肼腈類組織蛋白酶k抑制劑及其在制備治療骨關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】肼腈類組織蛋白酶K抑制劑及其在治療骨關(guān)節(jié)炎方面的應(yīng)用，屬于組織蛋白酶抑制劑技術(shù)領(lǐng)域。該抑制劑具有新型的、不同取向的P3基團(tuán)，在細(xì)胞外其對組織蛋白酶K的抑制效應(yīng)皆在納摩爾濃度水平，對K和S，B的選擇性皆在數(shù)百倍甚至以上。即使對同源性很高的組織蛋白酶K和L的選擇性也都在數(shù)百倍以上。以原代軟骨細(xì)胞為模型，采用兩種培養(yǎng)條件：(1)細(xì)胞傳代、(2)抗壞血酸和β?甘油磷酸刺激培養(yǎng)。分別采用明膠酶譜法和定量熒光法測試，發(fā)現(xiàn)其組織蛋白酶K的表達(dá)量在兩種條件下都有增加；然后加入該新型抑制劑后，組織蛋白酶K的活性降低。說明在細(xì)胞內(nèi)該抑制劑也能很好地發(fā)揮作用，對組織蛋白酶K顯示很好的抑制效果。
【專利說明】
肼腈類組織蛋白酶K抑制劑及其在制備治療骨關(guān)節(jié)炎藥物中 的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于組織蛋白酶抑制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一類新型高效的肼腈類組織蛋 白酶抑制劑，其對組織蛋白酶Κ和Β、L、S的選擇性有極大地提尚，且在制備治療骨關(guān)節(jié)炎的 相關(guān)藥物方面有潛在的應(yīng)用性，從而在臨床上對于治療骨關(guān)節(jié)炎及相關(guān)疾病有重要的意 義。
【背景技術(shù)】
[0002]骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，0Α)是由機(jī)械性損傷和生物因素相互作用而導(dǎo)致的一 系列病變。作為一種退行性關(guān)節(jié)紊亂的疾病，骨關(guān)節(jié)炎的主要特征表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨破壞、軟 骨下骨改變、以及滑膜炎等，嚴(yán)重影響著患者的日常生活[1];在未來幾年內(nèi)，骨關(guān)節(jié)疾病將 會越發(fā)引起人們的關(guān)注[2]。(^的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，至今還沒有統(tǒng)一定論[3]。目前治療0Α的 藥物包括非留體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、以及其它一些生物藥物(如氨基葡萄糖、硫酸軟骨素 和透明質(zhì)酸等），但是它們也僅限于表象治療，而且治療效果不明顯，重現(xiàn)性差[4]。
[0003] 有證據(jù)表明，在骨關(guān)節(jié)炎癥處由于蛋白水解酶的過量表達(dá)而導(dǎo)致軟骨的分解代謝 能力增強，包括蛋白聚糖的損耗和II型膠原蛋白的降解[3,5]。目前已被確認(rèn)的致使軟骨降解 的關(guān)鍵酶有:基質(zhì)金屬蛋白酶(尤其是ΜΜΡ-3，ΜΜΡ-9和ΜΜΡ-13)，蛋白聚糖酶(ADAMTS-4和 ADAMTS-5)和半胱氨酸蛋白酶[5_8]。其中木瓜類半胱氨酸蛋白酶家族的一員一一組織蛋白酶 K(Cathepsin K，Cat Κ)，它大量存在于多種組織內(nèi)，如:骨、卵巢、心臟、胎盤、肺癌、骨骼肌、 結(jié)腸和小腸[9]。當(dāng)Cat K缺乏時，會導(dǎo)致致密性成骨不全癥[1()]和硬化疾病[11];相反地，當(dāng)Cat K表達(dá)過度時，會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化和骨關(guān)節(jié)炎等骨疾病[9，12]， 因此組織蛋白酶K的正常表達(dá)在生命活動中至關(guān)重要。已有研究表明，Cat K可以在多個位 點裂解膠原蛋白的的三螺旋結(jié)構(gòu)[13]，因而成為治療骨關(guān)節(jié)炎類疾病的藥物靶標(biāo)酶;而其抑 制劑則在治療骨關(guān)節(jié)炎方面顯示了極佳地保護(hù)軟骨的能力[14~]，從而在骨生物學(xué)研究中 意義重大。
