專利名稱：Cd4細(xì)胞芯片及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞芯片，尤其涉及一種CD4細(xì)胞芯片及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
CD4細(xì)胞是指帶有CD4抗原的T淋巴細(xì)胞，又被稱為輔助T細(xì)胞，在維持機(jī)體的細(xì) 胞免疫和體液免疫中具有樞紐作用。CD4細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的主要戰(zhàn)斗細(xì)胞，也是人類免疫 缺陷病毒(HIV)感染的主要靶細(xì)胞。人體感染HIV后的主要病理過程是免疫系統(tǒng)的損害， 主要表現(xiàn)為CD4細(xì)胞的丟失和絕對數(shù)量的減少。目前，CD4細(xì)胞計數(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于指導(dǎo) 臨床抗HIV治療，并已成為世界衛(wèi)生組織對艾滋病發(fā)病定義的金標(biāo)準(zhǔn)。世界衛(wèi)生組織定義 當(dāng)人體外周血中CD4細(xì)胞數(shù)量< 200個/微升則判定為艾滋病患者。準(zhǔn)確可靠的CD4細(xì)胞 計數(shù)已成為評價HIV感染者免疫狀況、預(yù)測病程進(jìn)展、評價抗病毒藥物治療效果和估測預(yù) 后的重要指標(biāo)。此外，有研究表明，CD4細(xì)胞在惡性腫瘤、乙型肝炎、慢性阻塞性肺疾病、肺 結(jié)核、腦梗死等其他疾病的病程監(jiān)測、療效評估、預(yù)后評價等方面也發(fā)揮重要作用。CD4細(xì) 胞的數(shù)量已是衡量個體免疫狀態(tài)及功能的重要指標(biāo)。當(dāng)人體外周血中CD4細(xì)胞數(shù)量< 350 個/微升，為免疫力低下，需詳細(xì)診斷是否為艾滋病患者；當(dāng)人體外周血中CD4細(xì)胞數(shù)量在 350 450個/微升，為免疫力弱化，是亞健康狀態(tài)；當(dāng)人體外周血中CD4細(xì)胞數(shù)量在450 1440個/微升，為正常范圍。目前CD4細(xì)胞計數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法是傳統(tǒng)流式細(xì)胞法。該方法的基本原理是將樣 品中CD4細(xì)胞與熒光標(biāo)記抗體反應(yīng)后，進(jìn)入流式細(xì)胞儀，然后使樣品中所有細(xì)胞依次排列 成單行，測定每個細(xì)胞的熒光量從而得到CD4細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中的百分率。流式細(xì)胞法在 得到CD4細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中的百分率以及淋巴細(xì)胞絕對值后，兩者相乘即獲得CD4細(xì)胞數(shù)。 現(xiàn)在國內(nèi)外臨床使用的流式細(xì)胞儀被美國BD公司和貝克曼庫爾特公司所壟斷，其售價根 據(jù)型號及等級不同大致在60至100萬元人民幣，而每次測試所需費用在150至400元人民 幣。因此雖然流式細(xì)胞法具有結(jié)果精確，操作過程自動化，樣本處理量大等諸多優(yōu)點，但價 格昂貴，加上其檢測所用的進(jìn)口試劑，使每次測試成本很高，而且流式細(xì)胞儀培訓(xùn)要求高、 維護(hù)也十分繁瑣?，F(xiàn)國內(nèi)在一些大、中城市的省級醫(yī)療衛(wèi)生單位，流式細(xì)胞儀的使用已獲得普及，而 在地區(qū)級醫(yī)療衛(wèi)生單位，尤其是艾滋病流行嚴(yán)重的貧困邊遠(yuǎn)地區(qū)，還鮮見流式細(xì)胞儀的使 用。國外流式細(xì)胞儀的使用現(xiàn)狀也與國內(nèi)相似，在發(fā)達(dá)國家的大、中型醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)流式細(xì) 胞儀的使用已獲得普及，而在艾滋病流行最嚴(yán)重的一些發(fā)展中國家，尤其是一些非洲國家， 幾乎還很少有流式細(xì)胞儀。