一種糜蛋白酶原的提取及純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的提取及純化方法。特別是一種糜蛋白酶原的提取及純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]糜蛋白酶是從胰腺中分離純化得到的一種蛋白酶。它在藥理及臨床上的功用主要有1.用于創(chuàng)傷或手術(shù)后傷口愈合、抗炎及防止局部水腫、積血、扭傷血腫、乳房手術(shù)后浮月中、中耳炎、鼻炎等。2.對(duì)眼球睫狀韌帶有選擇性松解作用，可用于白內(nèi)障摘除，使晶狀體比較容易地移去。3.使粘稠的痰液稀化，便于咳出，對(duì)膿性和非膿性痰液均有效。
[0003]在動(dòng)物胰臟中含有大量的酶，大多數(shù)以酶原非活性的形式存在，經(jīng)胰蛋白酶激活后形成具有活性的酶，此外在動(dòng)物胰臟中大部分的酶為絲氨酸蛋白酶家族，特別是胰蛋白酶原與糜蛋白酶原的理化性質(zhì)相近，難以將二者分離。目前國(guó)際上通用的動(dòng)物組織提取藥用蛋白工藝是基于傳統(tǒng)的鹽析、沉淀等方式，這種工藝提取特異性差，操作過(guò)程目標(biāo)產(chǎn)品損失大，以這種傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品活性一般在800-1000單位/毫克，最高只能達(dá)到1200單位/毫克左右。從市場(chǎng)上采購(gòu)的通用純化介質(zhì)和純化技術(shù)，如超濾、分子篩凝膠層析、離子交換凝膠層析、疏水凝膠層析。由于這些純化介質(zhì)和方法的純化效率低、往往需要多介質(zhì)與多個(gè)步驟組合才能達(dá)到產(chǎn)品質(zhì)量要求，生產(chǎn)步驟的增多導(dǎo)致產(chǎn)品總回收率降低，生產(chǎn)成本升高，純化工段成本可高達(dá)總生產(chǎn)成本60% -80%。加之這類介質(zhì)多由國(guó)際公司定價(jià)并且每年以15%提價(jià)，造成蛋白純化工藝升級(jí)慢，工藝成本高，難以形成產(chǎn)業(yè)化，嚴(yán)重制約資源的充分利用。
[0004]經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，從動(dòng)物胰臟中提取純化糜蛋白酶的方法有多種，多為硫酸銨沉淀，陽(yáng)離子交換和陰離子交換層析，超濾等，如中國(guó)專利102618523A—種糜蛋白酶的純化；中國(guó)專利101302505A —種分離提取糜蛋白酶的方法；由于采用多步提取純化，導(dǎo)致糜蛋白酶的回收率低，酶活性不高；有專利報(bào)道采用親和層析技術(shù)進(jìn)行糜蛋白酶的純化，如中國(guó)專利1807612A —種糜胰蛋白酶的制備方法，以卵粘蛋白作為親和配基，由于這種親和配基成本較高，且使用壽命較短，糜蛋白酶的生產(chǎn)成本高，不利于工業(yè)上的放大進(jìn)行。
[0005]因此，有必要開(kāi)發(fā)效率高、成本低的糜蛋白酶原分離材料和和生產(chǎn)工藝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種糜蛋白酶原的提取和純化方法，使其克服糜蛋白酶原大規(guī)模純化中的缺點(diǎn)，在大規(guī)模分離純化時(shí)步驟簡(jiǎn)單、成本低、效率高，利用糜蛋白酶原專一的親和配位體，可快速、簡(jiǎn)便、低成本、大批量純化糜蛋白酶。
[0007]本發(fā)明想目的在于建立糜蛋白酶原的提取方法，保證在大規(guī)模提取時(shí)，高效的提取低純糜蛋白酶原。
[0008]本發(fā)明的目的在于建立糜蛋白酶原的層析純化方法，保證在大規(guī)模分離純化時(shí)，高效的提取糜蛋白酶原。
[0009]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明以基礎(chǔ)層析介質(zhì)為原料制備新型親和介質(zhì)，以牛胰臟為原料制備低純糜蛋白酶原，用新型親和介質(zhì)以糜蛋白酶原為原料制備糜蛋白酶原。
