Spg11基因突變體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分離的編碼SPG11突變體的核酸、分離的多肽、篩選易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱的生物樣品的方法、篩選易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱的生物樣品的系統(tǒng)以及用于篩選易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱的生物樣品的試劑盒。其中，分離的編碼SPG11突變體的核酸，與SEQ?ID?NO：1相比，具有選自c.C6856T和c.2863delG的至少一種突變。通過檢測該突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱。
【專利說明】SPG11基因突變體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及SPGll基因突變體及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及分離的編碼SPGll突變體的核酸、分離的多肽、篩選易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱的生物樣品的方法、篩選易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱的生物樣品的系統(tǒng)以及用于篩選易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱的生物樣品的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]遺傳性疫攣性截癱(hereditaryspastic paraplegia, HSP)于 1876 年由Seeligmuller首先報道，是一種以雙下肢進行性肌張力增高和無力、剪刀步態(tài)為特征的具有明顯遺傳異質(zhì)性的綜合征。病理改變主要為脊髓中的雙側(cè)皮質(zhì)脊髓束的軸索變性和脫髓鞘，以胸髓為重。起病初期常表現(xiàn)為雙下肢僵硬、無力，行走易跌倒，逐漸發(fā)展成雙下肢痙攣性截癱，不能行走。不同遺傳分型的HSP患者的臨床表現(xiàn)、病情輕重及病程長短各不相同，且同一家系內(nèi)不同患者的病情也不盡相同。根據(jù)不同的臨床表現(xiàn)，HSP可分為單純型和復(fù)雜型，單純型表現(xiàn)為逐漸進展的雙下肢痙攣、步態(tài)不穩(wěn)、腱反射亢進，可合并膀胱括約肌功能障礙和深感覺減退；復(fù)雜型患者除上述表現(xiàn)外，還伴有其他表現(xiàn)，如智力障礙、癲癇、魚鱗病、周圍神經(jīng)病、白內(nèi)障及共濟失調(diào)等。發(fā)病率為2/10萬~10/10萬。
[0003]HSP為單基因遺傳病，根據(jù)遺傳方式的不同，HSP可分為常染色體顯性遺傳(autosomal dominant, AD)、常染色體隱性遺傳(autosomal recessive, AR)以及 X 連鎖隱性遺傳(X-linked recessive，XR)。不同基因類型具有各自的臨床特點，確定HSP患者的基因分型有助于明確其臨床亞型，以及為家系內(nèi)尚未發(fā)病的患者提供基因診斷依據(jù)，同時可為下一代提供產(chǎn)前診斷依據(jù)，以期生育健康的后代。
[0004]近年來，與HSP致病相關(guān)的基因位點不斷被發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)報道與HSP發(fā)病相關(guān)的基因有46個，20個致病基因已被克隆，其中以AD為最常見。而SPGll基因突變是AR-HSP中最常見的類型，約占AR-HSP患者的18.9%。以復(fù)雜型多見。
[0005]然而，現(xiàn)階段對常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱(AR-HSP)的研究仍有待深入。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱(簡稱“AR-HSP”)的致病基因上的新突變。
[0007]本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列工作而完成的:發(fā)明人通過高通量外顯子組測序聯(lián)合候選基因突變驗證的方法確定了常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱的致病基因上的新突變(SPG11, c.C6856T 和 c.2863delG)。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的編碼SPGll突變體的核酸(即SPGll基因突變體)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該核酸與SEQ ID NO:1相比，具有選自c.C6856T和c.2863delG的至少一種突變。根據(jù)本發(fā)明的實施例，發(fā)明人確定了 SPGll基因突變體，該突變體與AR-HSP的發(fā)病密切相關(guān)，從而通過檢測該突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種分離的多肽。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該多肽與SEQ ID NO:2相比，具有選自p.Arg2286X和p.Glu955Lysfs*7的至少一種突變。通過檢測生物樣品中是否表達該多肽，可以有效地檢測生物樣品是否易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種篩選易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱的生物樣品的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括以下步驟:從生物樣品提取核酸樣本；確定所述核酸樣本的核酸序列；所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID N0:1相t匕，具有選自c.C6856T和c.2863delG的至少一種突變是所述生物樣品易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱的指示。