流式細(xì)胞儀的昂貴限制了其臨床上的普及。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種成本低廉、操作簡便的CD4細(xì)胞芯片。此外， 還需要提供一種CD4細(xì)胞芯片的制備方法和應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種CD4細(xì)胞芯片，包括固相載體和固定于該載體 上的抗體，所述抗體為CD4單克隆抗體，所述固相載體為玻片。優(yōu)選的，在所述玻片表面設(shè)有反應(yīng)區(qū)，所述CD4單克隆抗體固定在該反應(yīng)區(qū)；更優(yōu) 選的，所述反應(yīng)區(qū)為單凹，或是在玻片表面圈出的具有一定形狀的封閉區(qū)域。進(jìn)一步優(yōu)選 的，單凹的孔徑為9 12mm，孔深為0. 2 0. 3mm，采用表面設(shè)有單凹或封閉區(qū)域的玻片，使 被測樣品局限于反應(yīng)區(qū)范圍內(nèi)進(jìn)行抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，有效降低了血液用量，使手 指術(shù)梢血采樣成為可能，同時在滿足細(xì)胞檢測要求的情況下，大大降低了抗體使用成本。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種⑶4細(xì)胞芯片的制備方法，包括以下步驟用酸清洗玻片，使玻片表面帶陰離子電荷；將清洗過的玻片放入多聚賴氨酸溶液中浸泡適當(dāng)時間，通過多聚賴氨酸攜帶的陽 離子電荷與所述玻片表面陰離子電荷之間的吸引，使多聚賴氨酸吸附于玻片表面；將CD4單克隆抗體滴加在玻片表面，室溫孵育合適時間，再用磷酸鹽緩沖液清洗 后烘干，于2 26°C保存待用。優(yōu)選的，用酸清洗玻片的步驟包括先用鉻酸清洗玻片，再用5% 10%硝酸水溶 液清洗玻片，然后用水將玻片沖洗干凈。由于玻片的主要成分是二氧化硅，用鉻酸、硝酸水 溶液先后處理后玻片表面呈陰離子，有利于吸附攜帶的陽離子的多聚賴氨酸。優(yōu)選的，所述玻片表面設(shè)有反應(yīng)區(qū)，將CD4單克隆抗體滴加在玻片表面的反應(yīng)區(qū) 內(nèi)，經(jīng)過酸清洗后玻片表面帶陰離子電荷，與多聚賴氨酸所帶正電荷異性相吸，多聚賴氨酸 與抗體蛋白以肽鍵結(jié)合。玻片表面設(shè)有反應(yīng)區(qū)，不僅降低抗體使用成本，而且有效降低被測 血液用量。在本發(fā)明的另一方面，提供了 一種⑶4細(xì)胞檢測試劑盒，至少包括上述⑶4細(xì)胞芯 片。優(yōu)選的，該CD4細(xì)胞檢測試劑盒還包括稀釋液、過氧化氫溶液、染色液和復(fù)染液。所述稀釋液為磷酸鹽緩沖液，pH值為7. 0 7. 4 ；所述過氧化氫溶液的體積百分 比濃度為2. 5 3. 5% ；所述染色液由堿性品紅、亞硝基鐵氰化鈉、聯(lián)苯胺按1 5%、3 5%、1 5%的質(zhì)量體積百分比濃度溶解于95%乙醇配制而成；所述復(fù)染液由堿性品紅按 2 5%的質(zhì)量體積百分比濃度溶解于95%乙醇配制而成。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種應(yīng)用⑶4細(xì)胞芯片進(jìn)行檢查的方法，包括以 下步驟將待測血樣滴加在CD4細(xì)胞芯片表面的抗體處，使其進(jìn)行抗原抗體特異性結(jié)合反 應(yīng)；用稀釋液洗去非特異性結(jié)合細(xì)胞和多余血樣；將玻片放入染色液中染色，并把染色后的玻片在過氧化氫溶液中浸置后，再轉(zhuǎn)入 復(fù)染液中染色，以區(qū)分CD4細(xì)胞和單核細(xì)胞；在光學(xué)顯微鏡下對CD4細(xì)胞計數(shù)，或采用自動計數(shù)儀完成CD4細(xì)胞計數(shù)。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述⑶4細(xì)胞芯片在制備診斷、監(jiān)測或輔助 治療包括艾滋病、腫瘤性疾病、自體免疫性疾病、器官移植、乙型肝炎、腦梗死、慢性阻塞性 肺疾病的免疫力低下疾病產(chǎn)品中的應(yīng)用。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述CD4細(xì)胞檢測試劑盒用于診斷、監(jiān)測或