[0010]本發(fā)明包括以下步驟
(I)提取低純糜蛋白酶原；
提取低純糜蛋白酶原，采用“浸取，調(diào)pH，離心，調(diào)pH，離心”的過(guò)程，得到低純糜蛋白酶原溶液。
[0011](2)合成新型親和介質(zhì)
合成新型親和介質(zhì)，先以帶氨基的基礎(chǔ)層析介質(zhì)與三聚氯氰反應(yīng)活化，然后先后與十一胺和二異丁胺反應(yīng)，合成新型親和介質(zhì)。
[0012](3)用新型親和介質(zhì)純化糜蛋白酶原；
用步驟(2)中合成的新型親和介質(zhì)制備成層析柱，將步驟(I)所得低純糜蛋白酶原流過(guò)層析柱，糜蛋白酶原將特異性吸附于層析柱上，雜蛋白將隨緩沖液留出，改變緩沖液將吸附的糜蛋白酶原洗脫下來(lái)，得到高純糜蛋白酶原。
[0013]在步驟(I)中，“浸取”指在破碎成勻漿狀牛胰臟中以固液比(kg: L)1: 2加入
0.2M硫酸-水溶液；“調(diào)pH”分別采用pH7.0及pH2.0兩值；“離心”采用離心力15 OOOg,4°C，30mino
[0014]在步驟(2)中，基礎(chǔ)層析介質(zhì)是聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復(fù)合物珠、纖維素珠和涂有化學(xué)活性基團(tuán)的硅膠中的一種。
[0015]在步驟(3)中，新型親和材料吸附糜蛋白酶原的條件為PH5-6，離子強(qiáng)度為0-0.3M的緩沖液；洗脫條件為PH5-6，離子強(qiáng)度為0.8-1.0M的緩沖液。
[0016]所述新型親和介質(zhì)，其結(jié)構(gòu)是在基礎(chǔ)層析填料上通過(guò)三聚氯氰為連接臂固定^^一胺以及二異丁胺。
[0017]所述糜蛋白酶原，其原料為牛胰臟。
[0018]本發(fā)明客服了糜蛋白酶原生產(chǎn)技術(shù)中的缺點(diǎn)，使糜蛋白酶原在制備時(shí)耗時(shí)減少，生產(chǎn)成本下降，生產(chǎn)效率高，損失率低，利用新型親和介質(zhì)，可快速、低成本、大批量、低損耗的制備糜蛋白酶原。工藝全程回收率> 75%，酶活> 1600U/mg，CT/T > 15。
【具體實(shí)施方式】
[0019]本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，如起始材料聚苯乙烯可更換為聚甲基丙烯酸甲酯、葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’ -亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復(fù)合物珠、纖維素珠和涂有化學(xué)活性基團(tuán)的硅膠等，這些等價(jià)形式同樣落于本發(fā)明范圍。
[0020]下面結(jié)合具體實(shí)例做進(jìn)一步闡述:
實(shí)施例1 一新型親和介質(zhì)制備
取聚苯乙烯(500mL)，依次用3倍體積的IM NaCl，5倍體積蒸餾水充分洗滌后，抽干轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器皿中，加入一定量的冰水，在冰水浴中攪拌加入冷丙酮溶解的三聚氯氰(60g)，用飽和NaHCO^節(jié)反應(yīng)系統(tǒng)的pH在6.5?7.0之間，反應(yīng)4小時(shí)后取出，依次用3X5倍體積的水/丙酮(O: 1,1: 3,1: 1,3: 1,1: O)洗滌，得到1-氨基-聚苯乙烯-3，5-二氯-2，4，6-三聚氯氰。
[0021]稱取^^一胺(80g)用去離子水溶解，用飽和NaHCO3調(diào)節(jié)pH在6.5?7.0之間，與介質(zhì)1-氨基-聚苯乙烯_3，5- 二氯-2，4，6-三聚氯氰混勻，置于溫度37°C中攪拌反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，依次用3倍體積的IM NaCl，5倍體積蒸餾水充分洗滌，得到1-氨基-聚苯乙稀_3~十一胺-5-氣-2，4，6- 二聚氣氛。
[0022]稱取二異丁胺(80g)用離子水溶解，用飽和NaHCO3調(diào)