàn)細(xì)胞/流體的電動操縱單片機(jī)順序連接一個八通道12位D/A轉(zhuǎn)換電路、一個八通道放大電路、六個并列的DC-DC高壓模塊、六個并列的“雙刀雙擲”高壓繼電器，組成輸出模式為“懸空、高壓、接地”的所述六路直流高壓；六個并列的DC-DC高壓模塊與單片機(jī)之間連接有電壓/電流測量電路，組成所述的六路直流高壓的輸出電壓/電流監(jiān)測；單片機(jī)與六個并列的“雙刀雙擲”高壓繼電器之間連接有繼電器控制電路，組成所述的六路直流高壓輸出模式一 “懸空、高壓、接地”的轉(zhuǎn)換；二路微注射泵分別通過內(nèi)徑為50-500微米的疏水性聚合材料導(dǎo)管與微流控芯片的貯液池對應(yīng)連接，實現(xiàn)細(xì)胞/流體的液壓操縱單片機(jī)順序連接驅(qū)動電路、二個并列的步進(jìn)電機(jī)、二個并列的微動推拉裝置、二個并列的微型注射器，組成工作模式為“推進(jìn)/灌注、等待、回拉”的所述二路微注射泵；微流控芯片與芯片操作平臺，微流控芯片可為不同材質(zhì)(如，石英、玻璃、PDMS 等)、不同結(jié)構(gòu)(如，貯液池< 8個)的微流控芯片微流控芯片的樣品池底部沉積有適合細(xì)胞熒光標(biāo)記的微型熱敏電阻，微流控芯片分離通道的入口處沉積有適合單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”的二對微電極(A1-A2，B1-B2)；微流控芯片水平固定于芯片操作平臺上，芯片操作平臺可以X、Y、Z軸三維調(diào)節(jié)， 且能實現(xiàn)微流控芯片與聚焦物鏡焦平面相對位置的任意匹配關(guān)系；單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊單片機(jī)與恒流源的輸入端相連，恒流源的輸出端與微流控芯片分離通道入口處的二對微電極(A1-A2、B1-B2)串聯(lián)連接；電壓測量電路1、電壓測量電路2的輸入端分別與所述的二對微電極(A1-A2、 B1-B2)并聯(lián)連接，測量電路1、2的輸出端通過甄別電路與單片機(jī)相連，組成被捕獲單細(xì)胞到達(dá)分離通道入口時的識別，并同時觸發(fā)單細(xì)胞分析中“單細(xì)胞捕獲、溶膜”操作的自動切換和數(shù)據(jù)采集；熒光檢測模塊由激發(fā)光學(xué)模塊、熒光收集光學(xué)模塊、激發(fā)光與芯片通道對中成像光學(xué)模塊組成激發(fā)光學(xué)模塊包括依次設(shè)置的激光器、準(zhǔn)直組件、激發(fā)濾光片、光敏二極管的光軸與熒光收集光學(xué)模塊包括依次設(shè)置的聚焦物鏡、分色分光鏡、帶通濾光片、透鏡、孔徑光闌、 發(fā)射濾光片組、光電倍增管的光軸呈90度角，其中分色分光鏡與激發(fā)光學(xué)模塊的光軸呈45 度角放置；激發(fā)光與芯片通道對中成像光學(xué)模塊包括依次設(shè)置的(XD、柱狀物鏡、減光片、反光鏡的光軸與熒光收集光學(xué)模塊的光軸呈90度角，其中反光鏡與熒光收集光學(xué)模塊的光軸呈45度角放置；所述的信號處理與數(shù)據(jù)采集模塊光電倍增管、光敏二極管分別連接前置放大器1、前置放大器2的輸入端，前置放大器1、前置放大器2的輸出端順序連接對數(shù)放大電路、數(shù)據(jù)采集板、PC機(jī)；單片機(jī)通過單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊提供的觸發(fā)信號，控制數(shù)據(jù)采集板的開啟；所述的程序軟件，由單片機(jī)控制程序和PC機(jī)應(yīng)用程序組成，包括預(yù)置微流控單細(xì)胞活性氧分析中的操作步驟，每步操作所對應(yīng)細(xì)胞熒光標(biāo)記的溫度、各路直流高壓/微注射泵的輸出模式、運行時間等實驗參數(shù)；控制微流控單細(xì)胞分析中細(xì)胞熒光標(biāo)記、細(xì)胞上樣、單細(xì)胞捕獲、溶膜、電泳分離和單細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測等操作所對應(yīng)細(xì)胞熒光標(biāo)記溫度、各路直流高壓、各路微注射泵不同輸出模式間的獨立或/和同步輸出的可編程輸出流程，包括單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”的自動切換；