[0004] 為了提供更多的治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在藥物小分子的結(jié)構(gòu)，也為了進(jìn)一步優(yōu)化其抑 制效應(yīng)和生物學(xué)性能，本發(fā)明以商業(yè)化的組織蛋白酶K抑制劑--Odanacatib(ODNA)為參 照，比較研究幾個新合成的新型小分子抑制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是：一、提供兩個新型的組織蛋白酶K抑制劑一一（± )CKI_E和（± ) CKI-F，它們不但對組織蛋白酶K顯示了很好的抑制性能(較低的IC5Q和1值），且對組織蛋白 酶K和B、L和S的選擇性有極大提高。二、MTT比色法測試的結(jié)果表明，在高濃度存在的條件下 兩種抑制劑在細(xì)胞水平上均未顯示任何毒性。三、在小鼠原代軟骨細(xì)胞內(nèi)利用明膠酶譜法 和定量熒光法所測試的兩種抑制劑對組織蛋白酶K的活性影響。結(jié)果表明：這兩種抑制劑都 是很好的藥物潛體。
[0006] 本發(fā)明所述的抑制劑的合成及表征
[0007] 我們將新抑制劑結(jié)構(gòu)中的P3位基團(tuán)改變?yōu)閷ξ?間位二聯(lián)苯的甲基砜，使抑制劑 分子的大小、取向、親疏水性能與組織蛋白酶K的S3口袋在結(jié)構(gòu)上更匹配，從而提高其對組 織蛋白酶K的抑制效應(yīng)以及它們對組織蛋白酶K和其它組織蛋白酶的抑制選擇性。
[0008] 本發(fā)明中所述的組織蛋白酶K的高選擇性新抑制劑的結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0009]
[0010] 具體地，包括如下兩種結(jié)構(gòu)：
[0011]
[0012] 它們可通過以下的合成路線得到：
[0013]
[0014] 以上路線分別是針對合成P3位是（±)4_甲基砜苯的對位(para-)衍生物和間位 (meta-)衍生物。在抑制劑小分子的合成過程中，先后采用了對位/間位溴苯乙酸和LDA參與 的親核反應(yīng)、氯甲酸異丁酯和N-甲基嗎啉參與的酰胺化反應(yīng)、以及芳基硼酸和溴代芳烴參 與的Suzuki反應(yīng)。
[0015] 該抑制劑具有新型的、不同取向的P3基團(tuán)，在細(xì)胞外其對組織蛋白酶K的抑制效應(yīng) 皆在納摩爾濃度水平，對K和S，B的選擇性皆在數(shù)百倍甚至以上。即使對同源性很高的組織 蛋白酶K和L的選擇性也都在數(shù)百倍以上。當(dāng)該新型抑制劑濃度達(dá)10-6Μ時，其對成骨肉瘤細(xì) 胞、成熟小鼠的平滑肌細(xì)胞、或軟骨細(xì)胞均無任何毒副作用。以原代軟骨細(xì)胞為模型，采用 兩種培養(yǎng)條件：（1)細(xì)胞傳代、（2)抗壞血酸和β-甘油磷酸刺激培養(yǎng)。分別采用明膠酶譜法和 定量熒光法測試，發(fā)現(xiàn)其組織蛋白酶Κ的表達(dá)量在兩種條件下都有增加;然后加入該新型抑 制劑后，組織蛋白酶Κ的活性降低。說明在細(xì)胞內(nèi)該抑制劑也能很好地發(fā)揮作用，對組織蛋 白酶Κ顯示很好的抑制效果。
【附圖說明】
[0016] 圖1:化合物CKI-E抑制組織蛋白酶Κ的半數(shù)抑制濃度(IC5Q)測量曲線。
[0017 ]圖2:化合物CKI-E抑制組織蛋白酶L的半數(shù)抑制濃度（IC5Q)測量曲線。
