R結(jié)果得到 0 -N-己酷葡糖胺酶基因nagG冊，并將該酶基因nagG冊與表達(dá)載體祀asy-E2相連接，獲得 含有0 -N-己酷葡糖胺酶基因nagG冊的重組質(zhì)粒祀asy-E2-nagG冊，將祀asy-E2-nagG冊 轉(zhuǎn)化大腸桿菌化21 0E3)，獲得重組大腸桿菌菌株化21 0E3) /nagG冊。
[0043] 取含有重組質(zhì)粒祀asy-E2-nagG冊的重組大腸桿菌菌株化21值E3)/nagG冊，W 0. 1%的接種量接種于LB(含50yg血~lAmp)培養(yǎng)液中，37°C快速振蕩16h。然后將此 活化的菌液W1%接種量接種到新鮮的LB(含50ygmL~lAmp)培養(yǎng)液中，快速振蕩培養(yǎng) 約2~化(0D600達(dá)到0. 6~1. 0)后，加入終濃度0. 7mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，于20°C繼續(xù)振 蕩培養(yǎng)約20h。1200化pm離屯、5min，收集菌體。用適量的抑7.OTris-肥1緩沖液懸浮菌體 后，于低溫水浴下超聲波破碎菌體，破碎后在4°C下13, 000巧m離屯、lOmin，吸取上清進(jìn)行 SDS-PAGE分析。SDS-PAGE結(jié)果（圖1)表明，重組0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊在大腸桿菌 中得到了表達(dá)，經(jīng)純化后，產(chǎn)物為單一條帶。
[0044] 實施例3;純化的重組0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊的性質(zhì)測定
[0045]1、純化的重組0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊的活性分析
[0046] 實施例2純化的重組0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊的活性測定方法采用pNP法：將 底物溶于0. 1M緩沖液中，使其終濃度為2mM;反應(yīng)體系含50yL適量酶液，450yL底物；底 物在反應(yīng)溫度下預(yù)熱5min后，加入酶液后再反應(yīng)lOmin，然后加2血1M化2〔〇3終止反應(yīng)， 冷卻至室溫后在405nm波長下測定OD值。1個酶活單位扣）定義為在給定的條件下每分鐘 分解pNP類化合物產(chǎn)生1ymolpNP所需的酶量。對底物殼二糖、駿甲基纖維素、葡聚糖及昆 布多糖的活性測定方法采用DNS法；將底物溶于0. 1M緩沖液中，使其終濃度為0. 5%;反應(yīng) 體系含50yL適量酶液，450yL底物；底物在反應(yīng)溫度下預(yù)熱5min后，加入酶液后再反應(yīng) 適當(dāng)時間，然后加2. 0血DNS終止反應(yīng)，沸水煮5min，冷卻至室溫后在540皿波長下測定0D 值；1個酶活單位扣）定義為在給定的條件下每分鐘分解底物產(chǎn)生1ymol還原糖（W葡萄 糖計）所需的酶量。
[0047] 2、純化的重組0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊的抑活性和抑穩(wěn)定性測定；
[0048] 酶的最適抑測定：將0-N-己酷葡糖胺酶化gG冊在37°C下和0. 1M抑為5. 0~ 9. 0的緩沖液中進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶的抑穩(wěn)定性測定：將酶液置于0. 1M抑為4. 0~10. 0 的緩沖液中，在37°C下處理Ih，然后在pH為7及40°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)，W未處理的酶液作 為對照。緩沖液為；0. 1MMcllvainebuffer(pH為 4. 0 ~8. 0)和 0. 1Mglycine-NaOH(pH 為9.0~10.0)。WpNP-GlcNAc為底物，反應(yīng)lOmin，測定化gG冊的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表 明：化gG冊的最適抑為7,在抑6. 5~8.0的范圍內(nèi)維持35 %W上的酶活性，（圖2);經(jīng) P冊.0~8. 0的緩沖液處理比，該酶剩余酶活約65%W上（圖3)。
[0049] 3、純化的重組0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊的熱活性及熱穩(wěn)定性測定：
[0化0] 酶的最適溫度測定；在抑為7的緩沖液中，于0~60°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶的熱 穩(wěn)定性測定；將同樣酶量的酶液置于37°C和50°C中，處理0~60min后，在pH7及40°C下 進(jìn)行酶促反應(yīng)，W未處理的酶液作為對照。WpNP-GlcNAc為底物，反應(yīng)lOmin，測定化gG冊 的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明；化gG冊的最適溫度為40°C(圖4);該酶在37°C下處理比，剩余酶 活為25. 4% (圖5)。
[0化1] 4、不同金屬離子及化學(xué)試劑對純化的重組0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊活力的影 響：
[0052] 在酶促反應(yīng)體系中加入ImM的金屬離子及化學(xué)試劑，研究其對酶活性的影響。在 40°C及抑7條件下，WpNP-GlcNAc為底物測定酶活性。結(jié)果（表1)表明，ImM的SDS和 化(：12可完全抑制化肖6冊^65〇4、4肖側(cè)3、化(：13和化4(：對化肖6113的抑制較強(qiáng)，]?拆〇4和化5〇4 對化gG冊的抑制較弱，其余金屬離子和化學(xué)試劑對化gGHg的影響較小。
[005引表1.金屬離子及化學(xué)試劑對重組e-N-己酷葡糖胺酶化gG冊活力的影響
[0054]
[0化6] 5、純化的0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊在NaCl中的活性；
[0057] 酶在化C1中的活性測定：在酶促反應(yīng)體系中加入3.0~30. 0%(w/v)化C1，于抑 為7. 0及40°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)。WpNP-GlcNAc為底物，反應(yīng)lOmin，測定純化的化gG冊的 酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明；化gGH3具有良好的耐鹽性，在反應(yīng)體系中加入3.0%和5.0%(w/v) 的化C1，該酶酶活性提高約0.3倍，在反應(yīng)體系中加入20% (w/v)的化C1，該酶仍然具有 55 %的活性（圖6)。