實時顯示/記錄熒光標(biāo)記溫度、各路直流高壓/微注射泵的運行狀態(tài)、直流高壓的輸出電壓/電流、數(shù)據(jù)采集板的輸出信號。所述的微型熱敏電阻是具有加熱和感溫雙重作用的微型熱敏電阻。所述的細(xì)胞熒光標(biāo)記的微區(qū)溫度范圍為室溫至60度。所述的六路直流高壓的電壓范圍為“0 5000Vdc”。所述的二路微注射泵的灌注流量范圍為“0. 005 μ 1/min 500 μ 1/min”。所述的激光器為473nm、532nm、635nm、730nm半導(dǎo)體泵浦固體激光器的任意一種， 且激光器與激發(fā)濾光片、分色分光鏡、帶通濾光片為對應(yīng)匹配關(guān)系。所述的孔徑光闌的大小在200 1000 μ m范圍內(nèi)可調(diào)。所述的發(fā)射濾光片組由500 850nm范圍內(nèi)的六個不同波段的發(fā)射濾光片組成， 且六個發(fā)射濾光片可以旋轉(zhuǎn)式切換。本發(fā)明的優(yōu)點(1)本發(fā)明提出了一種單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”的概念，利用被捕獲單細(xì)胞到達(dá)分離通道入口時的電阻變化識別單細(xì)胞的捕獲，并同時觸發(fā)“單細(xì)胞捕獲、溶膜”操作的自動切換和數(shù)據(jù)采集，從而使微流控單細(xì)胞組分分析向維持一個完全的自動化邁進(jìn)了一大
步；(2)本發(fā)明實現(xiàn)了微流控芯片上細(xì)胞熒光標(biāo)記、細(xì)胞上樣、單細(xì)胞捕獲、溶膜、電泳分離和胞內(nèi)活性氧檢測的功能集成和自動化控制，達(dá)到了無需借助顯微境以及手工操作即可自動完成單細(xì)胞活性氧分析全過程的目的，使得創(chuàng)建適應(yīng)性強、誤差范圍小的微流控單細(xì)胞組分分析更為靈活和簡便；(3)本發(fā)明提供了友好的可視化人機(jī)對話平臺，所有操作、顯示/記錄都在PC機(jī)的界面中完成，而且界面切換方便、顯示直觀明了。


圖1是本發(fā)明實施例的整體結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本發(fā)明實施例的整體組成原理圖；圖3是本發(fā)明實施例的單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊的原理圖；圖4是本發(fā)明實施例的熒光檢測模塊的結(jié)構(gòu)原理圖；圖5A是本發(fā)明實施例的測得10個肝癌細(xì)胞中H202的電泳譜圖；圖5B是本發(fā)明實施例的測得10個肝癌細(xì)胞中H202含量的柱狀圖。
具體實施例方式實施例1 該分析儀由系統(tǒng)控制模塊I、細(xì)胞熒光標(biāo)記模塊II、細(xì)胞/流體電動操縱模塊III、 細(xì)胞/流體液壓操縱模塊IV、微流控芯片與芯片操作平臺V、單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊VI、熒光檢測模塊VII、信號處理與數(shù)據(jù)采集模塊VIII、程序軟件IX組成；所述的系統(tǒng)控制模塊I的核心是一單片機(jī)3 ；所述的細(xì)胞熒光標(biāo)記模塊II包括細(xì)胞熒光標(biāo)記所需微區(qū)溫度的控制與監(jiān)測；所述的細(xì)胞/流體電動操縱模塊III由六路直流高壓組成；所述的細(xì)胞 /流體液壓操縱模塊IV由二路微注射泵組成；所述的熒光檢測模塊VII由激發(fā)光學(xué)模塊、熒光收集光學(xué)模塊、激發(fā)光與芯片通道對中成像光學(xué)模塊組成；所述的程序軟件IX由單片機(jī)控制程序和PC機(jī)應(yīng)用程序組成，單片機(jī)3通過RS-485通訊接口 2與PC機(jī)1的串行口相連，組成通訊、運算、控制、顯示/記錄功能；所述的細(xì)胞熒光標(biāo)記所需微區(qū)溫度的控制與監(jiān)測單片機(jī)3順序連接溫控電路4、微型熱敏電阻5，組成細(xì)胞熒光標(biāo)記的微區(qū)溫度控制；微型熱敏電阻5順序連接A/D轉(zhuǎn)換與溫度補償電路6、單片機(jī)3，組成細(xì)胞熒光標(biāo)記的微區(qū)溫度監(jiān)測；所述的六路直流高壓單片機(jī)3順序連接一個八通道12位D/A轉(zhuǎn)換電路7、一個八通道放大電路8、六個并列的DC-DC高壓模塊9、六個并列的“雙刀雙擲”高壓繼電器10，組成輸出模式為“懸空、 高壓、接地”的所述六路直流高壓；六個并列的DC-DC高壓模塊9與單片機(jī)3之間連接有電壓/電流測量電路11，組成所述的六路直流高壓的輸出電壓/電流監(jiān)測；單片機(jī)3與六個并列的“雙刀雙擲”高壓繼電器10之間連接有繼電器控制電路12，組成所述的六路直流高壓輸出模式一 “懸空、高壓、接地”的轉(zhuǎn)換；所述的二路微注射泵單片機(jī)3順序連接驅(qū)動電路13、二個并列的步進(jìn)電機(jī)14、二個并列的微動推拉裝置15、二個并列的微型注射器16，組成工作模式為“推進(jìn)/灌注、等待、回拉”的所述二路微
