專利名稱：：組織蛋白酶h的用途的制作方法組織蛋白酶H的用途本發(fā)明涉及組織蛋白酶H的用途。本發(fā)明的其它方面涉及用于篩選藥物的方法、用于診斷疼痛易感性的方法以及用于治療疼痛的方法。在西方國家，慢性疼痛是未解決的重大健康問題，其逐漸損害數(shù)百萬公民的健康和幸福。慢性疼痛嚴重困擾患有慢性疼痛的個人幸福并且往往伴隨有或隨后出現(xiàn)植物性癥狀(vegetativesigns)，這常常導致抑郁癥。慢性疼痛致使個體受苦并造成巨大程度的社會經(jīng)濟損失?，F(xiàn)有藥理學疼痛療法就功效和安全性而言均普遍不令人滿意。鑒于與現(xiàn)有疼痛治療技術(shù)相關(guān)的嚴重缺陷，極需新的選擇用于治療持續(xù)疼痛以及用于與慢性疼痛潛在發(fā)展有關(guān)的診斷和預后。尤其是鑒于對疼痛神經(jīng)生物學的快速增進的了解與提供有效治療且無現(xiàn)有治療技術(shù)缺陷的未滿足的臨床需求之間的巨大鴻溝，有需要致力于發(fā)現(xiàn)新型鎮(zhèn)痛藥類的新靶標。因此，本發(fā)明的目的是提供用于開發(fā)和提供調(diào)節(jié)疼痛的新型藥物的新方法。通過使用組織蛋白酶H或其功能片段或衍生物以鑒定調(diào)節(jié)疼痛并且特別是神經(jīng)性疼痛的化合物來達到該目的。本發(fā)明基于發(fā)明人以下意想不到的發(fā)現(xiàn)，首次證明在小鼠神經(jīng)性疼痛模型中組織蛋白酶H的表達與疼痛易感性密切相關(guān)。按照國際疼痛研究協(xié)會的定義，疼痛是與實際或潛在組織損傷有關(guān)、或依據(jù)此類損傷來描述的不愉快的感覺和情緒體驗。疼痛通常是感受傷害的神經(jīng)系統(tǒng)激活的結(jié)果，其特化為探測并編碼(encode)組織損傷或潛在損傷。因此，疼痛是身體警報系統(tǒng)的一部分，以啟動使身體的實際或潛在損傷最小化的反應。疼痛可為醫(yī)學病癥的原發(fā)癥狀或可為疾病狀態(tài)的繼發(fā)效應，通常無任何生物學意義。疼痛可為急性或慢性的。急性疼痛是表明潛在或?qū)嶋H損傷的生理信號。其伴隨組織破壞、感染、炎癥或其它急性起因而發(fā)生，是身體損傷或機能障礙后對個體的警告。急性疼痛若治療不當，可導致慢性疼痛。慢性疼痛是具有不同起因、持續(xù)期、強度和特定癥狀的疾病狀態(tài)。慢性疼痛可為感受傷害起源的、炎性或神經(jīng)性的。認為感受傷害的疼痛與軀體或內(nèi)臟的疼痛-敏感性神經(jīng)纖維的持續(xù)激活成相當比例。神經(jīng)性疼痛是由外周或中樞神經(jīng)元組織的任何種類損傷導致的疼痛；認為其通過外周神經(jīng)系統(tǒng)、CNS或兩者中的異常體覺過程而持續(xù)。(關(guān)于疼痛機制的綜述，參見例如Scholz和Woolf,2002；Julius和Basbaum,2001，Woolf和Mannion,1999；ffood,J.D.，2000;WooIf和Salter,2000.)慢性神經(jīng)性疼痛因不同患者而異。最近的數(shù)據(jù)表明，對于個體所遭受的痛苦的量，個體的疼痛易感性起重要作用，即對于疼痛，特別是對于神經(jīng)性疼痛的發(fā)展有著重要的遺傳誘因。本發(fā)明基于本發(fā)明人在嚙齒動物慢性疼痛模型中旨在鑒定疼痛易感性基因(即決定在給定的固定程度的組織損傷存在下感受的疼痛量的基因)的大量研究。發(fā)明人使用的嚙齒動物模型和實驗設(shè)置使得在不同個體之間具有以下實驗條件a)可精確控制神經(jīng)損傷的性質(zhì)和一致性jPb)可使遺傳及環(huán)境的變化性最小化。組織蛋白酶H(CTSH;依據(jù)theAtlasofGeneticsandCytogeneticsinOncologyandHaematology(http://atlasgeneticsoncology.org)可替代的名稱為ACC-4,ACC-5、CPSB,DKFZp686B24257、EC3.4.22.16、MGC1519、aleurain、小鏈(minichain))是一種溶酶體蛋白酶。人組織蛋白酶H的基因座在染色體15q24_125上(參見例如AtlasofGeneticsandCytogeneticsinOncologyandHaematology)。該基因包含跨越超過23kb基因組序列的12個外顯子。人前組織蛋白酶原H(preprocathepsinH)的核苷酸序列為例如由Fuchs和Gassen,1989,NucleicAcidsRes.17:9471-9471公布的。大鼠組織蛋白酶H的基因結(jié)構(gòu)為例如由Ishidoh等，F(xiàn)EBSLetters，1989，第253卷，number1，2，103-107公布。人15號染色體上CTSH的基因組序列可例如在NCBI主頁以登錄號NG_009614.I(SEQIDNO.I)而檢索到。組織蛋白酶H的基因具有TATA和CAAT-Iess啟動子以及位于第一個外顯子上游的一個GC框。兩種不同形式的組織蛋白酶HcDNA已在前列腺組織和癌細胞系檢測到全長形式(CTSH)以及在信號肽區(qū)域具有12個氨基酸缺失的截短形式(CTSHδ10-21)(參見AtlasofGeneticsandCytogeneticsinOncologyandHaematology)。前酶原轉(zhuǎn)錄物的長度為1005bp。組織蛋白酶H的編碼多核苷酸序列可公開地從NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫以若干登錄號獲得，例如:BC006878(CTSH，完整編碼序列，小鼠，SEQIDNO.4,NM_004390.3(ACTSH轉(zhuǎn)錄物變體ImRNA(SEQIDNO.2)，NM_148979.2(人CTSH，轉(zhuǎn)錄物變體2mRNA(SEQIDNO.3))。技術(shù)人員知道如何從NCBI數(shù)據(jù)庫檢索組織蛋白酶H的進一步的編碼或基因組序列(其它物種的組織蛋白酶H;組織蛋白酶H的突變體或不同同工型，若存在)。若下文中提及組織蛋白酶H編碼序列，這可指上述mRNA或編碼序列的任一種；其中SEQID.NO.2、3和4的序列為優(yōu)選的實例。組織蛋白酶H的蛋白質(zhì)序列可公開地從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，例如以如下登錄號獲得人(hs)組織蛋白酶H同工型前蛋白原NP_004381(SEQIDNo.8)；hs同工型b前體NP:683880(SEQIDNO.9);鼠(小鼠)組織蛋白酶H:前蛋白原NP_031827;小鼠同工型CRA_a:EDL20900，小鼠同工型CRA_b:EDL20901，大鼠(褐家鼠(rattusnorvegicus))組織蛋白酶H:NP_037071;組織蛋白酶H同工型CRA_a(褐家鼠)EDL77562，組織蛋白酶H同工型CRA-b(褐家鼠)EDL77563，組織蛋白酶H，此外，蛋白質(zhì)序列可公開地從UniProtKB數(shù)據(jù)庫(www.beta,uniprot.ογη)以如下登錄號獲得P09668(HUMAN_CATH,人組織蛋白酶H,SEQIDNO.5)。如在下文中提及組織蛋白酶H蛋白或氨基酸序列，這可指上述蛋白質(zhì)序列或由上述列舉的編碼序列翻譯的蛋白質(zhì)序列中的任一種；例如以下序列SEQIDNO5、6、7、8或9。NCBI是美國國立生物技術(shù)信息中心(郵寄地址NationalCentreforBiotechnologyInformation,NationalLibraryofMedicine,Building38A,Bethesda,MD20894,USA;網(wǎng)址www.ncbi.nhm.nih.rov)。更多序列(例如具有SwissProt或EMBL登錄號的序列)可在WWW.beta,uniprot.org的UniProtKB數(shù)據(jù)庫中檢索到。組織蛋白酶H是一種具有氨肽酶和較弱內(nèi)肽酶功能的溶酶體蛋白酶。其屬于Cl(木瓜蛋白酶-樣)半胱氨酸蛋白酶(Cl(papain-like)cysteinproteases)家族。組織蛋白酶H蛋白作為335個氨基酸的前酶原合成并且蛋白水解加工成內(nèi)體或溶酶體內(nèi)的活性單鏈。