4輔助治療包括艾滋病、腫瘤性疾病、自體免疫性疾病、器官移植、乙型肝炎、腦梗死、慢性阻 塞性肺疾病的免疫力低下疾病的用途。CD4細(xì)胞檢測可獨立或與病毒載量協(xié)同作為艾滋病診斷、病程監(jiān)測及輔助治療的 重要指標(biāo)。監(jiān)測和調(diào)控艾滋病感染者及患者的⑶4細(xì)胞數(shù)量，使其維持在一定范圍，讓患者 保持正常穩(wěn)定的免疫功能，與病毒共存，維持正常的學(xué)習(xí)、工作和生活。CD4細(xì)胞檢測作為人體細(xì)胞免疫功能評估的重要指標(biāo)之一，廣泛應(yīng)用于免疫力低 下疾病、慢性疾病等臨床疾病的病理分析、輔助診斷、指導(dǎo)治療、預(yù)后判斷等方面。主要應(yīng)用 于病毒感染性疾??；腫瘤性疾?。蛔泽w免疫性疾??；器官移植患者；乙型肝炎；腦梗死；慢 性阻塞性肺疾??；其他免疫缺損或異常的患者。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述CD4細(xì)胞檢測試劑盒用于健康體檢的用 途。CD4細(xì)胞檢測提供了人體免疫力的量化指標(biāo)。檢測免疫力的主要指標(biāo)是血清免疫 球蛋白(Ig)定量分析和T淋巴細(xì)胞亞群分析。主要應(yīng)用于亞健康檢測；健康人群免疫功 能評估；功能性免疫制劑(中藥、保健品、免疫球蛋白等)功效的評價；疾病預(yù)防、篩查的輔 助診斷。由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明⑶4細(xì)胞芯片具有如下優(yōu)點(1)成本低廉，檢測費用遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于流式細(xì)胞法，特別適用于無流式細(xì)胞儀檢測條件 而又急需開展CD4細(xì)胞檢測項目的艾滋病流行嚴(yán)重地區(qū)。(2)操作簡便，無需特殊專業(yè)培訓(xùn)，檢測人員通過簡單培訓(xùn)即可掌握全套流程，實 現(xiàn)醫(yī)務(wù)專業(yè)人員缺乏地區(qū)的可操作性。(3)產(chǎn)品室溫貯存，無需冷藏，器具簡便易攜，操作環(huán)境無特殊要求，為資源匱乏地 區(qū)進(jìn)行正常檢測提供有力保障。(4)用血量少，靜脈血或手指末梢血均可，手指血的使用極大降低了采血難度，減 少了受檢者的受壓程度，為幼兒、常住院病人等采血困難者提供了便利。(5)玻片樣本可長期保存，隨時隨地復(fù)查，因為通過檢測已將⑶4細(xì)胞永久固定于 玻片，可隨時隨地進(jìn)行計數(shù)或復(fù)查；可為受檢者建立免疫力數(shù)據(jù)庫，制作個性化健康管理檔 案，實現(xiàn)病程監(jiān)測。(6)檢測樣本處理時間短，無需溶血。


下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1是本發(fā)明制備CD4細(xì)胞芯片所依據(jù)的多聚離子電荷結(jié)合法原理示意圖；圖2是本發(fā)明實施例3應(yīng)用CD4細(xì)胞芯片進(jìn)行檢測的步驟示意圖；圖3是本發(fā)明CD4細(xì)胞檢測盒與流式細(xì)胞法檢測結(jié)果的相關(guān)性示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明突破常規(guī)細(xì)胞檢測法的傳統(tǒng)原理，將細(xì)胞投入到固相包被抗體上加以固定 并進(jìn)行分析。當(dāng)血樣中表達(dá)有CD4抗原的細(xì)胞與預(yù)先包被有CD4單克隆抗體的玻片接觸后 反應(yīng)，CD4細(xì)胞便會被固定在玻片上。