專利名稱：：突變體Ⅱ型β-內(nèi)酰胺?；傅闹谱鞣椒ㄍ蛔凅wn型/3-內(nèi)酰胺?；副景l(fā)明涉及突變體II型^-內(nèi)酰胺?；?acylase)、編碼所述酶的多肽以及經(jīng)所述多肽轉(zhuǎn)化的微生物和生產(chǎn)所述突變體II型/3-內(nèi)酰胺的方法。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的突變體II型/3-內(nèi)酰胺?；竵砩a(chǎn)感興趣的脫酰基化]8-內(nèi)酰胺化合物的工藝。0-內(nèi)酰胺抗生素構(gòu)成了抗生物化合物的最重要的組，其臨床應(yīng)用已有很長的歷史。在該組中，突出的有青霉素和頭孢菌素。青霉素是多種有絲真菌，例如，尸em'cz，wm(例如尸.c/z/^oge"wm)天然生產(chǎn)的。頭孢菌素是多禾中微生物，例如^crewom'wm(例如，Ac/z/^^ogewwm)禾口iSYreptom_yces(例如，6V^ptom少cesc/avw//gen^)天然生產(chǎn)的。作為經(jīng)典菌株改進(jìn)技術(shù)的結(jié)果，過去數(shù)十年來，尸.c/z^soge"wm和A"0^oge""附中的抗生素生產(chǎn)水平也顯著增加。隨著對產(chǎn)生青霉素和頭孢菌素的生物合成途徑的了解逐漸增加以及重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)，已經(jīng)可以用新的工具來改進(jìn)生產(chǎn)菌株。/3-內(nèi)酰胺生物合成中涉及的很多酶己被鑒定出來，它們對應(yīng)的基因也已被克隆，如IngoliaandQueener，MedResRev(1989)9:245-264(生物合成途45禾口酉每)以及Aharonowitz，Cohen,andMartin,AnnRevMicrobiol(1992)46:461-495(基因克隆)所述。尸.c/zo^ge做m中對青霉素進(jìn)行生物合成的前兩個步驟是三個氨基酸L-5-氨基-5-羧基戊酸(L-co-氨基己二酸)(A)、L-半胱氨酸(C)和L-纈氨酸(V)縮合為三肽LLD-ACV，接著是該三肽環(huán)化為異青霉素N的形式。該化合物含有典型的/3-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)。第三個步驟涉及通過?；D(zhuǎn)移酶(AT)的作用用疏水側(cè)鏈代替L-5-氨基-5-羧基戊酸的親水側(cè)鏈。在EP-A-0448180中描述，AT介導(dǎo)的酶促交換反應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器——微體中發(fā)生。可通過表達(dá)脫乙酰氧頭孢菌素C合酶(EC1.14.20.1-DAOCS，在本文中還被稱為擴(kuò)環(huán)酶(expandase))的非前驅(qū)(non-precursed)尸.c/o^gem^轉(zhuǎn)化子形成相當(dāng)大量的脫乙酰氧頭孢菌素C(DAOC)，這一現(xiàn)象暗示了顯著量的青霉素N——擴(kuò)環(huán)酶天然底物在尸.cAo^gewwm中的存在(Alvietal.,JAntibiot(1995)48:338-340)。但是，DAOC的D-o;-氨基-己二?；鶄?cè)鏈不能被容易地去除。頭孢菌素比青霉素貴得多。一個原因在于，一些頭孢菌素(例如頭孢氨芐(cephalexin))是通過多次化學(xué)轉(zhuǎn)化從青霉素制得的。另一原因在于，目前僅具有D-Q!-氨基-己二酰基側(cè)鏈的頭孢菌素才能被發(fā)酵。在這方面最重要的起始材料——頭孢菌素C在任何pH下都易溶于水，因此，這暗示要使用麻煩且昂貴的柱技術(shù)來進(jìn)行長且浪費(fèi)的分離工藝。