[005引 6、純化的重組0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊對底物的降解；
[0059]在抑7及40°C下，重組0-N-己酷葡糖胺酶化gGH3對pNP-GlcNAc的酶活為19. 3抓 mg-i、對二己酷殼二糖的酶活為1. 58Umg-i、對四己酷殼四糖的酶活為0. 86Umg-i，對pNP-G、 pNP-Xyl、駿甲基纖維素、葡聚糖及昆布多糖均無酶活。
[0060] 7、純化的重組e-N-己酷葡糖胺酶化gG冊水解N-己酷殼寡糖的產(chǎn)物分析；
[0061] 產(chǎn)物分析反應(yīng)體系含80yL0. 5%二己酷殼二糖或四己酷殼四糖和80yL純酶液， 在pH7及40°C下，反應(yīng)化。采用薄層層析法進(jìn)行產(chǎn)物分析，薄層層析法步驟如下：
[0062] (1)配制展開劑（冰醋酸、雙蒸水、正了醇體積比為1 ;1 ;2,配制適量）倒入展開 槽，靜置約30min;
[0063] 似將硅膠板放于110°C烘箱活化30min，冷卻后劃線，點樣（每次0.5化，吹干， 共點3次）；
[0064] (3)將點樣的一端硅膠板朝下放入展開槽，點樣點不可沒入展開劑；
[0065] (4)待展開劑到硅膠板上沿1. 5cm時，取出硅膠板，吹干，再展一次；
[0066] (5)第二次展開結(jié)束后，硅膠板直接浸入適量顯色劑（Ig二苯胺溶入50ml丙酬，溶 解后加1ml苯胺及5ml85%的磯酸，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配）；
[0067] 做幾秒后，立即取出硅膠板并放入90°C烘箱10~15min，使斑點顯色
[0068] 結(jié)果表明，化gG冊可將二己酷殼二糖及四己酷殼四糖水解為N-己酷-D-胺基葡 萄糖單糖（圖7、8)。
[0069] 8、N-己酷-D-胺基葡萄糖對重組0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊活性的影響
[0070] 在酶促反應(yīng)體系中加入終濃度為2 -lOmMN-己酷-D-胺基葡萄糖，于抑7. 0及 40°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)。WpNP-GlcNAc為底物，反應(yīng)lOmin，測定純化的化gG冊的酶學(xué)性質(zhì)。 結(jié)果表明：當(dāng)反應(yīng)體系加入終濃度lOmMN-己酷-D-胺基葡萄糖時，該酶仍保留約46 %的 活性，表明N-己酷-D-胺基葡萄糖對化gG冊抑制作用較低（圖9)。
[0071] 本發(fā)明提供了一種0-N-己酷葡糖胺酶化g細(xì)3,其最適抑值為7,最適溫度為 40°C，可促進(jìn)幾了質(zhì)的水解，具有耐鹽和耐產(chǎn)物抑制的性質(zhì)，可應(yīng)用于海產(chǎn)品加工、醫(yī)學(xué)、功 能性食品等行業(yè)。
【主權(quán)項】
1. 一種0-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3,其特征在于，其具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸 序列。2. 權(quán)利要求1所述的0 -N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的編碼基因nagGH3,其特征在于，其 具有SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。3. 包含權(quán)利要求2所述編碼基因的重組載體，由具有SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列的 基因片段與表達(dá)載體重組構(gòu)建而成。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組構(gòu)建，其特征在于，所述基因片段與表達(dá)載體通過T-A方 式連接。5. 含有權(quán)利要求3所述重組載體的重組菌株。6. -種0 -N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的制備方法，包括： 用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株； 培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組0 -N-乙酰葡糖胺酶NagGH3表達(dá)，得到0 -N-乙酰葡糖胺酶 NagGH3〇7. 權(quán)利要求1所述的0 -N-乙酰葡糖胺酶NagGH3在殼二糖水解中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述殼二糖水解的pH值為7。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述殼二糖水解的溫度在40°C以下。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述殼二糖水解的時間為4~8h。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3及其基因和NagGH3的制備方法。本發(fā)明提供的β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本發(fā)明提供了一種β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3的編碼基因nagGH3。nagGH3具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本發(fā)明提供了包含nagGH3的重組載體，該重組載體為重組質(zhì)粒。本發(fā)明提供了包含重組載體的宿主細(xì)胞，重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞得到重組菌株。本發(fā)明提供的β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3可促進(jìn)殼二糖的水解，具有耐鹽和耐產(chǎn)物抑制的性質(zhì)，可應(yīng)用于海產(chǎn)品加工、醫(yī)學(xué)、功能性食品等行業(yè)。
【IPC分類】C12N9/42, C12N15/74, C12P19/26, C12N1/21
【公開號】CN104988126
【申請?zhí)枴緾N201510353863
【發(fā)明人】周峻沛, 張蕊, 黃遵錫, 宋志鳳, 唐湘華, 李俊俊, 吳倩
【申請人】云南師范大學(xué)
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年7月31日