經(jīng)淋洗、染色后，即可用顯微鏡或自動計數(shù)儀對CD4細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。常用的抗體固相包被技術(shù)中，利用范德華力的物理吸附法不適用于玻璃載體；而 利用共價鍵結(jié)合的多聚賴氨酸反應(yīng)法及氨基硅烷偶聯(lián)法雖能包被抗體，但非特異性細(xì)胞固 定過多，不適用于特異性細(xì)胞檢測。本發(fā)明開發(fā)出以多聚離子電荷結(jié)合法(見圖1)為原理 的抗體包被新技術(shù)，即玻片載體通過處理后表面帶陰離子電荷，帶陽離子電荷的多聚賴氨 酸通過陰陽離子相互作用吸附于玻片載體上，多聚賴氨酸與抗體蛋白以肽鍵結(jié)合，從而有 效地將抗體包被于玻片上，基于多聚離子電荷結(jié)合法原理制成的本發(fā)明⑶4細(xì)胞芯片，包 括固相載體玻片和固定于該玻片上的CD4單克隆抗體，既能使抗體均勻包被，又適用于特 異性細(xì)胞檢測。優(yōu)選的，本發(fā)明在玻片表面設(shè)有反應(yīng)區(qū)，CD4單克隆抗體固定在該反應(yīng)區(qū)；更優(yōu)選 的，反應(yīng)區(qū)為單凹，或是在玻片表面圈出的具有一定形狀的封閉區(qū)域。在本發(fā)明實施例中， 采用一種特殊加工的表面帶有微小單凹的載玻片作為固相載體，CD4單克隆抗體固定于該 單凹中。單凹的孔徑為9 12mm，孔深為0. 2 0. 3mm，單凹的孔形圓整、無塌眼、無擦痕、 無砂眼、無氣泡、無睫毛狀孔邊，孔內(nèi)外不得有霉斑、麻斑。玻片上的單凹結(jié)構(gòu)使被測樣品局 限于一定范圍內(nèi)進(jìn)行抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，血液用量僅0. 25微升左右，為流式細(xì)胞法 所用量的1/400，既大大降低了抗體使用成本，又滿足了細(xì)胞檢測的要求，同時使手指術(shù)梢 血采樣成為可能。實施例1⑶4細(xì)胞芯片的制備1.玻片清洗在室溫下，將玻片于鉻酸清洗液中浸泡2 4小時，工藝用水沖洗干凈。將玻片浸 泡于5% 10%硝酸水溶液中，85°C烘箱加熱1. 5 3. 5小時。工藝用水沖洗干凈后，將玻 片浸泡于工藝用水中室溫保存。由于玻片的主要成分是二氧化硅，用鉻酸、硝酸水溶液先后 處理后玻片表面帶陰離子電荷。2.抗體包被前處理取出浸泡于工藝用水中的玻片，敲擊掉適量工藝用水，使玻片仍以濕潤狀態(tài)浸泡 于0. 1 0. 5% (W/V)的多聚賴氨酸溶液中30 60分鐘，用工藝用水淋洗干凈后，以600 800r/min速度離心4分鐘甩干，室溫保存。多聚賴氨酸攜帶陽離子電荷，通過與玻片表面陰 離子電荷的相互作用，使多聚賴氨酸吸附于玻片表面。3.抗體包被將濃度為5 10 μ g/ml的鼠抗人⑶4單克隆抗體10_20 μ 1滴加在單凹上，室溫 孵育30 40分鐘。用PBS液淋洗后，80°C烘箱干燥5 10分鐘，放入玻片盒中2 26°C 密閉保存。實施例2⑶4細(xì)胞檢測試劑盒的制備CD4細(xì)胞檢測試劑盒包含CD4細(xì)胞芯片、稀釋液、過氧化氫溶液、染色液和復(fù)染液。⑶4細(xì)胞芯片通過實施例1制備。稀釋液可以由稀釋液片劑溶于水溶液而制成。稀釋液片劑為市售商品，購自上海 保康生物高科技有限公司，主要成分為氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、檸檬酸、 吐溫20等，以一片溶解于40ml水溶液即可配制成pH7. 0 7. 4的磷酸鹽緩沖液。其規(guī)格 為10片/包，密封鋁箔袋裝，遮光密閉保存。試劑盒組裝時僅在袋外加貼標(biāo)簽即可。稀釋液也可以通過將上述各種鹽按一定的濃度配制而成。過氧化氫溶液體積百分比濃度為2. 5 3. 5%，遮光密閉陰涼處保存。實際生產(chǎn)時 只需分裝成30ml/瓶，并在瓶外加帖標(biāo)簽即可。染色液的配制將堿性品紅、亞硝基鐵氰化鈉、聯(lián)苯胺按1 5%、3 5%、1 5% (W/V)的濃度比例溶解于95%乙醇后，置于棕色聚酯乙烯塑料試劑瓶中，于2 26°C密封保存。