除重鏈和輕鏈(一起命名為長鏈)之外，組織蛋白酶H還包含所謂的來源于前肽的小鏈“EPQNCSAT”。(關(guān)于組織蛋白酶H的結(jié)構(gòu)，也可參見Turk等·，BiologicalChemistry,1997)。小鏈似乎參與組織蛋白酶H的氨肽酶活性并且在底物識別中起關(guān)鍵作用。缺乏小鏈的人組織蛋白酶H的重組形式顯示為內(nèi)肽酶(Valiljeva等，2003)。組織蛋白酶H的內(nèi)妝酶底物為例如Bz-Arg+NHNap、Bz-Arg+NH-Mec、Bz-Phe-Val_Arg+NHMec。其對于Pro-Gly+Phe和Pro-Arg+NHNap的底物具有二肽基肽酶活性。其對于以下底物具有氨肽酶活性H-Arg-NH-Mec、Bz-Arg-NH-Mec、Bz-Arg-NH-Mec和H-Cit-NH-Mec(參見例如Rothe和Dodt,1992；Bz=苯甲?；?NH-Mec=e_甲基香豆素基_7_酰胺；Cit=瓜氨酸)。天然存在的組織蛋白酶H抑制劑為半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)、α2_巨球蛋白以及來自小鼠細胞毒淋巴細胞CTLA_2i3的抗原。組織蛋白酶H遍在表達并且在腎中表達水平最高。在一些癌組織中其表達可增力口。組織蛋白酶主要位于內(nèi)體-溶酶體區(qū)室，但也一定程度地分泌并且在血液中循環(huán)。組織蛋白酶H的功能通常包括蛋白酶活性例如水解酶活性,肽酶活性例如氨肽酶、二肽基肽酶、外肽酶或內(nèi)肽酶活性，轉(zhuǎn)酰酶活性(參見Koga等，1991);裂解上述列舉的底物；裂解天然C5并且產(chǎn)生趨化因子C5a，加工疏水性表面活性劑-相關(guān)蛋白C，裂解和/或降解纖連蛋白和纖維蛋白原。更具體而言，其作為溶酶體半胱氨酸蛋白酶參與細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解。其通過裂解天然C5而參與趨化因子C5a的產(chǎn)生。組織蛋白酶H參與疏水性表面活性劑-相關(guān)蛋白C的加工。此外，其似乎還參與不穩(wěn)定動脈粥樣斑塊的發(fā)展，以及還可能參與早期動脈粥樣硬化生成。本發(fā)明的用途使得能夠鑒定用于預防和/或治療疼痛并且特別是神經(jīng)性疼痛的新物質(zhì)。本發(fā)明的用途包括鑒定具有所需特性(即降低疼痛感)的化合物以及鑒定具有不合乎需要特性(即增加疼痛感)的化合物。此外，本發(fā)明使得能夠進一步表征已鑒定的可用于預防和/或治療任何疾病或疾病狀態(tài)的化合物。在此情況下，本發(fā)明可例如用于排除經(jīng)鑒定具有非所需副作用(即增加疼痛感)的活性化合物可例如針對它們對組織蛋白酶H的影響(蛋白質(zhì)和/或核酸，表達和/或功能等)來表征(profile)給定疾病的候選化合物。用于本發(fā)明不同方面的化合物/測試化合物/活性化合物可為任何生物或化學物質(zhì)或天然產(chǎn)品提取物，它們可通過生化或分子生物學方法來純化、部分純化、合成或制備。在本發(fā)明不同方面的意義上認為有效調(diào)節(jié)疼痛的化合物可為對以下方面有影響的任何物質(zhì)組織蛋白酶H的功能之一或細胞中組織蛋白酶H的量(蛋白質(zhì)或核酸)，對組織蛋白酶H的表達、翻譯后修飾(例如N-糖基化或加工(例如裂解)、蛋白質(zhì)折疊或活化。為此，所述物質(zhì)可調(diào)節(jié)組織蛋白酶H的任何功能(例如上文或下文列舉的那些)。組織蛋白酶H的蛋白質(zhì)活性可通過物質(zhì)來調(diào)節(jié)，例如通過直接相互作用以及干擾組織蛋白酶H多肽/蛋白質(zhì)或其片段來調(diào)節(jié)。所述物質(zhì)還可調(diào)節(jié)組織蛋白酶H的表達，例如在轉(zhuǎn)錄(起始、延伸、加工等)、轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定性、翻譯水平上來調(diào)節(jié)。此外，其還可調(diào)節(jié)組織蛋白酶H的翻譯后修飾、從無活性到活性形式的加工(將前原形式(pr印ro-form)裂解為活性蛋白質(zhì))、以及蛋白質(zhì)折疊等。所述物質(zhì)可直接或間接施加上述作用(間接地意即通過干擾(正向或負向)對組織蛋白酶H功能/蛋白質(zhì)活性/表達等有影響的天然信號轉(zhuǎn)導級聯(lián))。組織蛋白酶H的功能包括上文列舉的那些，例如蛋白酶活性；從一種或多種蛋白質(zhì)底物的氨基端除去二肽的能力；與一種或多種蛋白質(zhì)底物特異性相互作用的能力(蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用)，例如上文列舉的那些；裂解和/或活化一種或多種蛋白質(zhì)底物的能力，例如上文列舉的那些；加工蛋白質(zhì)或肽底物的能力，例如上文列舉的那些；被上文列舉的抑制劑之一抑制的能力。組織蛋白酶H的功能通常還包括組織蛋白酶H蛋白或核酸或其片段與其它分子(包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、核酸、合成分子)相互作用的能力，并且優(yōu)選涉及其相互作用于及裂解蛋白質(zhì)底物的能力。根據(jù)本申請，酶底物理解為可由酶修飾的任何分子。本發(fā)明范圍內(nèi)天然存在的底物為對應于其在天然生理學或病理學環(huán)境(例如上文列舉的那些)中存在的形式并且亦能被相應的酶修飾的分子。對疼痛特別是神經(jīng)性疼痛的調(diào)節(jié)可為降低或升高。根據(jù)本相關(guān)發(fā)明組的一個方面，可使用組織蛋白酶H的片段或衍生物。片段可為蛋白質(zhì)、多肽或多核酸片段。蛋白質(zhì)或多肽的片段是當與組織蛋白酶H的全長實例相比時，攜帶一個或多個末端(η-和/或C-末端)和/或一個、兩個或多個內(nèi)部氨基酸缺失的蛋白質(zhì)或多肽，片段包括，例如如圖7的描述中列舉的結(jié)構(gòu)域和/或片段(參見下文)。組織蛋白酶H蛋白的功能片段為具有至少一種或多種全長蛋白功能特性(特別是上文列舉的特性)的該蛋白的任何片段。多核苷酸片段是當與全長基因組或編碼序列相比時，攜帶一個或多個末端(5，-和/或3’-末端)和/或一個、兩個或更多個內(nèi)部核苷酸缺失的多核苷酸或寡核苷酸。組織蛋白酶H核酸的功能片段為具有至少一種或多種全長多核酸(mRNA、基因組或編碼序列)功能特性的任何片段。術(shù)語組織蛋白酶H衍生物包括，與天然存在的形式相比，特別是與SEQIDNO:5、6、7、8或9的組織蛋白酶H比較，組織蛋白酶H的除缺失外的任何修飾類型。組織蛋白酶H的功能衍生物為具有至少一種并優(yōu)選兩種或更多種未修飾的蛋白的功能特性的該蛋白的任何衍生物。衍生物包括例如氨基酸或核苷酸序列的修飾或任何其它種類的修飾，例如導致例如使多肽或多核苷酸穩(wěn)定的化學或生物學修飾(例如核酸骨架的硫代磷酸修飾或氨基酸之間鍵的交換等)，或使多肽或多核苷酸能特異性靶向某些細胞或促使其進入細胞或被細胞攝取的修飾(例如細胞滲透磷酸肽，鄰位偶聯(lián)(orthocoupling)到細胞滲透肽載體，例如基于觸角(antennapedia)/滲透,基于TAT和信號-肽的序列；或偶聯(lián)到針對特定轉(zhuǎn)運蛋白或輸入物(importer)的配體部分)。本發(fā)明另一方面涉及異源表達組織蛋白酶H或其功能片段的非人轉(zhuǎn)基因動物用于鑒定或分析調(diào)節(jié)疼痛并且特別是神經(jīng)性疼痛的化合物的用途。非人動物可為任何非人動物。優(yōu)選嚙齒類，例如大鼠或小鼠。轉(zhuǎn)基因動物為在其基因組中攜帶特意轉(zhuǎn)入其中的外源DNA的動物?？砂凑諛藴食绦?qū)⑼庠碊NA引入動物基因組(參見例如TransgenicAnimalTechnologyALaboratoryHandboook.C.A.Pinkert編輯；AcademicPressInc.,SanDiego,California,1994(ISBN0125571658)。術(shù)語異源表達是指不同于在宿主生物體中正常基因表達的表達(涉及表達的基因的穩(wěn)態(tài)水平、量、時機或組織分布，或涉及表達的基因類型(即所述基因通常完全不在該宿主中表達))。異源表達可為組成型或誘導型的。