[0018]圖3:化合物CKI-E抑制組織蛋白酶S的半數(shù)抑制濃度(IC5Q)測量曲線。
[0019]圖4:化合物CKI-E抑制組織蛋白酶B的半數(shù)抑制濃度（IC5Q)測量曲線。
[0020]圖5:化合物CK I-F抑制組織蛋白酶K的半數(shù)抑制濃度(IC5Q)測量曲線。
[0021]圖6:化合物CK I-F抑制組織蛋白酶L的半數(shù)抑制濃度(IC5Q)測量曲線。
[0022] 圖7:化合物CKI-F抑制組織蛋白酶S的半數(shù)抑制濃度(IC5Q)測量曲線。
[0023] 圖8:化合物CKI-F抑制組織蛋白酶B的半數(shù)抑制濃度(IC5Q)測量曲線。
[0024]圖9:抑制劑（± )CKI-E和（± )CKI-F對成熟小鼠的平滑肌細(xì)胞、人成骨肉瘤細(xì)胞、 小鼠原代軟骨細(xì)胞的細(xì)胞存活率測試圖。
[0025]圖10:軟骨細(xì)胞在傳代過程中（原代P0、第一代P1、第二代P2、第三代P3)的變化圖。 [0026] 圖11明膠酶譜法測試對照組DMSO(A)、化合物CKI-E(B)、CKI-F(C)、ODAN(D)對軟骨 細(xì)胞(P〇、P1、P2、P3)中組織蛋白酶K的活性的影響圖。
[0027]圖12(A)熒光法測試軟骨細(xì)胞斤0、？1、？2、？3)中組織蛋白酶1(的活性表達(dá)圖；（8)以 DMS0為對照組，熒光法測定化合物CKI-E、CKI-F，0DAN對第2代軟骨細(xì)胞中組織蛋白酶K活性 的表達(dá)圖。
[0028]圖13(A)熒光法測試經(jīng)抗壞血酸和β-甘油磷酸刺激過的原代軟骨細(xì)胞和對照組未 被刺激過的原代軟骨細(xì)胞中組織蛋白酶Κ的活性表達(dá)圖；（Β)以刺激過的原代軟骨細(xì)胞為對 照組，分別加入化合物CKI-E、CKI-F，0DAN進(jìn)行抑制后，各組軟骨細(xì)胞中組織蛋白酶Κ的活性 表達(dá)圖。
[0029]抑制劑的抑制效應(yīng)檢測 [0030] 1.抑制效應(yīng)
[0031 ]抑制劑對酶的抑制效應(yīng)主要通過IC5Q和Ki值來表示，其中IC5Q是半數(shù)抑制濃度，指 在一定實驗條件下將酶的活性降到原有活力一半時所需抑制劑的濃度;^是抑制劑與酶作 用的解離常數(shù)，也被稱作抑制劑的抑制常數(shù)。
[0032] 2.體外酶活檢測條件
[0033] 組織蛋白酶K:配制40mL、pH值為5.5的MES-NaOH緩沖溶液待用，內(nèi)含2.5mM EDTA、 2.5mM DTT和10%DMS0;以20ymol/L的Z-Phe-Arg-AMC為熒光底物(注:本專利所有緩沖溶液 中所用百分比皆為體積百分比）。
[0034]組織蛋白酶L:檢測條件、焚光底物均與組織蛋白酶K相同。
[0035] 組織蛋白酶B:配制40mL、pH值為6.0的MES-NaOH緩沖溶液待用，內(nèi)含2.5mM EDTA、 2 · 5mM DTT、10%DMS0和0 · 001 %Tween20;以20ymol/L的Z-Phe-Arg-AMC為熒光底物。
[0036] 組織蛋白酶3:配制4〇1111^!1值為6.5的腿3-恥0!1緩沖溶液待用，內(nèi)含2.51111^0丁八、 2 · 5mM DTT、10%DMS0和0 · 001 %BSA;以40ymol/L的Z-WR-AMC為熒光底物。
[0037] 3.抑制效應(yīng)檢測過程
[0038] 首先配置酶、底物和抑制劑的貯備液;然后根據(jù)需要將抑制劑按一系列的濃度梯 度稀釋，采用酶標(biāo)儀來監(jiān)測酶的反應(yīng)速率;根據(jù)酶的剩余活力和抑制劑濃度作圖，算出酶的 半數(shù)抑制濃度IC5Q，進(jìn)而計算出K1;并對其進(jìn)行構(gòu)-效關(guān)系分析，最終選擇出抑制效應(yīng)高且選 擇性好的抑制劑。
[0039] 設(shè)置儀器參數(shù)之后，進(jìn)行酶活檢測：