還必須經(jīng)過多次化學(xué)和酶促轉(zhuǎn)化，將以這種方式獲得的頭孢菌素C轉(zhuǎn)化為治療用的頭孢菌素。目前工業(yè)界偏好用來制備7-氨基-脫乙酰氧頭孢烷酸(7-ADCA)的方法涉及復(fù)雜的化學(xué)步驟，對青霉素G進(jìn)行擴(kuò)環(huán)和衍生化。生產(chǎn)7-ADCA的一個必要的化學(xué)步驟涉及將5元青霉素環(huán)結(jié)構(gòu)擴(kuò)環(huán)為6元頭孢菌素環(huán)結(jié)構(gòu)(見，例如US4,003,894)。該復(fù)雜的化學(xué)加工既昂貴又對環(huán)境有害。因此，人們很想用酶促反應(yīng)(例如酶促催化，優(yōu)選地，在發(fā)酵期間進(jìn)行的)來代替此類化學(xué)過程。通過生物學(xué)過程來代替化學(xué)擴(kuò)環(huán)過程的關(guān)鍵是頭孢菌素生物合成途徑中的中樞酶——擴(kuò)環(huán)酶。來自細(xì)菌5Vr③tom;;c"c/mW!'gen".c/mWz'gems)的擴(kuò)環(huán)酶被發(fā)現(xiàn)能在一些情況下進(jìn)行青霉素環(huán)擴(kuò)展。當(dāng)將其引入尸.cAo^oge"wm時，其能將青霉素環(huán)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為頭孢菌素環(huán)結(jié)構(gòu)，如Cantwelletal.,ProcRSocLondB(1992)248:283-289所述。鑒于擴(kuò)環(huán)酶能催化青霉素N的5元噻唑烷環(huán)擴(kuò)環(huán)為DAOC的6元二氫噻嗪環(huán)，因此從邏輯上講該酶當(dāng)然將是代替化學(xué)工藝中環(huán)擴(kuò)展步驟的候選者。但不幸的是，該酶作用于頭孢菌素生物合成途徑的青霉素N中間產(chǎn)物，而在通過戶."o^oge做m生產(chǎn)的容易獲得的便宜的青霉素(例如青霉素V或青霉素G)上卻沒有作用或者非常低效。青霉素N并不能商業(yè)獲得，甚至當(dāng)其被擴(kuò)環(huán)時，其D-ce-氨基-己二?；鶄?cè)鏈都不能被青霉素?；溉菀椎爻ァ＜河袌蟮?，擴(kuò)環(huán)酶能將具有特定側(cè)鏈的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)為對應(yīng)的7-ADCA衍生物。擴(kuò)環(huán)酶的這一特征被用于WO93/05158、WO95/04148和WO95/04149公開的技術(shù)中。在這些公開文本中，通過在經(jīng)擴(kuò)環(huán)酶基因轉(zhuǎn)化過的重組c/zo^oge做m菌株中對某些6-氨基青霉垸酸(6-APA)衍生物進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)化，來代替將青霉素G體外轉(zhuǎn)化為7-ADCA的傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)化。更具體地，WO93/05158教導(dǎo)了擴(kuò)環(huán)酶在P.c/zo^oge肌m中的體內(nèi)使用，這與作為儲備的己二酰基側(cè)鏈(也被稱為己二?；?組合，所述側(cè)鏈?zhǔn)鞘?中?；D(zhuǎn)移酶的底物。這導(dǎo)致了己二酰-6-APA的形成，己二酰-6-APA被引入尸.c/io^oge做m菌株的擴(kuò)環(huán)酶轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生了己二酰-7-ADCA，其被真菌細(xì)胞排進(jìn)周圍培養(yǎng)基。