本領(lǐng)域熟知合適的誘導型表達系統(tǒng)(例如四環(huán)素誘導型系統(tǒng)等)。生物體可為細胞或非人動物。依據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及異源表達組織蛋白酶H或其功能片段的非-人轉(zhuǎn)基因動物作為用于增強疼痛敏感性，特別為神經(jīng)性疼痛敏感性的模型系統(tǒng)的用途。本發(fā)明的又一方面涉及非-人組織蛋白酶H敲除動物用于鑒定或分析調(diào)節(jié)疼痛并且特別為神經(jīng)性疼痛的化合物的用途。敲除生物體(例如動物或細胞)是指其中基因的表達或功能部分或全部缺失的生物體，包括基因組敲除以及功能敲除、誘導型敲除以及組成型敲除。本領(lǐng)域熟知敲除生物體的產(chǎn)生以及可用于產(chǎn)生敲除生物體的細胞或動物。組織蛋白酶H-敲除小鼠的產(chǎn)生描述于Pham和Ley,1999中。本發(fā)明再一方面涉及非人組織蛋白酶H敲除動物作為用于降低疼痛并且特別是降低神經(jīng)性疼痛敏感性的模型系統(tǒng)的用途。異源表達組織蛋白酶H或其功能片段的細胞用于鑒定調(diào)節(jié)疼痛，特別是神經(jīng)性疼痛的化合物的用途是本發(fā)明的另一方面。細胞可為任何原核或真核細胞，例如能夠用核酸載體轉(zhuǎn)染并表達報告基因的細胞。它們包括大體上的原代細胞和來自細胞培養(yǎng)物的細胞，例如真核細胞培養(yǎng)物，其包括來源于多細胞生物體和組織的細胞(例如HeLA、CHO、COS、SF9或3T3細胞)或單細胞生物體例如酵母(例如裂殖酵母(s.pombe)或釀酒酵母(s.cerevisiae))的細胞；或原核細胞培養(yǎng)物，優(yōu)選畢赤酵母(Pichia)或大腸桿菌(E.coli)?？赏ㄟ^熟知技術(shù)(例如取血技術(shù)、組織穿刺技術(shù)或手術(shù)技術(shù))獲得來源于組織的細胞和樣品。根據(jù)一個實施方案，使用與其未修飾狀態(tài)相比具有較低組織蛋白酶H活性的修飾細胞。這樣，若待測化合物能夠增強或恢復已降低的或完全廢除的組織蛋白酶H活性，則例如可以對其進行試驗?；蛘撸谔弁疵舾行越档偷那闆r下，不論所述物質(zhì)是否能執(zhí)行其功能(例如疼痛調(diào)節(jié)或甚至是在另一疾病狀態(tài)或疾病的情況中的功能)，都可對其進行試驗。修飾可為任何類型的修飾(穩(wěn)定或瞬時，優(yōu)選穩(wěn)定)，所述修飾導致降低組織蛋白酶H的活性、組織蛋白酶H轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)態(tài)水平(即通過激活組織蛋白酶H轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定性)或組織蛋白酶H蛋白穩(wěn)態(tài)水平(即通過激活組織蛋白酶H翻譯或其翻譯后加工；通過調(diào)節(jié)組織蛋白酶H翻譯后修飾或通過激活其穩(wěn)定或通過抑制其降解)。這可例如通過以下技術(shù)來實現(xiàn)使用組織蛋白酶H的顯性負突變體(dominantnegativemutant)、反義寡核苷酸、組織蛋白酶H的RNAi構(gòu)建體，產(chǎn)生功能或基因組組織蛋白酶H敲除(其可例如為誘導型)或本領(lǐng)域已知的其它合適技術(shù)。對于以上技術(shù)的綜述，參見例如CurrentprotocolsinMolecularbiology(2000)J.G.Seidman,第23章，附錄52,JohnWiley和Sons,Inc.；GeneTargetingapracticalapproach(1995),編輯A.L.Joyner,IRLPress；GeneticManipulationofReceptorExpressionandFunction,2000；AntisenseTherapeutics,1996；Scherr等，2003。按照一個實施方案，使用組織蛋白酶H敲除細胞。本領(lǐng)域熟知用于產(chǎn)生敲除的合適細胞系，參見例如CurrentprotocolsinMolecularBiology(2000)J.G.Seidman,第23章，附錄52,JohnWiley和Sons,Inc;或GeneTargetingapracticalapproach.(1995)編輯A.L.Joyner，IRLPress。Pham和Ley，1999(DPPI鼠胚胎干細胞敲除克隆的產(chǎn)生，參見第8628頁，左欄，上半部)亦公開了組織蛋白酶H(DPPI)敲除細胞的產(chǎn)生。因此，本發(fā)明的另一方面涉及組織蛋白酶敲除細胞用于鑒定或分析調(diào)節(jié)疼痛，特別是神經(jīng)性疼痛的化合物的用途。此外，組織蛋白酶敲除細胞作為用于降低疼痛，特別是神經(jīng)性疼痛敏感性的模型系統(tǒng)的用途是本相關(guān)發(fā)明組的另一方面。按照本發(fā)明另一實施方案，與參考細胞(例如處于其未修飾狀態(tài)的同樣的細胞)相比，所述細胞可具有更高量的組織蛋白酶H。該細胞系統(tǒng)可用于模擬疼痛敏感性增強的狀態(tài)，這是因為組織蛋白酶H的表達量與疼痛敏感性相關(guān)。因此，本發(fā)明還涉及異源表達組織蛋白酶H或其功能片段的細胞作為用于增強疼痛敏感性，特別是神經(jīng)性疼痛敏感性的模型系統(tǒng)的用途。異源表達與組織蛋白酶H啟動子和/或增強子表達上連接的報告基因的細胞用于鑒定或分析調(diào)節(jié)疼痛，特別是神經(jīng)性疼痛的化合物的用途是本相關(guān)發(fā)明組的另一實施方案。本發(fā)明以上方面基于本領(lǐng)域通常已知的典型報告基因測定。為此，將選擇的啟動子插入適于所選宿主細胞類型的表達載體中，所述啟動子位于所選報告基因上游，這樣，啟動子若有活性則使報告基因表達。隨后將構(gòu)建體引入到所選宿主細胞中。本領(lǐng)域熟知合適的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染方法以及用于細胞培養(yǎng)和報告基因表達檢測的條件(參見例如以下所列標準文獻)。本領(lǐng)域熟知合適的條件以及載體、報告基因和必要試劑(其也可市售)。載體為環(huán)狀或線性多核苷酸分子，例如DNA質(zhì)粒、噬菌體或粘粒，多核苷酸片段(例如從其它載體切下或通過PCR擴增并插入到克隆載體中的多核苷酸片段)借助其可在合適的細胞或生物體中特異性擴增。表達載體使得在宿主細胞或生物體中能夠異源表達目的基因(例如報告基因)。細胞或生物體類型主要取決于目的并且對其選擇是在技術(shù)人員知識范圍內(nèi)。用于擴增核酸的合適的生物體例如主要是具有高繁殖率的單細胞生物體，例如細菌或酵母。合適的生物體亦可為從多細胞組織分離和培養(yǎng)的細胞，例如從各種各樣生物體產(chǎn)生的細胞系(例如來自草地貪夜蛾(SpodopteraFrugiperda)的SF9細胞等)。合適的克隆載體為本領(lǐng)域所知并且其購自不同的生物技術(shù)供應商，例如RocheDiagnostics、NewEnglandBiolabs、Promega、Stratagene及其它更多。合適的細胞系例如購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。為異源表達蛋白質(zhì)或多肽，細胞可為能夠用核酸載體轉(zhuǎn)染并表達目的基因(例如報告基因)的任何原核或真核細胞。這些細胞包括大體上的原代細胞和來自細胞培養(yǎng)物的細胞，優(yōu)選真核細胞培養(yǎng)物，其包括來源于多細胞生物體和組織的細胞(例如HEK293、RIN-5F、HeLA、CH0、C0S、SF9或3T3細胞)或單細胞生物體例如酵母(例如裂殖酵母或釀酒酵母)的細胞；或原核細胞培養(yǎng)物，優(yōu)選畢赤酵母或大腸桿菌?？赏ㄟ^熟知技術(shù)(例如取血技術(shù)、組織穿刺技術(shù)或手術(shù)技術(shù))獲得來源于組織的細胞和樣品。在本申請情況中，術(shù)語“轉(zhuǎn)染”是指將核酸載體引入到宿主細胞(原核或真核)中，因此包括術(shù)語“轉(zhuǎn)化”。