[0040] 首先，在96孔板的前三個孔中平行做3個空白對照組實驗，在后面9個孔中依次加 入lyL不同濃度（ΙηΜ~7μΜ)的抑制劑(CKI-E或CKI-F);再在這12個孔中分別加入10yL的同 一種酶(組織蛋白酶K、L、B或S);隨后分別在前3個孔依次加入40yL相對應(yīng)的緩沖溶液，后9 個孔中依次加入39yL相對應(yīng)的緩沖溶液，使每個孔中溶液的總體積達(dá)50yL。將96孔板放入 37°C恒溫培養(yǎng)箱中孵育30min之后，加入50yL相對應(yīng)的底物；充分混勻后，利用酶標(biāo)儀立即 進(jìn)行酶活性檢測。將測得的數(shù)據(jù)輸入Origin軟件，利用Sigmoidal進(jìn)行曲線擬合，在獲得的 曲線上，觀察酶活力被抑制50%時所需抑制劑的濃度，即IC5Q值。抑制劑(CKI-E或CKI-F)對 組織蛋白酶K的半數(shù)抑制濃度(IC5Q)測量曲線見附圖1-8。
[0041 ] 4.酶活性檢測結(jié)果如表1所示：
[0042]表1:抑制劑對四種酶的IC5Q數(shù)據(jù)
[0043] 1
[0045]根據(jù)已報道的、在相同條件下測得的米氏常數(shù)(Km)[17]:組織蛋白酶K，K m=18.06土 0.224]\1;組織蛋白酶1^，1^=3.525±0.4054]\1;組織蛋白酶8，1^=157.5±2.54]\1 ;組織蛋白酶 S，Km= 102.19± 1.51μΜ;以及公式Ki = IC5Q/(1+[S]/Km)，將IC5Q值轉(zhuǎn)換成Ki值后的結(jié)果見表 2;其中[S]為底物濃度，Km為米氏常數(shù)。
[0046]表2:抑制劑對四種酶的Ki數(shù)據(jù)
[0047]
[0048] 由試驗結(jié)果知，本發(fā)明所合成的兩個新型抑制劑對組織蛋白酶K的抑制效果都達(dá) 到了納摩爾濃度級別，其中（±)CKI-E的抑制常數(shù)達(dá)到了 1.14ηΜ。而且（±)CKI-E和（±) CKI-F對于同源性內(nèi)切酶K和L的選擇性也很好，分別達(dá)到了 195倍和406倍。兩個抑制劑對組 織蛋白酶K和S、B的選擇性也都在數(shù)百倍或更高，尤其需要指出的是，（± )CKI-F對組織蛋白 酶K和B的選擇性達(dá)到了 3345倍。
[0049] 細(xì)胞存活率的測定
[0050] 1.MTT 比色法
[0051 ]本發(fā)明米用四挫鹽（3_[4,5-dimethylthiazol_2-yl ]_2，5-diphenyltetrazolium bromid，MTT)為基礎(chǔ)的比色法(Colorimetric assay)來檢測抑制劑小分子對細(xì)胞的毒性； 其原理是：在具有代謝活性的活細(xì)胞內(nèi)，黃色的MTT可被裂解成紫色的甲瓚(Formazan)晶 體[1M9];此晶體可以溶解在DMS0中形成有色溶液，然后用多孔掃描分光光度計定量檢測。 [0052] 2.細(xì)胞模型和培養(yǎng)條件
[0053] 本發(fā)明采用三種細(xì)胞模型，分別為：（a)成熟小鼠的平滑肌細(xì)胞(Mouse smooth muscle cell line M0VAS，從成熟小鼠的平滑肌獲?。?，（b)人成骨肉瘤細(xì)胞（Human osteosarcoma MG_63cell line，從人類成骨肉瘤獲?。?，（c)小鼠原代軟骨細(xì)胞(Primary chondrocytes，從剛出生5-6天的幼鼠的軟骨處獲取）。
[0054]細(xì)胞的培養(yǎng)條件:在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)這三種細(xì)胞(平滑肌細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞 或原代軟骨細(xì)胞），每板只培養(yǎng)一類細(xì)胞，且使用同一高糖型DMEM培養(yǎng)基（10 %胎牛血清； 100U/mL青霉素和100yg/mL鏈霉素；1%谷氨酰胺；2%HEPES緩沖液），其中每孔50000個細(xì) 胞，lmL培養(yǎng)基;培養(yǎng)環(huán)境為含有5 %⑶2和95 %空氣的37 旦溫培養(yǎng)箱。48小時之后更換一 次培養(yǎng)基(注:本專利所有培養(yǎng)基及培養(yǎng)細(xì)胞條件中所用百分比皆為體積百分比）。