通過根據(jù)本發(fā)明實施例的篩選易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱(即AR-HSP)的生物樣品的方法，可以有效地篩選易患AR-HSP的生物樣品O[0011]根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種篩選易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱的生物樣品的系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該系統(tǒng)包括:核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品提取核酸樣本；核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對所述核酸樣本進行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列；判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO:1相比，是否具有選自c.C6856T和c.2863delG的至少一種突變，判斷所述生物樣品是否易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱。利用該系統(tǒng)，能夠有效地實施前述篩選易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱的生物樣品的方法，從而可以有效地篩選易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱的生物樣品。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種用于篩選易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱的生物樣品的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該試劑盒含有:適于檢測SPGll基因突變體的試劑，其中與SEQ ID NO:1相比，所述SPGll基因突變體具有選自c.C6856T和c.2863delG的至少一種突變。利用根據(jù)本發(fā)明的實施例的試劑盒，能夠有效地篩選易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱的生物樣品。
[0013]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0015]圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明實施例的篩選易患AR-HSP的生物樣品的系統(tǒng)及其組成部分的示意圖，其中，A為根據(jù)本發(fā)明實施例的篩選易患AR-HSP的生物樣品的系統(tǒng)的示意圖，B為根據(jù)本發(fā)明實施例的核酸提取裝置的示意圖，C為根據(jù)本發(fā)明實施例的核酸序列確定裝置的示意圖；
[0016]圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明實施例的一個AR-HSP家系的家系圖；[0017]圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明實施例的患者112的SPGll基因突變位點的Sanger測序驗證峰圖，其中，A為c.C6856T突變位點Sanger測序驗證峰圖，B為c.2863delG突變位點Sanger測序驗證峰圖；
[0018]圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明實施例的家系內(nèi)正常人13的SPGll基因突變位點的Sanger測序驗證峰圖,其中,A為c.C6856T突變位點Sanger測序驗證峰圖,B為c.2863delG突變位點Sanger測序驗證峰圖；
[0019]圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明實施例的家系內(nèi)正常人12的SPGll基因突變位點的Sanger測序驗證峰圖,其中,A為c.C6856T突變位點Sanger測序驗證峰圖,B為c.2863delG突變位點Sanger測序驗證峰圖；以及
[0020]圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明實施例的家系內(nèi)正常人14的SPGll基因突變位點的Sanger測序驗證峰圖,其中,A為c.C6856T突變位點Sanger測序驗證峰圖,B為c.2863delG突變位點Sanger測序驗證峰圖。
【具體實施方式】
[0021]下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0022]SPGll基因突變體
[0023]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的編碼SPGll突變體的核酸。根據(jù)本發(fā)明的實施例，與SEQ ID NO:1相比，該核酸具有選自C.C6856T和c.2863delG的至少一種突變。在本文中所使用的表達方式“編碼SPGll突變體的核酸”，是指與編碼SPGll突變體的基因相對應(yīng)的核酸物質(zhì)，即核酸的類型不受特別限制，可以是任何包含與SPGll突變體的編碼基因(即SPGll 基因突變體)相對應(yīng)的脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根據(jù)本發(fā)明的一個具體示例，前面所述的編碼SPGll突變體的核酸為DNA。根據(jù)本發(fā)明的實施例，發(fā)明人確定了 SPGll基因的突變體，該突變體與常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱的發(fā)病密切相關(guān)，從而通過檢測該突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱，也可以通過檢測該突變體在生物體中是否存在，可以有效地預(yù)測生物體是否易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱。
[0024]這些編碼SPGll突變體的核酸，是本申請的發(fā)明人通過高通量外顯子組測序聯(lián)合候選基因突變驗證的方法確定的常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱的致病基因上的新突變。并且，在現(xiàn)有技術(shù)中并未見SPGll基因上的c.C6856T和c.2863delG突變與AR-HSP相關(guān)的報道。
[0025]野生型SPGll基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列(7332nt):