注射泵；所述的微流控芯片與芯片操作平臺V 微流控芯片17的樣品池底部沉積有適合細(xì)胞熒光標(biāo)記的微型熱敏電阻5，微流控芯片分離通道的入口處沉積有適合單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”的二對微電極(A1-A2， B1-B2)；微流控芯片17水平固定于芯片操作平臺18上，芯片操作平臺18可以X、Y、Z軸三維調(diào)節(jié)，且能實現(xiàn)微流控芯片17與聚焦物鏡201焦平面相對位置的任意匹配關(guān)系；所述的單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊VI 單片機(jī)3與恒流源19的輸入端相連，恒流源19的輸出端與微流控芯片17分離通道入口處的二對微電極(Α1-Α2、Β1-Β2)串聯(lián)連接；電壓測量電路(1)21、電壓測量電路 (2)22的輸入端分別與所述的二對微電極(Α1-Α2、Β1-Β2)并聯(lián)連接，測量電路(1)21、(2)22 的輸出端通過甄別電路20與單片機(jī)3相連，組成被捕獲單細(xì)胞到達(dá)分離通道入口時的識別，并同時觸發(fā)單細(xì)胞分析中“單細(xì)胞捕獲、溶膜”操作的自動切換和數(shù)據(jù)采集；所述的激發(fā)光學(xué)模塊、熒光收集光學(xué)模塊、激發(fā)光與芯片通道對中成像光學(xué)模塊激發(fā)光學(xué)模塊包括依次設(shè)置的激光器101、準(zhǔn)直組件102、激發(fā)濾光片103、光敏二極管104的光軸與熒光收集光學(xué)模塊包括依次設(shè)置的聚焦物鏡201、分色分光鏡202、帶通濾光片203、透鏡204、孔徑光闌205、發(fā)射濾光片組206、光電倍增管207的光軸呈90度角， 其中分色分光鏡203與激發(fā)光學(xué)模塊的光軸呈45度角放置；激發(fā)光與芯片通道對中成像光學(xué)模塊包括依次設(shè)置的CCD301、柱狀物鏡302、減光片303、反光鏡304的光軸與熒光收集光學(xué)模塊的光軸呈90度角，其中反光鏡304與熒光收集光學(xué)模塊的光軸呈45度角放置；所述的信號處理與數(shù)據(jù)采集模塊VIII 光電倍增管207、光敏二極管104分別連接前置放大器(1)25、前置放大器(2) 的輸入端，前置放大器(1)25、前置放大器0)26的輸出端順序連接對數(shù)放大電路M、數(shù)據(jù)采集板23、PC機(jī)1 ；單片機(jī)3通過單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊提供的觸發(fā)信號，控制數(shù)據(jù)采集板23的開啟；所述的程序軟件IX，由單片機(jī)控制程序和PC機(jī)應(yīng)用程序組成，包括預(yù)置微流控單細(xì)胞活性氧分析中的操作步驟，每步操作所對應(yīng)細(xì)胞熒光標(biāo)記的溫度、各路直流高壓/微注射泵的輸出模式、運行時間等實驗參數(shù)；控制微流控單細(xì)胞分析中細(xì)胞熒光標(biāo)記、細(xì)胞上樣、單細(xì)胞捕獲、溶膜、電泳分離和單細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測等操作所對應(yīng)細(xì)胞熒光標(biāo)記溫度、各路直流高壓、各路微注射泵不同輸出模式間的獨立或/和同步輸出的可編程輸出流程，包括單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”的自動切換；實時顯示/記錄熒光標(biāo)記溫度、各路直流高壓/微注射泵的運行狀態(tài)、直流高壓的輸出電壓/電流、數(shù)據(jù)采集板的輸出信號。所述的細(xì)胞熒光標(biāo)記的微區(qū)溫度范圍為室溫至60度；六路直流高壓的電壓范圍為“0 5000VDC”;二路微注射泵的灌注流量范圍為“0. 005μ Ι/min 500 μ 1/min”激光器 101為473nm、532nm、635nm、730nm半導(dǎo)體泵浦固體激光器的任意一種，且激光器101與激發(fā)濾光片103、分色分光鏡202、帶通濾光片203為對應(yīng)匹配關(guān)系；所述的孔徑光闌205的大小在200 1000 μ m范圍內(nèi)可調(diào)；所述的發(fā)射濾光片組206由500 850nm范圍內(nèi)的六個不同波段的發(fā)射濾光片組成，且六個發(fā)射濾光片可以旋轉(zhuǎn)式切換。