轉(zhuǎn)染可為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或瞬時轉(zhuǎn)染。組織蛋白酶H啟動子是組織蛋白酶H基因的部分，若將其引入合適的表達載體中且位于基因產(chǎn)物的編碼序列的上游，其能夠驅(qū)動目的基因產(chǎn)物表達。組織蛋白酶H啟動子是組織蛋白酶H基因5’-序列的基因組上游的部分，其操縱下游已轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄激活并且例如可獲自Ishidoh等·，F(xiàn)EBSletters,1989orIshidoh等，Biomed.Biochim.Acta,1991,50(4):541-7ο報告基因可為使得容易定量其基因產(chǎn)物的任何基因。各種各樣用于真核或原核宿主的報告基因以及檢測方法和必要試劑為本領(lǐng)域所知并可市售。這些報告基因包括例如β內(nèi)酰胺酶(IacZ)、螢光素酶、綠色或藍色熒光蛋白(GFP或BFP)、DsRed、HIS3、URA3、TRPl或LEU2或β-半乳糖苷酶等的基因。這些基因編碼可借助可見(顏色或發(fā)光)反應容易檢測到的蛋白質(zhì)(例如lacZ、螢光素酶)。它們包括可借助可見(顏色或發(fā)光)反應或表達時賦予對抗生素例如氨節(jié)青霉素(Ampicillin)或卡那霉素(Kanamycin)抗性的基因產(chǎn)物容易檢測到的基因產(chǎn)物。其它報告基因產(chǎn)物使得表達細胞能在某些條件下生長，例如營養(yǎng)缺陷型基因。報告基因的功能片段是使得容易定量其基因產(chǎn)物的給定報告基因的任何片段。報告基因的功能片段是使得容易定量其基因產(chǎn)物的給定報告基因的任何片段。在本申請情況中，術(shù)語“轉(zhuǎn)染”是指將核酸載體引入到宿主細胞(原核或真核)中，因此包括術(shù)語“轉(zhuǎn)化”。轉(zhuǎn)染可為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或瞬時轉(zhuǎn)染。細胞可為能夠用核酸載體轉(zhuǎn)染并表達報告基因的任何原核或真核細胞。這些細胞包括大體上的原代細胞和來自細胞培養(yǎng)物的細胞，優(yōu)選真核細胞培養(yǎng)物，其包含來源于多細胞生物體和組織的細胞(例如HeLA、CHO、COS、SF9或3T3細胞)或單細胞生物體例如酵母(例如裂殖酵母或釀酒酵母)的細胞；或原核細胞培養(yǎng)物，優(yōu)選畢赤酵母或大腸桿菌?？赏ㄟ^熟知技術(shù)(例如取血技術(shù)、組織穿刺技術(shù)或手術(shù)技術(shù))獲得來源于組織的細胞和樣品。在本發(fā)明以上方面的情況中，對照載體可為包含報告基因或其功能片段的任何合適載體，但其中報告基因的表達不是由(功能性)組織蛋白酶H啟動子驅(qū)動。這可例如意味著報告基因或其功能片段沒有可操作地連接至功能性組織蛋白酶H啟動子(即完全缺乏組織蛋白酶H啟動子，包括無功能的組織蛋白酶H啟動子或啟動子片段或其中啟動子和報告基因的連接不是功能性的)。另一可能性是報告基因或其功能片段可操作地連接至除組織蛋白酶H啟動子之外的另一啟動子(例如SV40或另一標準啟動子)。還可將功能載體和對照載體轉(zhuǎn)染到同一細胞中，但此情況下報告基因需要有差異?？衫绨凑障率龌虮绢I(lǐng)域已知測定來進行符合以上用途的化合物的鑒定。測定是監(jiān)測生物學過程的任何類型的分析方法或系統(tǒng)。適宜地，在細胞或生化(體外)系統(tǒng)中重現(xiàn)代表生理代謝途徑部分以及病理病況部分的分子級聯(lián)和機制。因此，可根據(jù)其干擾或調(diào)節(jié)這些級聯(lián)或機制的能力來測定潛在藥物化合物的藥理學活性。對于在藥物篩選，特別是新型藥物化合物的高通量篩選中的應用，所述測定必須可重復，并還優(yōu)選可升級(scable)且可靠。在本發(fā)明范圍內(nèi)，高通量篩選意指本發(fā)明方法用含幾毫升甚至幾納升或甚至更少的極小體積的樣品以極小規(guī)模地例如在96、386或1536孔板上實施。因此，在短時間內(nèi)可分析極大量的樣品。高通量篩選主要包括借助單個測定對大約500.000種不同化合物就某種能力進行篩選。所述測定優(yōu)選適用于針對調(diào)節(jié)研究中的靶分子的活性的能力來高通量篩選化學物質(zhì)。測定類型取決于例如所用靶分子的類型(例如多肽或多核苷酸)以及測定該靶分子活性所依據(jù)的“讀出”即參數(shù)(參見下文)。不同類型的所述測定通常為本領(lǐng)域所知并且可購自供應商。用于不同目的的合適測定包括放射性同位素或熒光測定，例如熒光偏振測定(例如由Panvera提供的市售測定)，或用于測量標記成員與非標記成員的相互作用(例如標記的蛋白質(zhì)與其未標記蛋白質(zhì)-配體的相互作用)的PackardBioScience(HTRF；ALPHAScreen)。更多實例包括基于細胞的測定，其中細胞系穩(wěn)定(誘導型或非誘導型；染色體的或附加型)或瞬時表達重組目的蛋白。這些測定包括例如報告基因測定，其中根據(jù)報告酶的活性來測量對某些啟動子或信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)成員的信號轉(zhuǎn)導途徑的調(diào)節(jié)，所述報告酶的表達在所述某些啟動子的調(diào)控之下。對于此類型的測定，重組細胞系需構(gòu)建成含有受限定的啟動子調(diào)控的報告基因，所述啟動子本身將被研究或受研究中的信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)調(diào)控。合適的報告酶通常為本領(lǐng)域所知，其包括螢火蟲螢光素酶、海腎(renilla)螢光素酶(例如由Packardreagents市售)、β-半乳糖苷酶。合適的細胞系視測定目的而定,但通常包括易于轉(zhuǎn)染和易于培養(yǎng)的細胞系，例如HeLA、COS、CH0、NIH-3T3等。為測定蛋白酶活性，已知典型的蛋白酶測定方式例如用在底物的某一位置攜帶報告標簽(例如發(fā)射冷光/熒光或其它信號的蛋白質(zhì)/肽或?qū)嶓w)和在另一位置攜帶猝滅劑(實體(例如抑制報告標簽信號發(fā)射的另一種肽，只要底物是完整/未裂解的即可))的底物；將底物與組織蛋白酶H在合適條件下孵育，以使底物裂解，從而導致可檢測信號(例如光發(fā)射)因為猝滅劑與報告標簽的分離而發(fā)射。本領(lǐng)域熟知其它類型的測定和其它類型的“讀出”。用于檢測細胞中組織蛋白酶H活性的一種測定可例如從Rilttger等，BioTechniques,2006獲得。本發(fā)明測定涉及例如鑒定或分析調(diào)節(jié)和/或預防疼痛優(yōu)選神經(jīng)性疼痛的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a.提供至少兩份樣品；b.將含有組織蛋白酶H或其功能片段或衍生物的一份樣品與化合物接觸，c.在化合物存在下，測定組織蛋白酶H的活性，d.在化合物不存在下，測定組織蛋白酶H的活性，和e.比較c)與d)中的組織蛋白酶H的活性。用于鑒定或分析調(diào)節(jié)和/或預防疼痛優(yōu)選神經(jīng)性疼痛的化合物的方法，所述方法包括a.將組織蛋白酶H蛋白或其功能片段或衍生物與測試化合物接觸；和b.測定所述測試化合物是否調(diào)節(jié)組織蛋白酶H蛋白或其功能片段或衍生物的活性。用于鑒定或分析調(diào)節(jié)和/或預防疼痛優(yōu)選神經(jīng)性疼痛的化合物的方法，所述方法包括a.將具有可檢測量或活性的組織蛋白酶H或其功能片段或衍生物的細胞與測試化合物接觸；b.測定所述測試化合物是否能夠調(diào)節(jié)細胞中存在的組織蛋白酶H或其功能片段或衍生物的量或活性。用于鑒定或分析調(diào)節(jié)和/或預防疼痛優(yōu)選神經(jīng)性疼痛的化合物的方法，所述方法包括a.在轉(zhuǎn)錄活性系統(tǒng)中將編碼組織蛋白酶H蛋白或其功能片段或衍生物的核酸與測試化合物接觸；和b.測定在所述化合物存在下在所述系統(tǒng)中存在的編碼組織蛋白酶H蛋白或其功能片段或衍生物的mRNA的量；和c.