在隨后的步驟中，可通過化學(xué)方法或通過?；该复偾械魧?yīng)的7-ADCA衍生物的側(cè)鏈，由此產(chǎn)生7-ADCA和對應(yīng)的側(cè)鏈。文獻(xiàn)中已提到多種類型的微生物可用作為酰化酶產(chǎn)生菌株，用于對通過發(fā)酵獲得的^-內(nèi)酰胺衍生物脫酰基化。此類生產(chǎn)酰化酶的微生物的例子是五^/^n'c/n'flco/i、種的某些菌株。根據(jù)文獻(xiàn)，基于其分子結(jié)構(gòu)和底物特異性而言，可以考慮若干種類型的酉先化酶(VandammeE.J.Penicillinacylasesandbeta-lactamases"In:"MicrobialEnzymesandBioconversions"E.H.Rose(Ed.)，EconomicMicrobiology5(1980)467-552,Acad.Press,NewYork)。I型?；甘菍η嗝顾豓特異性的。這些酶由四個相同的亞基構(gòu)成，每個亞基具有35kDa的分子量。來自萬fld〃w5//wen'cM的克隆基因的完整核苷酸序列已被報道(OllsonA.Appl.Environm.Microb.(1976),203)。II型?；付脊蚕硐率龉灿械姆肿咏Y(jié)構(gòu)這些酶是小a-亞基(20-25kDa)和大/3-亞基(60-65kDa)構(gòu)成的異二聚體。在底物特異性方面，II型酰化酶可被進(jìn)一步分為兩組。IIA型酰化酶對青霉素G非常特異，因此通常被稱為青霉素?；?。通常，它們對鄰近酰胺基氮原子的基元(這可能是頭孢霉素核(cephem)基團(tuán)、青雩烯(penem)基團(tuán)、氨基酸等)并不太特異，但是對底物的?；械孜锾禺愋?。該酰基基元必須非常疏水，其優(yōu)選是苯甲基或(短)烷基。不被IIA型?；杆獾牡孜锏睦邮蔷哂卸人嶙鳛轷；哪切╃牾；?、戊二?；?、己二?；桶被憾；?，CefC的側(cè)鏈。IIA型?；傅睦邮莵碜晕鍂/zen'c/n'flco//、A7炒verac^o//zZ/a、已有報道，IIB型?；改軐⒕哂戌牾；⑽於；⒓憾；蚢-酮己二?；鳛轷；念^孢菌素(包括脫乙酰氧衍生物)以及甚至CefC水解至非常有限的程度。還可基于氨基酸序列同源性，將該IIB型酰化酶的組再分為兩組。這些亞組在本文中被定義為SY77組和SE83組，它們是因?yàn)榉謩e來自尸wwfifomo"mSY77和尸化i^owo加5SE83-acy11的?；傅妹?。Matsudaetal(J.Bacteriol(1985),1222已經(jīng)對編碼SY77-?；傅幕蜻M(jìn)行克隆及測序，其表明，該酶對戊二酰-7-ACA具有活性，但是對琥珀酰-7-ACA和己二酰-7-ACA的活性要少得多。SY77-前體的三維結(jié)構(gòu)是已知的(J.Biol.Chem.(2002),222,2823)。此后，Matsudaetal.(J.Bacteriol(1987)，巡，5815和J.Bacteriol.(1987):巡，5821)對編碼SE83-acylI?；傅幕蜻M(jìn)行了克隆和測序，其表明，該酶對戊二酰-7-ACA、己二酰-7-ACA、琥珀酰-7-ACA禾nCEFC(頭孢菌素C)具有活性(降序排列)。與SE83相關(guān)的所有研究都集中于酶水解70ACA衍生物的能力，特別是水解CEFC的能力。在W091/16435中已顯示，SY77禾nSE83-acy11之間的氨基酸同源性非常低?；傅腶-亞基大約25%，/3-亞基大約28%。WO9512680公開了來自^"ev，^mom^Am&wto的另一種SE83組的酰化酶，其被命名為N176，其與SE83-acy11大約94%同源，并且針對其CEFC-?；富钚赃M(jìn)行了測試。SE83組的第三個成員是來自Srev,&mo"wV22的V22。