實施例2:本發(fā)明整個儀器的制造，可采用分步實施的方法，先完成各個模塊，然后將各個模塊組合連接即可。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。首先請參見附圖1。本發(fā)明一種微流控單細(xì)胞活性氧自動分析儀，由系統(tǒng)控制模塊I、細(xì)胞熒光標(biāo)記模塊H、細(xì)胞/流體電動操縱模塊III、細(xì)胞/流體液壓操縱模塊IV、微流控芯片與芯片操作平臺V、單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊VI、熒光檢測模塊VII、信號處理與數(shù)據(jù)采集模塊VIII和程序軟件組成VIIII組成。其中系統(tǒng)控制模塊I (參見附圖1，2)系統(tǒng)控制模塊，包括安裝了本發(fā)明程序軟件的PC機(jī)1、RS_485通訊接口 2、單片機(jī) 3。單片機(jī)采用ATMEL公司生產(chǎn)的增強型微功耗8位單片機(jī)ATmegal6L。單片機(jī)通過RS-485 通訊接口與PC機(jī)的串行口相連，構(gòu)成通訊、運算、控制、顯示/記錄等功能。細(xì)胞熒光標(biāo)記模塊II (參見附圖1、2)細(xì)胞熒光標(biāo)記模塊，包括單片機(jī)3、溫控電路4、沉積于微流控芯片樣品池底部的微型熱敏電阻5、A/D轉(zhuǎn)換與溫度補償電路6。單片機(jī)將存儲于其內(nèi)部的預(yù)置熒光標(biāo)記溫度值與A/D轉(zhuǎn)換與溫度補償電路送入的溫度監(jiān)測值進(jìn)行比較，當(dāng)溫度監(jiān)測值小于預(yù)置溫度值時，單片機(jī)控制溫控電路給微型熱敏電阻施加電壓，微型熱敏電阻開始對芯片樣品池(微區(qū))加熱，樣品池內(nèi)的細(xì)胞活性氧與熒光探針(染料)開始進(jìn)行衍生化反應(yīng)，使細(xì)胞內(nèi)本身無熒光的活性氧物質(zhì)具有熒光(便于后續(xù)熒光檢測)；與此同時微型熱敏電阻提供的熒光標(biāo)記溫度監(jiān)測值，經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換與溫度補償電路送入單片機(jī)，由PC機(jī)進(jìn)行實時顯示。當(dāng)熒光標(biāo)記溫度監(jiān)測值等于或大于預(yù)置熒光標(biāo)記溫度值時，微型熱敏電阻則停止加熱。細(xì)胞/流體電動操縱模塊III (參見附圖1、2)細(xì)胞/流體電動操縱模塊由六路直流高壓組成，包括單片機(jī)3、一個八通道12位的D/A轉(zhuǎn)換電路7、一個八通道的放大電路8、六個并列的DC-DC高壓模塊9、六個并列的“雙刀雙擲”高壓繼電器10、電壓/電流測量電路11、繼電器轉(zhuǎn)換電路12。八通道12位的D/A轉(zhuǎn)換電路將寄存于單片機(jī)中的六路直流高壓的預(yù)置電壓的數(shù)字量轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的模擬量，并送入八通道的放大電路；放大電路將相應(yīng)的模擬量放大處理為0-+2. 5Vdc的模擬量，該模擬量分別控制六只DC-DC高壓模塊輸出與其預(yù)置電壓對應(yīng)相等的輸出電壓；六只DC-DC高壓模塊的輸出電壓分別通過六個并列的“雙刀雙擲”高壓繼電器，構(gòu)成輸出模式為“懸空、電壓、 接地”的六路直流高壓；六路直流高壓再通過高壓導(dǎo)線、鉬絲電極與微流控芯片的貯液池對應(yīng)相接，實現(xiàn)對微流控芯片上細(xì)胞/流體的電動操縱。 電壓/電流測量電路將六個DC-DC高壓模塊提供的輸出電壓/電流監(jiān)測量進(jìn)行放大、A/D轉(zhuǎn)換后送入單片機(jī)，由單片機(jī)進(jìn)行內(nèi)存(RAM)緩存和邏輯運算，最后由PC機(jī)實時顯示六路直流高壓的輸出電壓、電流。 單片機(jī)通過繼電器控制電路，控制六個高壓繼電器的控制線圈，構(gòu)成六路直流高壓輸出模式一 “懸空、電壓、接地”的轉(zhuǎn)換。細(xì)胞/流體液壓操縱模塊IV(參見附圖1、2)細(xì)胞/流體液壓操縱模塊由二路微注射泵組成，包括單片機(jī)3、一個驅(qū)動電路13、 二個并列的步進(jìn)電機(jī)14、二個并列的微動推拉裝置15、二個并列的微型注射器16。