一種β-N-乙酰葡糖胺酶NagGH3及其基因和NagGH3制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)及其基因和 化gG冊(cè)的制備方法。
【背景技術(shù)】
[000引幾了質(zhì)是由N-己酷-D-胺基葡萄糖單體通過(guò)0 -1，4鍵組成的多糖，廣泛存在于 真菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞壁W及甲殼類動(dòng)物外骨骼中。幾了質(zhì)的蘊(yùn)藏量在地球上的天然高分子中占 第二位，其含量?jī)H次于纖維素，主要是用來(lái)作為支撐身體骨架，W及對(duì)身體起保護(hù)的作用。 [000引幾了質(zhì)在內(nèi)切幾了質(zhì)酶作用下，可水解為N-己酷殼寡糖。0-N-己酷葡糖胺酶 為外切型糖巧水解酶，屬于幾了質(zhì)降解酶系中的一種，可催化N-己酷殼寡糖降解為N-己 酷-D-胺基葡萄糖，在幾了質(zhì)徹底水解中起到關(guān)鍵性作用。但是大多數(shù)0-N-己酷葡糖 胺酶易受到水解產(chǎn)物即N-己酷-D-胺基葡萄糖的抑制，而影響幾了質(zhì)的水解（Yanget al.,JournalofAgriculturalandFoodChemistry, 2014, 62:5181 - 5190)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種e-N-己酷葡糖胺酶化g細(xì)3。
[0005] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼上述0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)的編碼基因 nagGHS。
[0006] 本發(fā)明的第S個(gè)目的是提供包含上述基因的重組載體。
[0007] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供包含上述基因的重組菌株。
[000引本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供所述0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)的制備方法。
[0009] 本發(fā)明提供了一種0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)，該0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè) 具有SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列。
[0010] 本發(fā)明中所述0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)總共含567個(gè)氨基酸，理論分子量為 63. 27kDa，其中N端有20個(gè)氨基酸為預(yù)測(cè)信號(hào)膚序列"MLKPILAFSLAILSSLGVYA"，成熟的 0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)含547個(gè)氨基酸。0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)的最適抑值 為7,在抑值為6. 5~8. 0的范圍內(nèi)維持35%W上的酶活性（圖2);經(jīng)抑值為5. 0~8. 0 的緩沖液處理比，該酶剩余酶活約65%W上。0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)的最適溫度為 40°C;在37°C下處理比，該酶剩余酶活為25. 4%。0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)可促進(jìn)幾了 質(zhì)的水解；在3. 0%和5. 0% (w/v)的化C1中，0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)的酶活性提高 約0. 3倍；在20 % (w/v)的化C1中，該酶仍然具有55 %的活性；當(dāng)反應(yīng)體系加入終濃度為 lOmM的N-己酷-D-胺基葡萄糖時(shí)，該酶仍保留約46%活性。
[OCm] 本發(fā)明提供了一種e-N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)的編碼基因nagG冊(cè)。具體的， nagG冊(cè)具有SEQIDNO. 2所示的核巧酸序列，全長(zhǎng)1704bp，起始密碼為ATG，終止密碼為T(mén)AA，從銷氨醇桿菌中提取得到。
[001引本發(fā)明提供了包含nagGH3的重組載體，該重組載體為重組質(zhì)粒。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種重組載體的構(gòu)建方法：將0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)的編 碼基因nagGH3插入到表達(dá)載體中，使其核巧酸序列與表達(dá)載體的核巧酸序列相連接。優(yōu)選 的，將本發(fā)明的0 -N-己酷葡糖胺酶基因和表達(dá)載體大腸桿菌的質(zhì)粒祀asy-E2通過(guò)T-A方 式相連接，得到重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒祀asy-E2-nagG冊(cè)。
[0014] 本發(fā)明提供了包含重組載體的宿主細(xì)胞，重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞得到重組菌株。 優(yōu)選的，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌、酵母菌、芽抱桿菌或乳酸桿菌中的一種；更優(yōu)選的，所述 宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞，將重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒祀asy-E2-nagG冊(cè)轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞 化21 0E3)，得到重組菌株化21 0E3) /nagG冊(cè)。
[00巧]本發(fā)明提供了一種0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)的制備方法，包括：
[0016] 用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
[0017] 培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)表達(dá)；
[00化]回收所表達(dá)的0 -N-己酷葡糖胺酶化g細(xì)3。