[0055] 3.MTT比色法實驗過程
[0056]當(dāng)細(xì)胞數(shù)量生長至約100 000個/孔，利用MTT比色法進(jìn)行細(xì)胞存活率的測試。首先 設(shè)置兩個對照組(含或不含DMS0)，以觀察DMS0是否對細(xì)胞的活性有影響；其次將本發(fā)明制 備的小分子抑制劑（± )CKI-E和（± )CKI-F用DMS0溶解，配制成10-3mol/L儲備液待用;然后 將DMS0和抑制劑CKI-E、CKI-F的儲備液加入DMEM培養(yǎng)基，每一列含3孔做為平行，共4列使之 呈現(xiàn)濃度梯度：10'10'10'10^1〇1/1;當(dāng)細(xì)胞數(shù)量和狀態(tài)達(dá)標(biāo)后，移除上層培養(yǎng)基，在12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每孔中分別加入lmL含不同濃度梯度DMS0和抑制劑CKI-E、CKI-F的細(xì)胞培 養(yǎng)基。每個濃度有三個平行樣，所以共測試3次(n = 9);之后放入培養(yǎng)箱孵育48h。每孔加入 25yL MTT (5mg/mL，四唑鹽，黃色），繼續(xù)孵育4h。移除培養(yǎng)基，有不溶于水的紫色甲瓚晶體； 然后每孔加入lmL DMS0溶解此晶體，顏色的深淺與甲瓚的含量成正比。待完全溶解后，次日 使用酶標(biāo)儀在波長為570nm處對樣品的吸光值進(jìn)行測定。在一定的細(xì)胞數(shù)量范圍內(nèi)，樣品的 吸光值與細(xì)胞存活率成正比。
[0057] 4.實驗結(jié)果與討論
[0058] 抑制劑（± )CKI_E和（± )CKI_F對成熟小鼠的平滑肌細(xì)胞、人成骨肉瘤細(xì)胞、小鼠 原代軟骨細(xì)胞的細(xì)胞存活率的測試結(jié)果見附圖9。結(jié)果表明：當(dāng)濃度在10_9~10_6mol/L范圍 內(nèi)，DMS0對MTT比色法未產(chǎn)生干擾。然后將含有DMS0的對照組的細(xì)胞存活率設(shè)定為100%，加 入抑制劑的實驗組的吸收值與未加抑制劑的對照組的吸收值的比率即為細(xì)胞存活率。當(dāng)濃 度由InM逐漸增加至ΙΟΟΟηΜ時兩種小分子抑制劑皆未對三種細(xì)胞的細(xì)胞存活率產(chǎn)生明顯影 響，這表明在此濃度范圍內(nèi)，兩種抑制劑對所測試的三種細(xì)胞均無毒性。
[0059] 細(xì)胞內(nèi)組織蛋白酶K的活性測試
[0060] 以小鼠原代軟骨細(xì)胞為模型，本發(fā)明采用明膠酶譜法和定量熒光法測試抑制劑 CKI-E和CKI-F在細(xì)胞水平上對組織蛋白酶K的活性的影響。
[0061 ] 1.測試方法一明膠酶譜法和定量熒光法簡介
[0062]明膠酶譜法[2()]是基于將蛋白質(zhì)底物（明膠)與SDS-聚丙烯酰胺凝膠混合，使待測 蛋白質(zhì)樣本在此凝膠中電泳的方法。蛋白質(zhì)與凝膠中含陰離子的SDS結(jié)合生成蛋白質(zhì)-SDS 中間產(chǎn)物，致使待測蛋白質(zhì)上攜帶大量負(fù)電荷以至于遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)本身的電荷量，從而 使在電泳凝膠中的蛋白質(zhì)迀移速率僅取決于其本身的分子量，從而忽略蛋白質(zhì)本身因電荷 不同而帶來的迀移速率上的差異。凝膠電泳之后，用洗脫液除去SDS，待測蛋白質(zhì)的活性恢 復(fù)。孵育一段時間之后，待測蛋白質(zhì)充分水解底物明膠，再用考馬斯亮藍(lán)染色，即可顯示一 條清晰的白色條帶。根據(jù)此白色條帶的密度和面積，便可測定酶的活性[21]。