[0026]ATGGCTGCAGAGGAAGGGGTCGCGAGTGCTGCTTCCGCCGGCGGTAGCTGGGGCACCGCGGCCATGGGGCGGGTTCTACCGATGCTGTTGGTGCCAGTCCCCGCCGAGGCGATGGGGCAGCTCGGCTCCCGGGCGCAGCTGCGCACACAGCCGGAGGCTCTGGGGAGCCTGACGGCTGCGGGCAGCCTCCAAGTGCTTTCTTTGACGCCTGGCAGCCGGGGCGGGGGTCGCTGCTGCCTGGAGGGCCCCTTCTGGCACTTTCTATGGGAGGATTCTCGTAACAGCAGCACACCAACTGAAAAGCCCAAACTGCTCGCTCTTGGTGAAAATTATGAACTGCTTATCTATGAATTTAATTTGAAAGATGGAAGATGTGA
【權(quán)利要求】
1.一種分離的編碼SPGll突變體的核酸，其特征在于，與SEQ ID NO:1相比，所述核酸具有選自c.C6856T和c.2863delG的至少一種突變， 任選地，所述核酸為DNA。
2.一種分離的多肽，其特征在于，與SEQ ID N0:2相比，所述分離的多肽具有選自p.Arg2286X 和 p.Glu955Lysfs*7 的至少一種突變， 任選地，所述多肽是由權(quán)利要求1所述的核酸編碼的。
3.一種篩選易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱的生物樣品的方法，其特征在于，包括以下步驟: 從所述生物樣品提取核酸樣本； 確定所述核酸樣本的核酸序列； 所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO:1相比，具有選自c.C6856T和c.2863delG的至少一種突變是所述生物樣品易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱的指示， 任選地，所述生物樣品為選自人體血液、皮膚、毛發(fā)和肌肉的至少一種， 任選地，所述核酸樣本為全基因組DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，從所述生物樣品提取核酸樣本進一步包括: 從所述生物樣品提取RNA樣本，優(yōu)選所述RNA樣本為mRNA ；以及 基于所述RNA樣本，通過反轉(zhuǎn)錄反`應(yīng)，獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣本。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，確定所述核酸樣本的核酸序列進一步包括: 針對所述核酸樣本，構(gòu)建核酸測序文庫；以及 對所述核酸測序文庫進行測序，以便獲得由多個測序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測序結(jié)果，任選地，采用選自Hiseq2000、S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一種對所述核酸測序文庫進行測序， 任選地,針對所述核酸樣本,構(gòu)建核酸測序文庫進一步包括: 利用SPGll基因外顯子特異性引物，對所述核酸樣本進行PCR擴增；以及 針對所得到的擴增產(chǎn)物，構(gòu)建所述核酸測序文庫， 任選地，所述SPGll基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO:7_10所示的核苷酸序列。
6.一種篩選易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱的生物樣品的系統(tǒng)，其特征在于，包括: 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品提取核酸樣本； 核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對所述核酸樣本進行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列； 判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID N0:1相比，是否具有選自c.C6856T和c.2863delG的至少一種突變，判斷所述生物樣品是否易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述核酸提取裝置進一步包括:RNA提取單元，所述RNA提取單元用于從所述生物樣品提取RNA樣本；以及反轉(zhuǎn)錄單元，所述反轉(zhuǎn)錄單元與所述RNA提取單元相連,用于對所述RNA樣本進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以便獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣本。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述核酸序列確定裝置進一步包括: 文庫構(gòu)建單元，所述文庫構(gòu)建單元用于針對所述核酸樣本，構(gòu)建核酸測序文庫；以及 測序單元，所述測序單元與所述文庫構(gòu)建單元相連，用于對所述核酸測序文庫進行測序，以便獲得由多個測序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測序結(jié)果， 任選地,所述文庫構(gòu)建單元進一步包括: PCR擴增模塊，所述PCR擴增模塊中設(shè)置有SPGll基因外顯子特異性引物，以便利用SPGll基因外顯子特異性引物，對所述核酸樣本進行PCR擴增， 任選地，所述SPGll基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO:7_10所示的核苷酸序列， 任選地，所述測序單元包括選自Hiseq2000、SOLiD,454和單分子測序裝置的至少一種。
9.一種用于篩選易患常染色體隱性遺傳型遺傳性痙攣性截癱的生物樣品的試劑盒，其特征在于，含有: 適于檢測SPGll基因突變體的試劑，其中與SEQ ID NO:1相比，所述SPGll基因突變體具有選自c.C6856T和c.2863delG的至少一種突變。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑為核酸探針， 任選地，所述試劑盒包含具有如SEQ ID NO:7-10所示核苷酸序列的SPGll基因外顯子特異性引物。
【文檔編號】C07K14/47GK103627710SQ201210301974
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月22日
【發(fā)明者】張家堂, 劉慧 , 趙威, 于生元, 管李萍, 王俊, 汪建, 楊煥明 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院, 深圳華大基因科技有限公司