復(fù)染液的配制將堿性品紅按2 5% (W/V)的濃度比例溶解于95%乙醇后，置于 棕色聚酯乙烯塑料試劑瓶中，于2 26°C密封保存。實施例3應(yīng)用⑶4細(xì)胞芯片進(jìn)行檢測(整體流程見圖2)1、特異結(jié)合反應(yīng)加水于濕盒內(nèi)，使?jié)窈械撞客耆凰采w，擱置玻片處應(yīng)保持干 燥。取出玻片，將玻片置于濕盒支架上，蓋緊盒蓋。將稀釋后血樣滴加在CD4細(xì)胞芯片的已 包被抗體處，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。室溫下(20 30°C )濕盒內(nèi)反應(yīng)40分鐘。2、淋洗、染色反應(yīng)后的玻片用稀釋液提拉5 10次不等，主要是用稀釋液洗去非 特異性結(jié)合細(xì)胞和多余血樣，然后放入染色液缸中(有CD4抗原表達(dá)的細(xì)胞將被染上色)， 靜置1分鐘后，將稍加浙干的玻片架轉(zhuǎn)入新鮮過氧化氫工作溶液中，靜置4分鐘。接著將玻 片架轉(zhuǎn)入75%酒精專用缸中浸泡2分鐘后，根據(jù)玻片數(shù)量不同提拉5 10次不等，直至玻 片呈無色透明或淡粉紅色后將玻片架轉(zhuǎn)入復(fù)染液缸中，靜置1分鐘。最后將玻片架轉(zhuǎn)入水 中，根據(jù)玻片數(shù)量不同提拉5 10次不等，直至玻片呈淡紫紅色(如鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞染色過 淡，請重復(fù)復(fù)染)。上述染色步驟中，染色液染色后的玻片轉(zhuǎn)入過氧化氫溶液中浸置，是因為除了 CD4 淋巴細(xì)胞表面有CD4抗原的高表達(dá)外，單核細(xì)胞也存在CD4抗原的低表達(dá)，經(jīng)染色液染色， CD4細(xì)胞與單核細(xì)胞都被染上色。但是單核細(xì)胞胞漿內(nèi)含有過氧化物酶，而CD4細(xì)胞為淋 巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞胞漿內(nèi)不含有過氧化物酶，采用過氧化物酶染色法對固定在玻片上的CD4 細(xì)胞與單核細(xì)胞進(jìn)行區(qū)別，即將染色后的玻片轉(zhuǎn)入過氧化氫溶液中，讓氧化物酶與過氧化 氫反應(yīng)。由于單核細(xì)胞胞漿內(nèi)含有過氧化物酶，經(jīng)過過氧化物酶染色后，細(xì)胞內(nèi)會出現(xiàn)黑灰 色顆粒。與此相反，由于所需檢測的CD4細(xì)胞胞漿內(nèi)不含過氧化物酶，在過氧化氫溶液中浸 置后，細(xì)胞內(nèi)不出現(xiàn)黑灰色顆粒，通過光學(xué)顯微鏡即可對CD4細(xì)胞與單核細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分，該 方法簡單，而且無需增加CD4抗體來剔除單核細(xì)胞，成本非常低廉。3、計數(shù)玻片自然晾干后可直接用普通光學(xué)顯微鏡的10倍物鏡計算⑶4細(xì)胞數(shù) 量；或用上海匯中細(xì)胞生物科技有限公司研發(fā)的自動計數(shù)儀進(jìn)行自動計數(shù)。4、準(zhǔn)確性分析本發(fā)明⑶4細(xì)胞檢測盒經(jīng)上海傳染病醫(yī)院、北京協(xié)和醫(yī)院、北京佑安醫(yī)院、上海中 山醫(yī)院、美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)和日本大分大學(xué)艾滋病診療中心共1301例臨床考核 所得數(shù)據(jù)與流式細(xì)胞法進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析和Bland-Altman散點圖分析(見圖3)。 Pearson相關(guān)性分析和Bland-Altman散點圖分析是研證兩方法能否互相替代的經(jīng)典分析 工具，其中Pearson相關(guān)性分析可得兩方法之間具有良好的相關(guān)性；Bland-Altman散點圖 分析是臨床檢驗研究中用來比較兩檢驗方法之間差異的最佳分析方法。結(jié)果表明CD4細(xì) 胞檢測盒與流式細(xì)胞法檢測結(jié)果的相關(guān)性達(dá)0. 95，平均絕對誤差僅3個/ μ 1。5、特異性定量分析