驅(qū)動電路將寄存于單片機(jī)中的二路微注射泵的預(yù)置輸出參數(shù)轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的脈沖信號，并分別控制二個步進(jìn)電機(jī)；二個步進(jìn)電機(jī)通過二個微動推拉裝置帶動二個相應(yīng)的微型注射器完成與預(yù)置輸出參數(shù)相同的動作，從而組成輸出模式為“推進(jìn)/灌注、等待、回拉”的二路微注射泵。 二路微注射泵通過內(nèi)徑為50-500微米的疏水性聚合材料導(dǎo)管與微流控芯片的貯液池對應(yīng)連接，實現(xiàn)對微流控芯片上細(xì)胞/流體的液壓操縱。微流控芯片與芯片操作平臺V(參見附圖2、3)芯片操作平臺18可以X、Y、Z軸三維調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)精度小于5微米。微流控芯片水平17水平放置在芯片操作平臺18上，調(diào)整芯片操作平臺18可使微流控芯片17與聚焦物鏡201焦平面相對位置任意匹配。微流控芯片17樣品池的底部沉積有適合細(xì)胞熒光標(biāo)記的微型熱敏電阻5 ；微流控芯片分離通道的入口處沉積有適合單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”的二對微電極(A1-A2，B1-B2)。通用性是本發(fā)明的目的之一，因此本發(fā)明對微流控芯片的限制僅限上述要求，不同材質(zhì)(如，石英、玻璃、PDMS等)、不同結(jié)構(gòu)(如，貯液池彡8個)的微流控芯片均適合本發(fā)明?？紤]到本發(fā)明與微流控芯片連接的多樣性，在此不作詳述，也不推薦附圖。單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊VI (參見附圖2、3)單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊包括單片機(jī)3、恒流源電路19、二對微電極(A1-A2， B1-B》、電壓測量電路(1)21、電壓測量電路O) 22、甄別電路20。單片機(jī)控制恒流源輸出微安級電流，該電流與二對微電極A1-A2、B1-B2串聯(lián)連接后，電壓測量電路1和電壓測量電路2將測量到的微電極A1-A2和微電極B1-B2兩端的電壓分別送入甄別電路。甄別電路對微電極A1-A2和微電極B1-B2兩端的電壓值進(jìn)行比較。當(dāng)被捕獲單細(xì)胞到達(dá)分離通道入口微電極A1-A2之間時(即，單細(xì)胞捕獲)，微電極A1-A2兩端電阻會產(chǎn)生變化，此時微電極 A1-A2兩端電壓也發(fā)生變化，從而導(dǎo)致甄別電路產(chǎn)生脈沖信號(即，單細(xì)胞捕獲識別)，同時該脈沖信號觸發(fā)單片機(jī)控制細(xì)胞/流體操縱模塊由單細(xì)胞捕獲操作自動切換到單細(xì)胞溶膜操作，并啟動數(shù)據(jù)采集。熒光檢測模塊VII (參見附圖2、4)熒光檢測模塊由激發(fā)光學(xué)模塊、熒光收集光學(xué)模塊、激發(fā)光對中成像光學(xué)模塊組成，其主要作用是對電泳分離的活性氧組分進(jìn)行激發(fā)產(chǎn)生熒光、熒光收集、激發(fā)光與芯片通道的對中成像觀察。調(diào)整時，按照各個器件在附圖4光路設(shè)置的前后順序，激發(fā)光學(xué)模塊包括激光器101、準(zhǔn)直組件102、激發(fā)濾光片103、光敏二極管104的光軸與熒光收集光學(xué)模塊包括聚焦物鏡201、分色分光鏡202、帶通濾光片203、透鏡204、孔徑光闌205、發(fā)射濾光片組 206、光電倍增管207的光軸呈90度角，其中分色分光鏡203與激發(fā)光學(xué)模塊的光軸呈45 度角放置；激發(fā)光與芯片通道對中成像光學(xué)模塊包括(XD301、柱狀物鏡302、減光片303、反光鏡304的光軸與熒光收集光學(xué)模塊的光軸呈90度角，其中反光鏡304與熒光收集光學(xué)模塊的光軸呈45度角放置。(XD301用于采集激發(fā)光斑與芯片分離通道檢測點處的成像，并送入PC機(jī)進(jìn)行成像觀察。信號處理與數(shù)據(jù)采集模塊VIII (參見附圖2、4)信號處理與數(shù)據(jù)采集模塊包括單片機(jī)3、光電倍增管207、光敏二極管104、數(shù)據(jù)采集板23、對數(shù)放大電路M、前置放大器(1)25、前置放大器0)26。光電倍增管將收集到的熒光信號轉(zhuǎn)換為電流信號，并送入前置放大器(1)進(jìn)行ΙΛ變換。光敏二極管104將照射到的激光轉(zhuǎn)換為電流信號，并送入前置放大器( 進(jìn)行ΙΛ變換。