[0063]定量熒光法是一種新的方法，可以選擇性檢測原代軟骨細(xì)胞內(nèi)組織蛋白酶K的活 性。其基本原理如下:在5-硝基水楊醛(5-Nitrosalicylaldehyde，簡稱NSA)存在的條件下， 將細(xì)胞與待測組織蛋白酶K的底物一肽衍生物(4-methoxy-0-naphthylamine，簡稱4ΜβΝΑ) 共同孵育一段時間后用熒光光譜儀測定其熒光產(chǎn)物的吸光值，作為對照實驗值。然后加入 組織蛋白酶Κ的小分子抑制劑后，再測試熒光產(chǎn)物的吸收值。最后，通過加入抑制劑和未加 抑制劑的吸收值比值計算(Enzyme activities :* 100%.)[22-25]，得到組 織蛋白酶的活性。
[0064] 2.細(xì)胞的培養(yǎng)條件
[0065]原代軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)采用DMEM培養(yǎng)基（內(nèi)含4.5g/L葡萄糖，10%胎牛血清，1 %青 霉素-鏈霉素，1 %谷氨酸鹽，1 %HEPES緩沖液），連續(xù)培養(yǎng)10天，作為對照組體系；然后采用 同樣的DMEM培養(yǎng)基，但同時含有50yg/mL抗壞血酸(Ascorbic acid，AA)和7.5πιΜβ-甘油憐酸 (β-glycerophosphate ,β-GP)，連續(xù)培養(yǎng)10天，作為實驗組體系，作用為刺激誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生 更多的組織蛋白酶。與此同時，本發(fā)明還對軟骨細(xì)胞進(jìn)行傳代，采用DMEM培養(yǎng)基（內(nèi)含4.5g/ L Glucose，10%胎牛血清，100U/mL青霉素和100yg/mL鏈霉素，1 %谷氨酸鹽，1 %HEPES緩沖 液；以下傳代步驟皆用此培養(yǎng)基)培養(yǎng)約48h。后移除此培養(yǎng)基，用PBS清洗后，加入2mL胰酶 (Tryps in)后置于37 °C培養(yǎng)箱中等待細(xì)胞懸浮，然后加入8mL高糖DMEM培養(yǎng)基吹打混勻。均 分5mL混合液于15mL離心管中離心（400g，5min)，獲取下層沉淀，并加入500yL提取緩沖液 (20nM Tris-HCl,pH=7.5,5mM EGTA,150mM NaCl,10mM NaF,2OmM0-glycerol phosphate, ImM sodium orthovanadate，l%Triton X-100,0.1%Tween 20)，保存為P0(Passage 0)以 作備用。將剩余的5mL混合液置于新的培養(yǎng)皿中，再加入4~5mL高糖DMEM培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱 中（標(biāo)記為Passage 1，P1)，用于傳代。（附：P1的保存，以及傳代P2、P3的保存均同上述步 驟）。軟骨細(xì)胞Primary chondrocytes在傳代過程中（原代、第一代、第二代、第三代）的變化 見附圖10。
[0066] 3.結(jié)果與討論
[0067] 3.1采用被傳代前后的軟骨細(xì)胞(原代P0、第一代P1、第二代P2、第三代P3)，利用明 膠酶譜法分別測試其中的組織蛋白酶K的活性。以DMS0作為不加抑制劑的對照組(A)，實驗 組分別加入ΙμΜ抑制劑0:〇〇41(：:〇(14、〇:〇(14)，實驗結(jié)果見附圖11。
[0068] 從圖(Α)可知，由原代Ρ0至第二代Ρ2代軟骨細(xì)胞內(nèi)組織蛋白酶Κ的活性隨代數(shù)逐漸 增強，且在第二代時表達(dá)量最高。當(dāng)加入抑制劑〇〇4以8)，0(14(〇,0(14(0)且濃度達(dá)到以 Μ時，組織蛋白酶的活性均明顯被抑制。