本發(fā)明CD4細(xì)胞檢測盒通過用流式細(xì)胞法檢測分別包被CD4、CD8抗體的細(xì)胞芯片 反應(yīng)前后CD4、CD8的百分含量的變化進(jìn)行芯片特異性定量分析，數(shù)據(jù)表明當(dāng)細(xì)胞芯片包 被有CD4抗體時，僅特異的與CD4細(xì)胞結(jié)合，反應(yīng)后芯片上血樣幾乎無CD4細(xì)胞殘留，而CD8 細(xì)胞則完全沒有被結(jié)合，反之亦然(見下表1)。表1⑶4細(xì)胞檢測盒特異性定量分析同一血樣反應(yīng)前后⑶4、⑶8細(xì)胞百分率(η = 6)
玻片包被 抗體種類CD4抗體包被玻片CD8抗體包被玻片流式細(xì)胞 測記結(jié)果反應(yīng)前反應(yīng)后反應(yīng)前反應(yīng)后CD4%42. 30. 742. 341. 943. 30. 243. 343. 234. 10. 134. 134. 037.90. 637. 937. 335. 50. 435. 534. 933.80. 333. 833. 6CD8%29. 129. 029. 10. 535. 235. 135. 20. 330. 930. 730. 90. 431. 531.431. 50. 727. 627. 127.60. 332. 732. 232. 70. 56、批次間重復(fù)性檢測本發(fā)明CD4細(xì)胞檢測盒中細(xì)胞芯片進(jìn)行不同生產(chǎn)批次間重復(fù)性檢測結(jié)果比較數(shù) 據(jù)表明，CV控制在5%之內(nèi)，重復(fù)性良好(見下表2)。其中CV為數(shù)據(jù)波動百分?jǐn)?shù)，用來評 價重復(fù)性，一般重復(fù)性考核CV控制在20%以內(nèi)為合格。表2⑶4細(xì)胞檢測盒批次間重復(fù)性檢測
健康人柞木(n=5)流式法901玻片法896920892916872f-均數(shù)=899,CV=2.166%患各樣木(n=5)流式法295玻片法308292324296300平均數(shù)=304，CV=4.161%7、操作者間重復(fù)性檢測本發(fā)明CD4細(xì)胞檢測盒中細(xì)胞芯片進(jìn)行操作者間重復(fù)性檢測結(jié)果比較數(shù)據(jù)表明， CV控制在5 %之內(nèi)，重復(fù)性良好(見下表3)。表3⑶4細(xì)胞檢測盒操作者間重復(fù)性檢測
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健康人樣本(n=10)
流式法670操作存 A640604632672664 均數(shù)=647 cv=3,879%636680680636632操作者 B692680744708668平均數(shù)=677 cv=4.547%640664660646676
丁 檢驗F (5.132)<F0 05(8.28), P>0.05
不同操作者之間無差異8、靈敏度測定本發(fā)明CD4細(xì)胞檢測盒對血樣不同稀釋濃度的CD4細(xì)胞進(jìn)行靈敏度測定，數(shù)據(jù)表 明無論血樣中CD4細(xì)胞過多或過少均能準(zhǔn)確檢測(見下表4)，表4中的“r”指與流式檢 測的相關(guān)性。表4⑶4細(xì)胞檢測盒靈敏度測定
靈敏度的測試(n=6)稀釋比例CD4細(xì)胞計數(shù)(個/μΙ)1 416621776145452071 8871134075241081 1642601939115111 3223299185261 64111449212r0.99970.99960.99940.99960.99890.9996 以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能 因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說， 在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