對數(shù)放大電路將前置放大器(1、幻送來的模擬電壓信號進(jìn)行對數(shù)放大處理(目的是消除激光噪聲，提高熒光檢測信號的信噪比和響應(yīng)范圍)，并送入數(shù)據(jù)采集板轉(zhuǎn)換成數(shù)字量信號。最后，在單片機(jī)的控制下，由PC機(jī)對數(shù)據(jù)采集板的輸出信號進(jìn)行實時顯示/記錄，完成活性氧檢測電泳譜圖的獲得與譜圖數(shù)據(jù)處理。程序軟件VIIII程序軟件由單片機(jī)控制程序和PC機(jī)應(yīng)用程序組成。程序軟件為本發(fā)明提供了一個人機(jī)交換平臺，通過它可以完成預(yù)置實驗參數(shù)；控制單細(xì)胞活性氧分析過程中細(xì)胞熒光標(biāo)記溫度，各路直流高壓 /微注射泵不同輸出模式間的獨立或/和同步輸出的可編程輸出流程，包括單細(xì)胞捕獲的識別與觸發(fā)；實時顯示/記錄儀器的運行狀態(tài)，熒光標(biāo)記溫度，直流高壓的輸出電壓/電流、 數(shù)據(jù)采集板的輸出信號、電泳譜圖等。本發(fā)明的工作過程為1)首先根據(jù)微流控芯片的結(jié)構(gòu)和單細(xì)胞活性氧分析所需操作步驟，預(yù)置實驗參數(shù) (包括細(xì)胞熒光標(biāo)記、細(xì)胞上樣、單細(xì)胞被捕、單細(xì)胞溶膜、電泳分離及活性氧檢測等每步操作所對應(yīng)的細(xì)胞熒光標(biāo)記溫度/運行時間、直流高壓/微注射泵的輸出路數(shù)、每路直流高壓/微注射泵的輸出模式/運行時間等)；2)將細(xì)胞熒光標(biāo)記模塊、各路直流高壓和各路微注射泵、單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊與微流控芯片對應(yīng)連接；3)調(diào)節(jié)芯片操作平臺，觀察PC機(jī)上的C⑶成像，使激發(fā)光斑與芯片分離通道的檢測點對中；4)基于預(yù)置實驗參數(shù)，本發(fā)明自動提供細(xì)胞熒光標(biāo)記溫控、各路直流高壓/微注射泵不同模式間的獨立或/和同步的可編程輸出流程，包括單細(xì)胞捕獲的識別和觸發(fā)溶膜等后續(xù)操作的切換。從而可以在不同結(jié)構(gòu)微流控芯片上自動實現(xiàn)細(xì)胞熒光標(biāo)記、細(xì)胞上樣、 單細(xì)胞捕獲、單細(xì)胞溶膜、電泳分離、單細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測以及譜圖采集等操作，完成單細(xì)胞活性氧分析全過程。下面給出的實施例可以進(jìn)一步說明本發(fā)明的應(yīng)用效果(參見附圖5)本實施例是本發(fā)明結(jié)合可對H2O2特異性識別的熒光探針FS，測得10個肝癌細(xì)胞中 H2O2的電泳峰(圖5A)及其含量的柱狀圖(圖5B)。測試條件玻璃芯片，細(xì)胞/1流體為電動操縱，λ J λ em為473nm/520nm，電泳介質(zhì)為30mM HEPES緩沖溶液(pH7. 4)添加20mM甘露醇；測試結(jié)果 的遷移時間和峰面積的標(biāo)準(zhǔn)相對偏差(RSDs，n = 10)分別是1. 4%和 4. 8%，單個肝癌細(xì)胞中H2O2的平均含量為13. 6amol (η = 10)。以上所述，僅為本發(fā)明其中的較佳實施案例而已，并非用來限定本發(fā)明的實施范圍即凡根據(jù)本發(fā)明申請專利范圍所作的均等變化與修飾，皆為本發(fā)明權(quán)利要求的范圍所涵蓋。
權(quán)利要求
1.一種微流控單細(xì)胞活性氧自動分析儀，其特征在于所述的分析儀由系統(tǒng)控制模塊 (I)、細(xì)胞熒光標(biāo)記模塊(II)、細(xì)胞/流體電動操縱模塊(III)、細(xì)胞/流體液壓操縱模塊 (IV)、微流控芯片與芯片操作平臺(V)、單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊(VI)、熒光檢測模塊 (VII)、信號處理與數(shù)據(jù)采集模塊(VIII)、程序軟件(IX)組成；所述的系統(tǒng)控制模塊(I)的核心是一單片機(jī)(3)；所述的細(xì)胞熒光標(biāo)記模塊(II)包括細(xì)胞熒光標(biāo)記所需微區(qū)溫度的控制與監(jiān)測；所述的細(xì)胞/流體電動操縱模塊(III)由六路直流高壓組成；所述的細(xì)胞/流體液壓操縱模塊(IV)由二路微注射泵組成；所述的熒光檢測模塊(VII)由激發(fā)光學(xué)模塊、熒光收集光學(xué)模塊、激發(fā)光與芯片通道對中成像光學(xué)模塊組成；所述的程序軟件(IX)由單片機(jī)控制程序和PC機(jī)應(yīng)用程序組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微流控單細(xì)胞活性氧自動分析儀，其特征在于 