測定所述化合物是否能夠調(diào)節(jié)所述系統(tǒng)中存在的編碼組織蛋白酶H蛋白或功能片段或衍生物的mRNA的量。轉(zhuǎn)錄活性系統(tǒng)為至少具有進行轉(zhuǎn)錄單元的轉(zhuǎn)錄反應能力的任何生化或細胞系統(tǒng)。此類系統(tǒng)為本領(lǐng)域熟知并且包括市售細胞以及體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)或試劑盒(例如基于細胞提取物)。用于鑒定或分析調(diào)節(jié)和/或預防疼痛優(yōu)選神經(jīng)性疼痛的化合物的方法，所述方法包括a.提供用包含可操作地連接到報告基因或其功能片段的組織蛋白酶H基因或其功能片段的啟動子的核酸載體轉(zhuǎn)染的細胞；b.提供用包含沒有可操作地連接到功能性組織蛋白酶H啟動子的報告基因或其功能片段的對照載體轉(zhuǎn)染的細胞；c.測定在測試化合物存在下a)的細胞和b)的細胞的報告基因活性；d.測定在測試化合物不存在下a)的細胞和b)的細胞的報告基因活性。用于鑒定或分析調(diào)節(jié)疼痛優(yōu)選神經(jīng)性疼痛的化合物的方法，所述方法包括a.選擇調(diào)節(jié)組織蛋白酶H活性的化合物作為測試化合物；和b.將所述測試化合物給予感覺疼痛的受試者，以測定疼痛是否被調(diào)節(jié)。鑒定或分析調(diào)節(jié)和/或預防受試者疼痛優(yōu)選神經(jīng)性疼痛的化合物的方法，所述方法包括c.測定在一種或多種測試化合物存在下組織蛋白酶H或其功能片段或衍生物的生物學活性，以鑒定一種或多種調(diào)節(jié)組織蛋白酶H生物學活性的調(diào)節(jié)化合物；和d.測試一種或多種調(diào)節(jié)化合物降低受試者疼痛(特別是神經(jīng)性疼痛)和/或疼痛感覺(特別是神經(jīng)性疼痛感覺)和/或疼痛敏感性(特別是神經(jīng)性疼痛敏感性)的能力。本發(fā)明另外方面涉及用于給患者群分類并協(xié)助醫(yī)生調(diào)整/改進其對個體患者的治療的藥物基因組學方法，例如用于分析個體疼痛(特別是神經(jīng)性疼痛)閾的方法，所述方法包括分析與一種或多種參考樣品相比所取的所述個體樣品中的組織蛋白酶H的量，以確定所述樣品中存在的組織蛋白酶HmRNA和/或蛋白質(zhì)的量是否不同于一種或多種參考樣品的組織蛋白酶HmRNA和/或蛋白質(zhì)的量，其中存在較高的量則表明所述個體的疼痛(特別是神經(jīng)性疼痛)敏感性增加，而存在較低的量則表明所述個體的疼痛(特別是神經(jīng)性疼痛)敏感性降低。用于調(diào)整預防和/或治療個體疼痛的藥物劑量的方法，所述方法包括檢查所取的個體樣品，以確定所述樣品中存在的組織蛋白酶HmRNA和/或蛋白質(zhì)的量是否不同于一種或多種參考樣品的組織蛋白酶HmRNA和/或蛋白質(zhì)的量，所述劑量根據(jù)所取個體樣品中蛋白質(zhì)和/或mRNA的量是否不同于一種或多種參考樣品中蛋白質(zhì)和/或mRNA的量來調(diào)整，其中在所取個體樣品中組織蛋白酶H的量較高表明需要較高劑量，而在個體樣品中組織蛋白酶H的量較低則表明需要較低劑量。本文使用的術(shù)語“所取樣品”是指取自/分離自一個或多個個體(人或非人動物)的身體的生物樣品。生物學材料和生物樣品包括例如細胞、組織或器官的制備物或部分(例如腦、血液、肝、脾、腎、心臟、血管等)，優(yōu)選來源于脊椎動物，并且更優(yōu)選來源于哺乳動物(包括人)。還包括來自細胞培養(yǎng)物的細胞，優(yōu)選真核細胞培養(yǎng)物，其包括來源于多細胞生物體和組織的細胞(例如HeLA、CHO、COS、SF9或3T3細胞)或單細胞生物體例如酵母(例如裂殖酵母或釀酒酵母)的細胞；或原核細胞培養(yǎng)物，優(yōu)選畢赤酵母或大腸桿菌?？赏ㄟ^熟知技術(shù)(例如取血技術(shù)、組織穿刺技術(shù)或手術(shù)技術(shù))獲得來源于組織的細胞和樣品。重組分子的制備和來自細胞或組織的天然存在的分子的純化以及細胞或組織提取物的制備為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(亦參見例如下文列舉的標準文獻)。術(shù)語“參考樣品”是指取自具有已知給定疼痛表型的一個或多個個體的生物樣品，或指體外生物樣品(例如來源于體外細胞或組織培養(yǎng)物的樣品(例如培養(yǎng)的細胞))，并且其在某些特性(例如其組織蛋白酶H活性、量或表達的水平)上對應于給定疼痛表型(例如高疼痛敏感性或低疼痛敏感性)。本發(fā)明又一方面涉及用于檢測組織蛋白酶H的工具(means)在用于通過分析取自待檢個體身體的生物樣品來測定個體中增強的疼痛敏感性(特別是神經(jīng)性疼痛敏感性)中的用途。用于檢測組織蛋白酶H的工具可為能夠特異性檢測生物樣品中存在的組織蛋白酶H多肽/蛋白質(zhì)或核酸的任何工具。檢測組織蛋白酶H蛋白或多肽的工具可為能特異性檢測野生型組織蛋白酶H蛋白/多肽的任何工具，并且還可為特異性檢測具有與野生型多肽/蛋白質(zhì)相比一個或多個關(guān)于大小或氨基酸序列的突變的組織蛋白酶H蛋白/多肽的工具。此類工具的優(yōu)選實例為能夠特異性檢測組織蛋白酶H蛋白的抗體，例如用于免疫組織學或免疫組織化學技術(shù)(例如檢測組織學組織切片中組織蛋白酶H蛋白或其某些突變或固定在合適載體例如膜、芯片、ELISA板等上的組織蛋白酶H蛋白)。檢測組織蛋白酶H核酸的工具可例如為檢測組織蛋白酶HmRNA/cDNA或基因組DNA(野生型或還具有與野生型組織蛋白酶H核酸相比關(guān)于其長度或其核酸序列的一個或多個突變)的工具。所述工具可例如為特異性檢測和/或定量組織蛋白酶HmRNA的工具，并優(yōu)選包括或為特異性組織蛋白酶H核酸探針或引物組，所述核酸探針或引物組能夠擴增組織蛋白酶HDNA，或例如用于PCR測序(用于檢測核苷酸序列中的突變)，或能夠擴增組織蛋白酶HcDNA,例如用于RTPCR(用于檢測和/或定量組織蛋白酶HmRNA的表達)。另一工具可例如為能夠在標準條件下與組織蛋白酶HmRNA或cDNA特異性雜交的核酸探針，例如用于RNA印跡或芯片雜交技術(shù)。術(shù)語野生型是指在自然界或在給定生物體的標準實驗室原種中存在的基因型或表型。根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，組織蛋白酶H的野生型序列為SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8和/或9的序列。本領(lǐng)域熟知合適引物的設(shè)計和合成(亦參見上文)。用于檢測組織蛋白酶H的引物組可例如為以下引物組第I組(用于檢測人CTSH轉(zhuǎn)錄物變體I的產(chǎn)物長度=154個核苷酸，用于檢測人CTSH轉(zhuǎn)錄物變體2的產(chǎn)物長度=118個核苷酸):正向引物5’-GCGCTCCCAGTTGACGCTCT-3’(SEQIDNO.10)反向引物5’-CACGCACAGTTCGGCGGC-3，(SEQIDNO.11)第2組(用于檢測人CTSH轉(zhuǎn)錄物變體I的產(chǎn)物長度=153個核苷酸，用于檢測人CTSH轉(zhuǎn)錄物變體2的產(chǎn)物長度=117個核苷酸):正向引物5’-CGCTCCCAGTTGACGCTCTGG-3’(SEQIDNO.12)反向引物5’-CACGCACAGTTCGGCGGC-3，(SEQIDNO.13)。根據(jù)本發(fā)明一個實施方案，所述工具為用于擴增組織蛋白酶H核酸的引物組，并且優(yōu)選包含SEQIDNo.10、11(共為第I組)、12和/或13(共為第2組)的引物中至少之一的引物組。根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案，所述工具為用于檢測組織蛋白酶H核酸的探針。本領(lǐng)域熟知合適探針的設(shè)計和合成(亦參見下文標準文獻)。根據(jù)本發(fā)明又一優(yōu)選實施方案，所述工具為用于特異性檢測組織蛋白酶H蛋白或多肽的抗體。本領(lǐng)域熟知合適的抗體或其功能片段的制備，例如通過在適當情況下在例如弗氏佐劑和/或氫氧化鋁凝膠存在下用組織蛋白酶H蛋白或其片段來免疫哺乳動物例如兔(參見例如Diamond,B.A.