一種CD4細(xì)胞芯片，包括固相載體和固定于該載體上的抗體，其特征在于，所述抗體為CD4單克隆抗體，所述固相載體為玻片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CD4細(xì)胞芯片，其特征在于，在所述玻片表面設(shè)有反應(yīng)區(qū)，所 述CD4單克隆抗體固定在該反應(yīng)區(qū)。
3.—種CD4細(xì)胞芯片的制備方法，其特征在于，包括以下步驟用酸清洗玻片，使玻片表面帶陰離子電荷；將清洗過的玻片放入多聚賴氨酸溶液中浸泡適當(dāng)時間，通過多聚賴氨酸攜帶的陽離子 電荷與所述玻片表面陰離子電荷之間的吸引，使多聚賴氨酸吸附于玻片表面；將CD4單克隆抗體滴加在玻片表面，室溫孵育合適時間，再用磷酸鹽緩沖液清洗后烘 干，于2 26°C保存待用。
4.一種CD4細(xì)胞檢測試劑盒，其特征在于，至少包括權(quán)利要求1所述的CD4細(xì)胞芯片。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的CD4細(xì)胞檢測試劑盒，其特征在于，還包括稀釋液、過氧化氫 溶液、染色液和復(fù)染液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的CD4細(xì)胞檢測試劑盒，其特征在于，所述染色液由堿性品紅、 亞硝基鐵氰化鈉、聯(lián)苯胺按1 5%、3 5%、1 5%的質(zhì)量體積百分比濃度溶解于95% 乙醇配制而成。
7.一種應(yīng)用CD4細(xì)胞芯片進(jìn)行檢查的方法，其特征在于，包括以下步驟將待測血樣滴加在CD4細(xì)胞芯片表面的抗體處，使其進(jìn)行抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)；用稀釋液洗去非特異性結(jié)合細(xì)胞和多余血樣；將玻片放入染色液中染色，并把染色后的玻片在過氧化氫溶液中浸置后，再轉(zhuǎn)入復(fù)染 液中染色，以區(qū)分CD4細(xì)胞和單核細(xì)胞；在光學(xué)顯微鏡下對CD4細(xì)胞計數(shù)，或采用自動計數(shù)儀完成CD4細(xì)胞計數(shù)。
8.權(quán)利要求1所述的CD4細(xì)胞芯片在制備診斷、監(jiān)測或輔助治療包括艾滋病、腫瘤性疾 病、自體免疫性疾病、器官移植、乙型肝炎、腦梗死、慢性阻塞性肺疾病的免疫力低下疾病產(chǎn) 品中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求4所述的CD4細(xì)胞檢測試劑盒用于診斷、監(jiān)測或輔助治療包括艾滋病、腫瘤 性疾病、自體免疫性疾病、器官移植、乙型肝炎、腦梗死、慢性阻塞性肺疾病的免疫力低下疾 病的用途。
10.權(quán)利要求4所述的CD4細(xì)胞檢測試劑盒用于健康體檢的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開一種CD4細(xì)胞芯片，包括固相載體和固定于該載體上的抗體，所述抗體為CD4單克隆抗體，所述固相載體為玻片。本發(fā)明還公開了CD4細(xì)胞芯片的制備方法、含CD4細(xì)胞芯片的CD4細(xì)胞檢測試劑盒、以及應(yīng)用CD4細(xì)胞芯片進(jìn)行檢測的方法。本發(fā)明還公開了CD4細(xì)胞芯片和CD4細(xì)胞檢測試劑盒的應(yīng)用。本發(fā)明CD4細(xì)胞芯片，成本低廉、操作簡便，特別適用于艾滋病毒感染嚴(yán)重的貧困地區(qū)。
文檔編號G01N33/552GK101957378SQ20091005759
公開日2011年1月26日 申請日期2009年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月13日
發(fā)明者何駿杰, 曹波, 楊君 申請人:上海匯中細(xì)胞生物科技有限公司