所述的單片機(jī)(3)通過RS-485通訊接口(2)與PC機(jī)(1)的串行口相連，組成通訊、運算、控制、顯示/記錄功能；所述的細(xì)胞熒光標(biāo)記所需微區(qū)溫度的控制與監(jiān)測單片機(jī)( 順序連接溫控電路G)、微型熱敏電阻(5)，組成細(xì)胞熒光標(biāo)記的微區(qū)溫度控制；微型熱敏電阻( 順序連接A/D轉(zhuǎn)換與溫度補償電路(6)、單片機(jī)(3)，組成細(xì)胞熒光標(biāo)記的微區(qū)溫度監(jiān)測； 所述的六路直流高壓單片機(jī)C3)順序連接一個八通道12位D/A轉(zhuǎn)換電路(7)、一個八通道放大電路(8)、六個并列的DC-DC高壓模塊(9)、六個并列的“雙刀雙擲”高壓繼電器(10)，組成輸出模式為 “懸空、高壓、接地”的所述六路直流高壓；六個并列的DC-DC高壓模塊(9)與單片機(jī)(3)之間連接有電壓/電流測量電路(11)， 組成所述的六路直流高壓的輸出電壓/電流監(jiān)測；單片機(jī)(3)與六個并列的“雙刀雙擲”高壓繼電器(10)之間連接有繼電器控制電路 (12)，組成所述的六路直流高壓輸出模式一 “懸空、高壓、接地”的轉(zhuǎn)換； 所述的二路微注射泵單片機(jī)(3)順序連接驅(qū)動電路(13)、二個并列的步進(jìn)電機(jī)(14)、二個并列的微動推拉裝置(15)、二個并列的微型注射器(16)，組成工作模式為“推進(jìn)/灌注、等待、回拉”的所述二路微注射泵；所述的微流控芯片與芯片操作平臺(V)微流控芯片(17)的樣品池底部沉積有適合細(xì)胞熒光標(biāo)記的微型熱敏電阻(5)，微流控芯片分離通道的入口處沉積有適合單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”的二對微電極(A1-A2， B1-B2)；微流控芯片(17)水平固定于芯片操作平臺(18)上，芯片操作平臺(18)可以X、Y、Z軸三維調(diào)節(jié)，且能實現(xiàn)微流控芯片(17)與聚焦物鏡(201)焦平面相對位置的任意匹配關(guān)系； 所述的單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊(VI)單片機(jī)⑶與恒流源(19)的輸入端相連，恒流源(19)的輸出端與微流控芯片(17)分離通道入口處的二對微電極(Α1-Α2、Β1-Β》串聯(lián)連接；電壓測量電路1(21)、電壓測量電路2 (22)的輸入端分別與所述的二對微電極(Α1-Α2、B1-B2)并聯(lián)連接，測量電路1 、2 02)的輸出端通過甄別電路OO)與單片機(jī)(3)相連， 組成被捕獲單細(xì)胞到達(dá)分離通道入口時的識別，并同時觸發(fā)單細(xì)胞分析中“單細(xì)胞捕獲、溶膜”操作的自動切換和數(shù)據(jù)采集；所述的激發(fā)光學(xué)模塊、熒光收集光學(xué)模塊、激發(fā)光與芯片通道對中成像光學(xué)模塊 激發(fā)光學(xué)模塊包括依次設(shè)置的激光器(101)、準(zhǔn)直組件(102)、激發(fā)濾光片(103)、光敏二極管(104)的光軸與熒光收集光學(xué)模塊包括依次設(shè)置的聚焦物鏡001)、分色分光鏡 (202)、帶通濾光片(203)、透鏡(204)、孔徑光闌(205)、發(fā)射濾光片組(206)、光電倍增管 (207)的光軸呈90度角，其中分色分光鏡(20 與激發(fā)光學(xué)模塊的光軸呈45度角放置；激發(fā)光與芯片通道對中成像光學(xué)模塊包括依次設(shè)置的(XD(301)、柱狀物鏡(302)、減光片(303)、反光鏡(304)的光軸與熒光收集光學(xué)模塊的光軸呈90度角，其中反光鏡(304) 與熒光收集光學(xué)模塊的光軸呈45度角放置； 所述的信號處理與數(shù)據(jù)采集模塊(VIII)光電倍增管007)、光敏二極管(104)分別連接前置放大器1(25)、前置放大器2 06) 的輸入端，前置放大器1(25)、前置放大器2 06)的輸出端順序連接對數(shù)放大電路(M)、數(shù)據(jù)采集板(23)、PC機(jī)(1)；單片機(jī)( 通過單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊提供的觸發(fā)信號，控制數(shù)據(jù)采集板03) 