等(1981)TheNewEnglandJournalofMedicine:1344-1349)?？呻S后用熟知方法(例如借助柱色譜來純化)自血液分離由于免疫反應而在動物中形成的多克隆抗體?？衫绨凑誛inter&Milstein(Winter,G.&Milstein,C.(1991)Nature,349,293-299)的已知方法制備單克隆抗體。本領(lǐng)域也熟知產(chǎn)生單克隆抗體的合適程序(參見例如下文所列文獻的標準方法)。在本發(fā)明情況下，術(shù)語抗體或抗體片段還包括抗體或其抗原-結(jié)合部分，它們已重組制備，在適當情況下還可對其進行修飾，例如嵌合抗體、人源化抗體、多功能抗體、雙特異性或多特異性抗體(oligospecificantibody)、單鏈抗體和F(ab)或F(ab)2片段(參見例如EP-B1-0-368684、US4，816，567、US4，816，397、WO88/01649、WO93/06213或WO98/24884)。組織蛋白酶H抗體為市售的，例如山羊抗-小鼠組織蛋白酶H，目錄#BAF1013，R&DSystems(Minneapolis,USA)、大鼠抗-小鼠組織蛋白酶H，目錄#MAB1013，R&DSystems(Minneapolis,USA)、山羊抗-小鼠組織蛋白酶H，目錄#AF1013或兔抗-人組織蛋白酶H,目錄#ABIN285430(antibodies-onlineGmbH,Germany,參見http://www.antikoerper-online.de)或小鼠抗-人組織蛋白酶H,目錄#ABIN165388(antibodies-onlineGmbH,Germany)。組織蛋白酶H抗體的制備以及對來自人組織胞質(zhì)溶膠和血清的人組織蛋白酶H的檢測例如在Schweiger等，JournalofImmunologicalMethods,2001,第165-172頁(參見例如第166-167頁的材料和方法)中詳述。本發(fā)明另一方面涉及用于測定個體疼痛特別是神經(jīng)性疼痛敏感性的診斷試劑盒，測試試劑盒包括至少一種用于檢測生物樣品中組織蛋白酶H的工具及其用途。在本發(fā)明情況下，應將測試試劑盒理解為在本申請中確定的組分的任意組合，它們在空間上聯(lián)合共存到功能單元，并可含有另外組分。在本發(fā)明情況下，測試試劑盒至少包括用于檢測生物樣品中的組織蛋白酶H(例如量/或突變)的工具，其適當?shù)剡B同用于進行檢測反應(例如借助用于測定組織蛋白酶H活性的抗體、酶反應等來免疫學檢測組織蛋白酶H)的合適的緩沖液和/或試劑、和/或樣品制備物以及任選的用于進行相應檢測技術(shù)的操作手冊。本發(fā)明的其它方面涉及治療方法，例如用于在正經(jīng)受疼痛的受試者中治療疼痛的方法，所述方法包括給予所述受試者治療有效量的在所述受試者中降低組織蛋白酶H量或活性的組合物。這可為組織蛋白酶H的總量或總活性，或是在某種組織中的量或活性，例如在神經(jīng)組織、在淋巴組織或免疫系統(tǒng)細胞(例如肥大細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、T-細胞(例如CD8+T-細胞)等)中的量或活性，其中治療有效量包括足以改善個體疼痛感覺或敏感性(特別是關(guān)于神經(jīng)性疼痛)的量。本發(fā)明另一方面涉及用于降低受試者疼痛(并且特別是神經(jīng)性疼痛)敏感性的方法，所述方法包括給予所述受試者治療有效量的降低所述受試者中(例如在淋巴組織或神經(jīng)組織或免疫系統(tǒng)細胞中)的組織蛋白酶H的量(例如表達、半衰期)或活性的組合物。此外，本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)非人雌性受試者的后代中疼痛(并且特別是神經(jīng)性疼痛)敏感性的方法，所述方法包括將賦予受調(diào)節(jié)的組織蛋白酶H表達的核酸轉(zhuǎn)移(例如電穿孔)到受精卵中，將所述受精卵轉(zhuǎn)移到非人代孕母體中，并選出符合其組織蛋白酶H表達特性(與野生型受試者例如小鼠相比組織蛋白酶H表達降低或廢除)的后代。本發(fā)明另一方面涉及能夠降低組織蛋白酶H活性和/或表達的用于治療疼痛并且特別是神經(jīng)性疼痛的化合物。本領(lǐng)域已知組織蛋白酶H的抑制劑，例如E_64d(參見例如Riittger等，BioTechniques,41:469-473,2006)以及Kirschke,H等，1995，ProteinProfile2:1581-1643)。為生產(chǎn)藥物，可將本發(fā)明組織蛋白酶H調(diào)節(jié)劑與合適的添加劑或輔助物質(zhì)一起配制，所述添加劑或輔助物質(zhì)例如生理緩沖溶液，例如氯化鈉溶液、軟化水；穩(wěn)定劑，例如蛋白酶或核酸酶抑制劑，優(yōu)選抑肽酶、ε-氨基己酸或胃酶抑素A;或多價螯合劑，例如EDTA;凝膠制劑，例如白凡士林、低粘度石蠟和/或黃蠟等，視給藥類型而定。合適的另外的添加劑為例如去污劑，例如TritonX-100或脫氧膽酸鈉；還有多元醇，例如聚乙二醇或甘油；糖，例如蔗糖或葡萄糖；兩性離子化合物，例如氨基酸(例如甘氨酸或特別是牛磺酸或甜菜堿)和/或蛋白質(zhì)(例如牛血清白蛋白或人血清白蛋白)。優(yōu)選去污劑、多元醇和/或兩性離子化合物。生理緩沖液優(yōu)選具有約6.0-8.O的pH(特別是約6.8-7.8的pH，尤其是約7.4的pH)和/或約200-400毫滲克分子/升、優(yōu)選約290-310毫滲透分子/升的同滲質(zhì)量摩爾濃度。通常用合適的有機或無機緩沖液調(diào)節(jié)藥物的PH，例如優(yōu)選用磷酸鹽緩沖液、tris緩沖液(三(羥甲基)氨基甲烷)、HEPES緩沖液([4-(2-羥乙基)哌嗪子基]乙磺酸)或MOPS緩沖液(3-嗎啉代-I-丙磺酸)。相應緩沖液的選擇通常視所需緩沖液摩爾濃度而定。磷酸鹽緩沖液適用于例如注射溶液劑及輸注溶液劑。可用常規(guī)方式給予藥物，例如借助口服劑型(例如片劑或膠囊劑)；借助粘膜(例如鼻腔或口腔)；以皮下植入放置形式；借助注射劑、輸注劑或凝膠劑，其含有本發(fā)明藥物。還可表面或局部給予藥物，以便治療上述特定關(guān)節(jié)病，若合適以脂質(zhì)體復合物形式。此外，可借助透皮治療系統(tǒng)(TTS)進行治療，所述系統(tǒng)使得可在時間上控制藥物釋放。例如，可從EPO944398AUEPO916336AUEPO889723Al或EPO852493Al獲知TTS。若僅將相對少量的溶液劑或混懸劑(例如約I-約20ml)給予身體，則通常使用注射溶液劑。若給予大量溶液劑或混懸劑(例如I升或更多升)，則通常使用輸注溶液劑。因為與輸注溶液劑相比，在注射溶液劑情況下僅給予幾毫升，所以在注射時血液或組織液的PH及滲透壓的小差異本身并不能被注意到，或僅就疼痛感覺方面在不顯著的程度上其本身可被注意到。因此，通常不必在使用前稀釋本發(fā)明制劑。然而，在給予相對大量的情況下，應該在臨給藥前將本發(fā)明制劑簡單稀釋到獲得至少接近等滲溶液的程度。等滲溶液實例為O.9%濃度的氯化鈉溶液。在輸注情況下，可例如用無菌水進行稀釋，同時可例如經(jīng)由所謂分流術(shù)(bypass)進行給藥。根據(jù)本發(fā)明不同方面的一個優(yōu)選實施方案，可作為分離的分子使用組織蛋白酶H、其衍生物或片段。在本發(fā)明情況下，術(shù)語“分離的分子”(特別就組織蛋白酶H而言)是指從天然來源純化的組織蛋白酶H多核苷酸或多肽以及純化的重組分子(其中術(shù)語純化的包括部分純化以及完全純化)。重組多肽或多核苷酸分子的制備和從細胞或組織純化天然存在的分子以及細胞或組織提取物的制備為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(亦參見例如以下所列標準文獻)。它們包括例如基于所公布的基因組或編碼多核苷酸序列經(jīng)由聚合酶鏈式反應(PCR)來擴增所需長度的多核苷酸，隨后將所產(chǎn)生的多核苷酸克隆到宿主細胞中(參見例如以下所列標準文獻)。在本發(fā)明情況下，術(shù)語“多肽”是指包含通過肽鍵彼此連接的氨基酸的分子，其含有以線性方式彼此連接從而形成多肽鏈的至少50個氨基酸。較短的這類分子稱為肽。