[0069] 3.2采用被傳代前后的軟骨細(xì)胞(原代Ρ0、第一代Ρ1、第二代Ρ2、第三代Ρ3)，利用定 量熒光法測試其中的組織蛋白酶Κ的活性。以DMS0為不加抑制劑的對照組，而分別加入ΙμΜ 和2μΜ抑制劑(0DAN、CKI-E、CKI-F)的樣品作為實驗組，測試結(jié)果見附圖12。
[0070]從圖(A)結(jié)果可知:從原代P0至第二代P2代軟骨細(xì)胞內(nèi)組織蛋白酶K的活性逐漸增 強，且在第二代時表達(dá)量最高。然后當(dāng)分別加入1μΜ、2μΜ抑制劑(0DAN，CKI-E，CKI-F)后，它 們對細(xì)胞內(nèi)的組織蛋白酶K的抑制效應(yīng)隨抑制劑濃度的升高而增強，見圖(B)。
[0071 ] 3 · 3米用 50yg/mL抗壞血酸（Ascorb i c ac id，AA)和7 · 5ηιΜβ-甘油磷酸（β- glycerophosphate，P-GP)連續(xù)刺激誘導(dǎo)10天的軟骨細(xì)胞、和未經(jīng)刺激誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞作為 實驗對照組，利用定量熒光法檢測細(xì)胞內(nèi)組織蛋白酶K的表達(dá)量，測試結(jié)果見附圖13。
[0072] 結(jié)果(A)表明：當(dāng)以未經(jīng)刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞作為對照試驗組時，經(jīng)刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞 內(nèi)的組織蛋白酶K的相對活力由100增至140,即組織蛋白酶K的表達(dá)量明顯增加。然后，分別 依次加入0. ΙμΜ或ΙμΜ的抑制劑(CKI-E，CKI-F，0DAN)，它們對細(xì)胞內(nèi)的組織蛋白酶K的抑制 效應(yīng)均隨抑制劑濃度的升高而增強，見圖(Β)。
[0073] 3.4綜合以上明膠酶譜法和定量熒光法的實驗結(jié)果表明：在被傳代的軟骨細(xì)胞中， 組織蛋白酶Κ的表達(dá)量在Ρ2時達(dá)最大；當(dāng)加入抑制劑ODAN，CKI-E或CKI-F后，它們均可抑制 細(xì)胞內(nèi)組織蛋白酶Κ的活性。且在軟骨細(xì)胞受到誘導(dǎo)刺激后，細(xì)胞內(nèi)的組織蛋白酶Κ的表達(dá) 量被明顯增加；同樣，該條件下當(dāng)加入ODAN，CKI-E或CKI-F后它們也均可抑制組織蛋白酶Κ 的活性。
【具體實施方式】
[0074] 在已有的（± )E4(para-/meta-)合成的前提下[26]，取0.61g母體化合物（± )Ε4 (para-)、以及其它的從商業(yè)渠道獲得的化合物：0.43g對（±)甲基砜苯硼酸（（4- (methylsulfonyl)phenyl)boronic acid)、65 · 3mg[ 1，1 雙（二苯基磷）二茂鐵]二氯化鈀 (Pd(dppf)Cl2)和0.5g碳酸鉀粉末分別加入帶有攪拌磁子的100mL圓底燒瓶中，然后將40mL 的四氫呋喃加入圓底燒瓶中做為反應(yīng)溶劑，再用移液槍注入2mL水。三次(氮氣-真空)充抽 反應(yīng)體系之后，加熱回流約6h[27]。并用薄層色譜(TLC)監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)程，待反應(yīng)完全，用旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)儀將燒瓶中的四氫呋喃蒸干。然后加入60mL乙酸乙酯和20mL水，用分液漏斗分出有機(jī) 相，再用乙酸乙酯萃取3次水相，合并有機(jī)相。并依次用水、飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉洗滌 有機(jī)相。用無水硫酸鈉干燥，待干燥完畢，過濾掉此干燥劑，蒸干乙酸乙酯溶劑，得到化合物 (±)CKI-E的粗產(chǎn)物;最后用石油醚：乙酸乙酯= 1:1(體積:體積）的混合溶劑做為展開劑， 進(jìn)行硅膠柱層析提純，得（±)CKI-E的白色粉末狀固體0.23g。