[0019] 本發(fā)明提供了一種0 -N-己酷葡糖胺酶化g細(xì)3,其最適抑值為7,最適溫度為 40°C，可促進(jìn)幾了質(zhì)的水解，具有耐鹽和耐產(chǎn)物抑制的性質(zhì)，可應(yīng)用于海產(chǎn)品加工、醫(yī)學(xué)、功 能性食品等行業(yè)。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[002U圖1為在大腸桿菌中表達(dá)的重組0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)的SDS-PAGE分析； 其中，M:蛋白質(zhì)Marker;S1:含有重組載體祀asy-E2-nagG冊(cè)的大腸桿菌菌體破碎上清液； S2:純化的重組0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)；
[002引圖2為純化的重組0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)的抑活性；
[002引圖3為純化的重組0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)的抑穩(wěn)定性；
[0024] 圖4為純化的重組0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)的熱活性；
[002引圖5為純化的重組0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)的熱穩(wěn)定性；
[0026] 圖6為純化的重組0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)在不同濃度化C1中的活性；
[0027] 圖7為純化的重組0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)水解二己酷殼二糖的產(chǎn)物分析；其 中，M:N-己酷-D-胺基葡萄糖；CK:二己酷殼二糖與滅活的化gG冊(cè)；S:二己酷殼二糖與有 活性的化g細(xì)3 ;
[002引圖8為純化的重組0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)水解四己酷殼四糖的產(chǎn)物分析；其 中，M:N-己酷-D-胺基葡萄糖；CK:四己酷殼四糖與滅活的NagGH3;S:四己酷殼四糖與有 活性的化g細(xì)3 ;
[0029] 圖9為純化的重組0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)在不同濃度N-己酷-D-胺基葡萄 糖中的活性。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此，本 實(shí)施例中方法如無(wú)特殊說(shuō)明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無(wú)特殊說(shuō)明的采用常規(guī)試劑 或按常規(guī)方法配置的試劑。
[0031]試驗(yàn)材料和試劑
[003引 1、菌株及載體；銷氨醇桿菌（S地ingobacteriumsp.)同文獻(xiàn)報(bào)道菌種性質(zhì)，如中 國(guó)普通微生物菌種保藏管理中屯、菌株SphingobacteriumspiritivorumCGMCC1.10853; 大腸桿菌EscherichiacoliBL21 (DE3)和表達(dá)載體祀asy-E2購(gòu)于Novagen公司。
[003引 2、酶類及其它生化試劑；DNA聚合酶和dNTP購(gòu)自TaKaRa公司； pNP(p-nitrophenol)、pNP-GlcNAc(p-nitrophenylP-N-acetylglucosaminide)、pNP-G(p-nitrophenylP-D-glucopyranoside)和pNP-Xyl(p-nitrophenylP-D-xylopyra noside)購(gòu)自Sigma公司；二己酷殼二糖及四己酷殼四糖購(gòu)自百靈威科技公司；Genomic DNAClean&Concentration試劑盒購(gòu)自ZymoResearch公司；TureseqTMDNASample Pr巧arationKit購(gòu)自Illumima公司，其它都為國(guó)產(chǎn)試劑，均可從普通生化試劑公司購(gòu)買(mǎi) 得到。
[0034] 3、培養(yǎng)基；
[0035] LB培養(yǎng)基；Peptone lOg，化ast extract 5g，化〔1lOg，加蒸饋水至 1000ml，呈中 性。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加2.0% (w/v)瓊脂。
[0036]W下實(shí)施例中未作具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》 (第=版）J.薩姆布魯克一書(shū)中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0037] 實(shí)施例1 ; 0 -N-己酷葡糖胺酶基因nagG冊(cè)的克隆
[003引提取銷氨醇桿菌基因組DNA;將培養(yǎng)2d的液體菌液離屯、取菌體，加入ImL溶菌酶， 37°C處理60min，再加入裂解液，裂解液組成為；50mMTris，20mM邸TA，化C1 500mM，2% SDS(w/v)，P服.0, 70°C水浴裂解60min，每隔lOmin手動(dòng)混勻一次，在4°C下W10000巧m的 速率離屯、5min。取上清于酪/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫 靜置5min后，4°C下W1000化pm的速率離屯、lOmin。棄上清，沉淀用70%的己醇洗漆兩次， 真空干燥，加入適量TE溶解，置于-20°C環(huán)境中備用。
[0039] 用超聲打斷儀Biorupter將5yg的銷氨醇桿菌基因組打斷為400 - 60化P的片 段，用GenomicDNAClean&Concentration試劑盒對(duì)打斷的DNA片段進(jìn)行純化，純化后用 I\ireseq?DNASamplePreparationKit進(jìn)行DNA片段的末端補(bǔ)平、3'端加A堿基和加接 頭、及DNA片段的PCR擴(kuò)增（操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行）。用MiSeq基因組測(cè)序儀（Illumima 公司）對(duì)上述制備好的文庫(kù)進(jìn)行基因組測(cè)序。
[0040] 基因組測(cè)序得到的數(shù)據(jù)經(jīng)讀碼框預(yù)測(cè)和本地BLAST比對(duì)，得到0 -N-己酷葡糖胺 酶基因nagG冊(cè)，該基因序列如SEQIDNO. 2所示。
[0041] 實(shí)施例2 ;重組0 -N-己酷葡糖胺酶化gG冊(cè)的制備
[0042]W5'CAGAAAAAACCGGATTTTGTG3' 和 5'AAGGCCTTTTCCGAAAGTATAT3' 為引物對(duì)， 銷氨醇桿菌基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為；94°C變性5min;然后94°C 變性30sec，50°C退火30sec，72°C延伸2min，30個(gè)循環(huán)后72°C保溫lOmin。PC