術(shù)語“蛋白質(zhì)”是指包含至少一條多肽鏈的分子，但也可指包含不止一條彼此締合或結(jié)合的多肽鏈的分子。因此，術(shù)語“蛋白質(zhì)”也包括術(shù)語“多肽”。實施例材料與方法所用小鼠品系使用5種不同的近交小鼠品系A(chǔ)KR/J(AKR)、CBA/J(CBA)、C3H/HeJ(C3H)、C57BL/6J(B6)和C58/J(C58)。從Jackson實驗室(BarHarbor,ME,USA)獲得小鼠。已證明這些小鼠品系就若干體內(nèi)疼痛測量值方面而言顯著不同(Mogil等1999)?？俁NA分離用PicoPureRNA分離試劑盒(Arcturus)按照制造商的說明書從DRG(背根神經(jīng)節(jié))分離總RNA。用2100生物分析儀和RNA6000NanoLabChip試劑盒(Agilent)評估RNA質(zhì)量。AffymetrixGeneChip微陣列按照Baugh,L.R,Hill,A.A.,Brown,E.L.和Hunter,C.P.(2001)NucleicAcidsRes.29，e29用500ng總RNA與IOOpMT7_(dT)24寡聚體(GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-dT24SEQIDNO:14)，并遵循制造商的說明書用SuperScriptII逆轉(zhuǎn)錄酶來進行第一鏈cDNA的合成。合成雙鏈cDNA，然后用苯酚-氯仿接著乙醇沉淀步驟來提取。用BioArray高產(chǎn)RNA轉(zhuǎn)錄標記試劑盒(BioArrayHighYieldRNATranscriptionLabelingkit)(Enzo)遵循制造商說明書用雙鏈cDNA樣品進行體外轉(zhuǎn)錄反應。在37°C將轉(zhuǎn)錄反應物孵育16小時。使用用于RNA清理的RNeasyMini試劑盒(Qiagen)方案來純化cRNA，用分光光度計定量。用RNA片段化緩沖液(200mMTris-乙酸、500mMK0Ac、150mMMgOAc,pH8.I)使生物素-標記的cRNA片段化。遵循制造商說明書進行小鼠基因組4302.0GeneChips(Affymetrix)雜交及染色。用GeneChip3000掃描儀對微陣列掃描,輸入掃描的數(shù)據(jù)并用Resolverv5.I表達數(shù)據(jù)分析軟件(RosettaBiosoftware)分析。L5脊椎神經(jīng)檑切和假豐術(shù)稈序在麻醉小鼠中使左L5脊椎神經(jīng)暴露,然后部分去除橫突(transverseprocess)。在與L4脊椎神經(jīng)分開后，橫切L5脊椎神經(jīng)。假手術(shù)(Shamsurgery)與L5脊椎神經(jīng)橫切手術(shù)相同，但不橫切L5脊椎神經(jīng)(參見DeLeo等2000)。測定縮足閾值用動態(tài)足底觸覺測量儀(dynamicplantaraesthesiometer)評估縮足閾值(pawwithdrawalthreshold,PffT)(參見Szabo等2005)。在小鼠適應金屬網(wǎng)地板隔離間后,將刺激物放置在動物的后爪下，由電動致動器驅(qū)動的直金屬絲觸及足底面，并且施加逐漸增大的力，直到動物移開腳爪(縮足閾值，PWT)。評估經(jīng)過手術(shù)的同側(cè)后爪和對側(cè)后爪的PWT。每只動物僅使用一次。在所有動物實驗中，遵守意識清醒動物的研究倫理指導方針，并由當?shù)貍惱砦瘑T會批準該程序。相關(guān)件分析為進行相關(guān)性分析，將每一只神經(jīng)橫切動物(Chung動物)的“疼痛表型”定義為C1-S1，其中Cl=ln(同側(cè)PffT/對側(cè)PffT)，SI=平均值同一品系的所有假手術(shù)動物In(同側(cè)PffT/對側(cè)PWT)。對每一只Chung動物定義兩個差異轉(zhuǎn)錄調(diào)控的測量值，并且每一測量的基因基于其強度表達數(shù)據(jù)。對于各個基因及動物，采用“原始強度測量值”作為由Resolver表達數(shù)據(jù)分析軟件(v5.I)計算的強度測量值。對特定基因和Chung動物，計算“l(fā)og比率測量值”ln(C2/S2)，其中C2=Chung表達強度，S2=平均值同一品系的所有假手術(shù)動物假手術(shù)表達強度。在計算相關(guān)性之前，過濾基因集合以排除表達低于噪聲水平及無顯著的Chung對比假手術(shù)調(diào)節(jié)的基因。符合條件的基因必須在至少60%的絕對倍數(shù)變化>I.5的Chung動物中或至少20%的絕對倍數(shù)變化>2.O的Chung動物中被調(diào)控。此外，相應的基因表達必須在至少5只由各自強度P-值<0.001定義的動物中為可檢測(“存在”)的。用R軟件包(http://www.r-project.org/)來計算每一基因在疼痛表型分數(shù)與所定義的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)測量值之一之間的Pearson相關(guān)系數(shù)?；谶@些,按照Storey等(2002)的方法產(chǎn)生統(tǒng)計顯著性P-值及相應的假發(fā)現(xiàn)率(false-discoveryrate,FDR)。認為在“l(fā)og比率測量值”或“強度測量值”下具有FDR<O.05的基因顯著相關(guān)。圖I:組織蛋白酶H-相關(guān)曲線圖I顯示每一個體小鼠在LOTRG中其神經(jīng)性疼痛表型(機械超敏感性，X-軸)和相應組織蛋白酶H的基因調(diào)控(log比率(Chung對比假手術(shù)對照)，Y-軸)。根據(jù)所用品系對小鼠數(shù)據(jù)進行顏色編碼。進行Pearson相關(guān)性分析，顯示疼痛表型和組織蛋白酶H基因調(diào)控這兩個參數(shù)顯著正相關(guān)。這意味著對于個體小鼠，在經(jīng)過神經(jīng)性手術(shù)的Chung小鼠L5DRG中組織蛋白酶H表達越高，機械痛覺過敏越顯著，其如行為測試所顯示。這種顯著的相關(guān)性表明組織蛋白酶H基因表達對于誘導神經(jīng)性疼痛表型的因果關(guān)系。圖2:組織蛋白酶H-強度數(shù)據(jù)在chung或假手術(shù)后在AKR、CBA和C57品種的各個小鼠的L5神經(jīng)節(jié)中組織蛋白酶H表達的絕對值。圖3:根據(jù)NCBI參考序列NG_009614.I(SEQIDNO.I)的人第15號染色體上組織蛋白酶H的基因組DNA序列。圖4NM_004390.3的人組織蛋白酶H轉(zhuǎn)錄物變體I的編碼序列，其長度為1494bp并且編碼組織蛋白酶H的更長同工型A(SEQIDNO2)0圖5NM_148979.2的人組織蛋白酶H轉(zhuǎn)錄物變體2的編碼序列(SEQIDNO3),其長度為1458bp并且編碼組織蛋白酶H的更短同工型B。依據(jù)上述NCBI條目，該轉(zhuǎn)錄物變體缺乏與變體I相比另外的符合讀框的區(qū)段，從而產(chǎn)生與由轉(zhuǎn)錄物變體I編碼的同工型A相比更短的蛋白質(zhì)(同工型B)。這可產(chǎn)生更可能為分泌性蛋白而非溶酶體蛋白的蛋白質(zhì)(同工型B)。圖6=NCBI條目BC006878.I的小鼠組織蛋白酶H的編碼序列(SEQIDNO.4)。圖7:UniProtKB/Swiss-ProtP09668的人組織蛋白酶H蛋白序列(SEQIDNO.5)，其包含335個氨基酸并且構(gòu)成人組織蛋白酶H(同工型A)的前原形式。該序列進一步被加工成成熟形式；其被裂解成下列3條鏈組織蛋白酶H小鏈、組織蛋白酶H重鏈、組織蛋白酶H輕鏈(輕鏈與重鏈一起可稱為大鏈)；所有的鏈通過二硫鍵結(jié)合在一起。第1-22位氨基酸構(gòu)成信號肽(長度為22個aa)，第23_97位氨基酸構(gòu)成激活肽(長度為75個aa)，第98-105位氨基酸構(gòu)成組織蛋白酶H的小鏈(長度為8個aa)，第106-115位氨基酸構(gòu)成前肽(長度為10個aa)，第116-335個氨基酸構(gòu)成組織蛋白酶H的長鏈(長度為220個aa)，其由通過二硫鍵結(jié)合在一起的重鏈和輕鏈組成，第116-292位氨基酸構(gòu)成組織蛋白酶H的重鏈(長度為177個aa)，第293-335位氨基酸構(gòu)成組織蛋白酶H的輕鏈(長度為43個aa)。