[0075]同樣的步驟，用（± )E4(meta_)代替（± )E4(para_)，其它實驗條件相同，得（± ) CKI-F的白色粉末狀固體0.19g。
[0076] CKI-E表征結(jié)果如下：
[0077] 4 NMR(500MHz，CDC13) :S8.03(d，J = 8.2Hz，2H)，S7.78(d，J = 8.3Hz，2H)，δ7.61 (d,J = 8.2Hz,2H) ,57.46(dd,J = 22.0,9.8Hz,2H),54.26(t,J = 7.2Hz,1H),53.21(s,4H),5 3.12(s,3H),52.62(s,3H),52.09-1.98(m,lH),5l.66(dt,J =29.6,11.4Hz,1H),δ?.52 (dt ,J = 13.7,7.0Hz,lH),5l.01-0.94(m,6H).
[0078] 13C 匪R(126MHz,CDC13):Sl74.48(s),Sl45.85(s)J140.32(s),Sl39.28(s)，δ 137.99(s),5128.74(s),5127.91(d,J=18.6Hz),5113.91(s),545.81(s),544.61(s), δ 43.58(s),540.59(s),530.64(s),525.67(s),522.71(s),522.40(s).
[0079] MS(ESI)m/z:414.1841[M+H]+,827.3567[2M+H] +.
[0080] CKI-F表征結(jié)果如下：
[0081] 咕 NMR(500MHz，CDCl3):S8.04(d，J = 8.1Hz，2H)，S7.80(dd，J=18.9,8.1Hz，lH)，S 7.58-7.51(m,2H) ,57.47(dd,J=15.1,7.4Hz,lH) ,54.30(dt,J=14.8,7.2Hz,lH) ,53.20 (s,3H),53.12(s,4H),52.59(s,2H),52.15-1.81(m,2H),5l.50(ddd,J=22.6,14.0,7.2Hz, lH),5〇.97(dd ,J = 10.9,4.3Hz,6H).
[0082] 13C 匪R(126MHz,CDC13) :Sl74.50(s),Sl46.02(s)J140.75(s),Sl39.87(s)，δ 139.49(s),5129.69(s),5128.54-I27.67(m),126.61(d,J=8.7Hz),5126.29(s),546.19 (s),544.64(s),543.73(s),540.57(s),530.67(s),525.74(s),522.64(s),522.47(s).
[0083] MS(ESI)m/z:414.1839[M+H]+,827.3571[2M+H] +.
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【主權(quán)項】
1. 一種阱臘類組織蛋白酶抑制劑，其結(jié)構(gòu)式如下所示：2. 如權(quán)利要求1所述的一種阱臘類組織蛋白酶抑制劑，其結(jié)構(gòu)式如下所示：3. 權(quán)利要求1或2所述的阱臘類組織蛋白酶抑制劑在制備治療骨關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K31/277GK105837479SQ201610207293
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月5日
【發(fā)明人】吳玉清, 原曉喻, 瑞內(nèi)·布希, 薩伊達(dá)·梅霸瑞克
【申請人】吉林大學(xué)