的開啟；所述的程序軟件(IX)，由單片機(jī)控制程序和PC機(jī)應(yīng)用程序組成，包括 預(yù)置微流控單細(xì)胞活性氧分析中的操作步驟，每步操作所對應(yīng)細(xì)胞熒光標(biāo)記的溫度、 各路直流高壓/微注射泵的輸出模式、運行時間等實驗參數(shù)；控制微流控單細(xì)胞分析中細(xì)胞熒光標(biāo)記、細(xì)胞上樣、單細(xì)胞捕獲、溶膜、電泳分離和單細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測等操作所對應(yīng)細(xì)胞熒光標(biāo)記溫度、各路直流高壓、各路微注射泵不同輸出模式間的獨立或/和同步輸出的可編程輸出流程，包括單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”的自動切換；實時顯示/記錄熒光標(biāo)記溫度、各路直流高壓/微注射泵的運行狀態(tài)、直流高壓的輸出電壓/電流、數(shù)據(jù)采集板的輸出信號。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種微流控單細(xì)胞活性氧自動分析儀，其特征在于所述的微型熱敏電阻(5)是具有加熱和感溫雙重作用的微型熱敏電阻。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種微流控單細(xì)胞活性氧自動分析儀，其特征在于所述的細(xì)胞熒光標(biāo)記的微區(qū)溫度范圍為室溫至60度。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種微流控單細(xì)胞活性氧自動分析儀，其特征在于所述的六路直流高壓的電壓范圍為“0 5000Vdc”。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種微流控單細(xì)胞活性氧自動分析儀，其特征在于所述的二路微注射泵的灌注流量范圍為“0. 005 μ 1/min 500 μ 1/min”。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種微流控單細(xì)胞活性氧自動分析儀，其特征在于所述的激光器(101)為473nm、532nm、635nm、730nm半導(dǎo)體泵浦固體激光器的任意一種，且激光器 (101)與激發(fā)濾光片(103)、分色分光鏡002)、帶通濾光片(20 為對應(yīng)匹配關(guān)系。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種微流控單細(xì)胞活性氧自動分析儀，其特征在于所述的孔徑光闌O05)的大小在200 1000 μ m范圍內(nèi)可調(diào)。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種微流控單細(xì)胞活性氧自動分析儀，其特征在于所述的發(fā)射濾光片組O06)由500 850nm范圍內(nèi)的六個不同波段的發(fā)射濾光片組成，且六個發(fā)射濾光片可以旋轉(zhuǎn)式切換。
全文摘要
本發(fā)明提供一種微流控單細(xì)胞活性氧自動分析儀。該分析儀由系統(tǒng)控制模塊、細(xì)胞熒光標(biāo)記模塊、細(xì)胞/流體電動操縱模塊、細(xì)胞/流體液壓操縱模塊、微流控芯片與芯片操作平臺、單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”模塊、熒光檢測模塊、信號處理與數(shù)據(jù)采集模塊和程序軟件組成。本發(fā)明將單細(xì)胞組分分析方法、細(xì)胞熒光標(biāo)記、細(xì)胞/流體操縱、熒光檢測、微電子控制技術(shù)集成，提出了一種單細(xì)胞捕獲“識別與觸發(fā)”的概念，利用單細(xì)胞到達(dá)分離通道入口時的電阻變化識別單細(xì)胞的捕獲，并同時觸發(fā)“單細(xì)胞捕獲、溶膜”操作的自動切換和數(shù)據(jù)采集。本發(fā)明可以實現(xiàn)微流控芯片上細(xì)胞熒光標(biāo)記、細(xì)胞上樣、單細(xì)胞捕獲、溶膜、電泳分離和單細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測等操作。
文檔編號G01N21/65GK102183504SQ20111002616
公開日2011年9月14日 申請日期2011年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月25日
發(fā)明者唐波, 張欣媛, 李清嶺, 陳蓁蓁 申請人:山東師范大學(xué)