圖8NM_004390.3的人同工型A的前蛋白原(SEQIDNO6;由SEQIDNO.2翻譯的氨基酸序列)。圖9:ΝΜ_148979·2的人同工型B的前蛋白原(SEQIDNO:7;由SEQIDΝ0:3翻譯的氨基酸序列)。圖10ΝΡ_004381.2的人組織蛋白酶H同工型前蛋白原的蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO.8)·圖11ΝΡ_683880.I的人組織蛋白酶H同工型b前體蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO.9)·參考文獻DeLeoJA等(2000)TransgenicexpressionofTNFbyastrocytesincreasesmechanicalallodyniainamouseneuropathymodel(在小鼠神經(jīng)病模型中星形細胞的TNF轉(zhuǎn)基因表達增加機械的異常性疼痛)·Neuroreport11:599_602。StoreyJD.(2002)Adirectapproachtofalsediscoveryrates(假發(fā)現(xiàn)率的直接方法)·Journ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ngton'sPharmaceuticalSciences，第17版，1985(對于生理上耐受的鹽(無機或有機)，特別參見第1418頁)。實駘室方法標準文獻若無另外說明，則按照或可按照以下標準文獻所列出的標準方法來實施實驗室方法Sambrook等(1989)MolecularCloningALaboratoryManual.第2版·ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY.第545頁或CurrentProtocolsinMolecularBiology；CurrentProtocolsinMolecularBiology;定期更新，例如第2000卷；JohnWiley&Sons，Inc;編輯FredM.Ausubel,RogerBrent,RobertEg.Kingston,DavidD.Moore,J.G.Seidman，JohnA.Smith，KevinStruhl；CurrentProtocolsinHumanGenetics;定期更新，例如第2003卷；JohnWiley&Sons，Inc;編輯NicholasC.Dracopoli,HonathanLHaines，BruceR.Korf，CynthiaC.Morton，ChristineE.Seidman，J.G.Seigman,DouglasR.Smith；CurrentProtocolsinProteinScience;定期更新，例如第2003卷；JohnWiley&Sons，Inc;編輯JohnE.ColiganiBenM.DunniHiddeL.PloeghiDavidW.SpeicheriPaulT.Wingfield；MolecularBiologyoftheCell;第3版;Alberts，B.，Bray，D.,Lewis,J.,Raff,M.，Roberts，K.，Watson,J.D.；GarIandPublishing，Inc.NewYork&London，1994；GeneTargetingapracticalapproach(1995)，編輯A.LJoyner，IRLPress；Remington'sPharmaceuticalSciences，第17版，1985。權(quán)利要求1.組織蛋白酶H用于鑒定調(diào)節(jié)神經(jīng)性疼痛的化合物的用途。2.異源表達組織蛋白酶H的非人轉(zhuǎn)基因動物用于鑒定或分析調(diào)節(jié)神經(jīng)性疼痛的化合物的用途。3.異源表達組織蛋白酶H的非人轉(zhuǎn)基因動物作為用于增強的神經(jīng)性疼痛敏感性的模型系統(tǒng)的用途。4.非人組織蛋白酶H敲除動物用于鑒定或分析調(diào)節(jié)神經(jīng)性疼痛的化合物的用途。5.非人組織蛋白酶H敲除動物作為用于降低的神經(jīng)性疼痛敏感性的模型系統(tǒng)的用途。6.異源表達組織蛋白酶H或其功能片段的細胞用于鑒定調(diào)節(jié)神經(jīng)性疼痛的化合物的用途。7.異源表達組織蛋白酶H或其功能片段的細胞作為用于增強的神經(jīng)性疼痛敏感性的模型系統(tǒng)的用途。8.組織蛋白酶敲除細胞用于鑒定或分析調(diào)節(jié)神經(jīng)性疼痛的化合物的用途。9.組織蛋白酶敲除細胞作為用于降低的神經(jīng)性疼痛敏感性的模型系統(tǒng)的用途。10.異源表達與組織蛋白酶H啟動子和/或增強子或其功能片段表達上連接的報告基因的細胞用于鑒定或分析調(diào)節(jié)神經(jīng)性疼痛的化合物的用途。11.鑒定或分析調(diào)節(jié)和/或預防神經(jīng)性疼痛的化合物的方法，所述方法包括以下步驟a.提供至少兩份樣品；b.將含有組織蛋白酶H或其功能片段或衍生物的一份樣品與化合物接觸，c.在化合物存在下，測定組織蛋白酶H的活性，d.在化合物不存在下，測定組織蛋白酶H的活性，和e.比較c)與d)中的組織蛋白酶H的活性。12.用于鑒定或分析調(diào)節(jié)和/或預防神經(jīng)性疼痛的化合物的方法，所述方法包括a.將組織蛋白酶H蛋白或其功能片段或衍生物與測試化合物接觸；和b.測定所述測試化合物是否調(diào)節(jié)組織蛋白酶H蛋白或其功能片段或衍生物的活性。13.用于鑒定或分析調(diào)節(jié)和/或預防神經(jīng)性疼痛的化合物的方法，所述方法包括a.將具有可檢測量或活性的組織蛋白酶H或其功能片段或衍生物的細胞與測試化合物接觸；b.測定所述測試化合物是否能夠調(diào)節(jié)細胞中存在的組織蛋白酶H或其功能片段或衍生物的量或活性。14.用于鑒定或分析調(diào)節(jié)和/或預防神經(jīng)性疼痛的化合物的方法，所述方法包括a.在轉(zhuǎn)錄活性系統(tǒng)中將編碼組織蛋白酶H蛋白或其功能片段或衍生物的核酸與測試化合物接觸；和b.測定在所述化合物存在下在所述系統(tǒng)中存在的編碼組織蛋白酶H蛋白或其功能片段或衍生物的mRNA的量；和c.測定所述化合物是否能夠調(diào)節(jié)所述系統(tǒng)中存在的編碼組織蛋白酶H蛋白或功能片段或衍生物的mRNA的量。15.用于鑒定或分析調(diào)節(jié)和/或預防神經(jīng)性疼痛的化合物的方法，所述方法包括a.提供用包含可操作地連接到報告基因或其功能片段的組織蛋白酶H基因或其功能片段的啟動子的核酸載體轉(zhuǎn)染的細胞；b.提供用包含沒有可操作地連接到功能性組織蛋白酶H啟動子的報告基因或其功能片段的對照載體轉(zhuǎn)染的細胞；c.測定在測試化合物存在下a)的細胞和b)的細胞的報告基因活性；d.測定在測試化合物不存在下a)的細胞和b)的細胞的報告基因活性。16.用于鑒定或分析調(diào)節(jié)神經(jīng)性疼痛的化合物的方法，所述方法包括a.選擇調(diào)節(jié)組織蛋白酶H活性的化合物作為測試化合物；和b.將所述測試化合物給予感覺疼痛的受試者，以測定疼痛是否被調(diào)節(jié)。17.鑒定或分析在受治療者中調(diào)節(jié)和/或預防神經(jīng)性疼痛的化合物的方法，所述方法包括a.測定在一種或多種測試化合物存在下組織蛋白酶H或其功能片段或衍生物的生物學活性，以鑒定ー種或多種調(diào)節(jié)組織蛋白酶H生物學活性的調(diào)節(jié)化合物；和b.測試ー種或多種調(diào)節(jié)化合物降低受試者疼痛、疼痛感覺或疼痛敏感性的能力。全文摘要本發(fā)明涉及組織蛋白酶H的用途。本發(fā)明的其它方面涉及用于篩選藥物的方法、用于診斷疼痛易感性的方法以及用于治療疼痛的方法。文檔編號G01N33/68GK102713631SQ201080049813公開日2012年10月3日申請日期2010年8月27日優(yōu)先權(quán)日2009年8月31日發(fā)明者A·M·舒爾特,C·梅茨-魏德曼,D·丁-普芬尼希-多夫,M·格鮑爾,M·米夏利斯申請人:賽諾菲