這三種酰化酶的氨基酸序列由Aramorietal在JournalofFermentationandBioengineering72,232-243(1991)中公開。表1顯示了SE83組的多種IIB型?；赴被嵝蛄械娜L序列同一性矩陣。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>已經(jīng)有若干種嘗試，企圖增加數(shù)種現(xiàn)有?；傅腃EFC-?；富钚訵O2005014821公開了SE83-?；傅耐蛔凅w，EP-A-1553175公開了N176-?；傅耐蛔凅w，所有突變體都是為了提高CEFC-酰化酶活性。提到的參考文獻(xiàn)都沒有關(guān)注對感興趣的其它?；?5-內(nèi)酰胺化合物(例如己二酰-7-ADCA)的脫?；磻?yīng)的改進(jìn)。因此，人們?nèi)云惹行枰率鲺；?，其具有針對己二?7-ADCA的提高的脫?；钚?，并且可有利地用于從己二酰-7ADCA(例如，通過對經(jīng)轉(zhuǎn)化的尸e"/"7//^2菌株發(fā)酵生產(chǎn)的)來生產(chǎn)7-ADCA的工藝。圖1:對iS-內(nèi)酰胺酰化酶——來自尸"^/omo"oSE83的II型SE83-acyii(SEQIDNo.l)、來自5revim^mo"^^mz'肌toN-176的N176(SEQIDNo.2)和來自5"vwwAmo"MAmz'"wtoV22的V22(SEQIDNo.3)的氨基酸序列進(jìn)行的多比對。圖2:在pH=8.8禾卩30°C(圖2a)下以及pH=9.5和40。C(圖2b)下，通過固定的酰化酶對己二酰-7-ADCA的轉(zhuǎn)化。SE83ACYii野生型的固定的酰化酶(實(shí)線)和突變體L161T固定的?；?虛線)。速率(mlKOH/分鐘，Y軸上)被作為百分比轉(zhuǎn)化率(％，X軸上)的函數(shù)作圖。在第一個方面，本發(fā)明提供了下述突變體11型./3-內(nèi)酰胺酰化酶，其是具有II型/3-內(nèi)酰胺?；富钚缘哪Ｐ投嚯牡淖凅w，其中，突變體/3-內(nèi)酰胺?；篙^之具有/3-內(nèi)酰胺?；富钚缘哪Ｐ投嚯亩?，針對己二酰-7-ADCA的體外/3-內(nèi)酰胺酰化酶活性提高了至少1.5倍。在材料和方法章節(jié)對針對己二酰-7-ADCA的體外/3-內(nèi)酰胺?；富钚缘臏y定進(jìn)行了詳細(xì)描述。更優(yōu)選地，突變體II型/3-內(nèi)酰胺?；傅尼槍憾?7-ADCA的體外/5-內(nèi)酰胺酰化酶活性提高了至少2倍，更優(yōu)選地，至少2.5倍，更優(yōu)選地，至少3倍，更優(yōu)選地，至少4倍，更優(yōu)選地，至少5倍，更優(yōu)選地，至少6倍，更優(yōu)選地，至少7倍，更優(yōu)選地，至少8倍，更優(yōu)選地，至少9倍，更優(yōu)選地，至少10倍，更優(yōu)選地，至少11倍。在本發(fā)明的上下文中，"改變的或突變體II型/3-內(nèi)酰胺?；?指具有酰化酶活性的、并非從天然來源獲得的并且其氨基酸序列與天然II型0-內(nèi)酰胺酰化酶的完整氨基酸序列有所不同的任何酶。本發(fā)明還提供了下述突變體II型/3-內(nèi)酰胺?；福涫蔷哂蠭I型/5-內(nèi)酰胺?；富钚缘哪Ｐ投嚯牡淖凅w，其中，所述突變體II型iS-內(nèi)酰胺?；钢辽僭谶x自第161、270、296、442和589位構(gòu)成的組或第10、29、274、280、314、514、645、694、706和726位構(gòu)成的組或第10、29、161、270、274、280、296、314、442、514、589、645、694、706和726位構(gòu)成的組或第10、29、270、274、280、442、514、589、645、694和726構(gòu)成的組的氨基酸位置上經(jīng)過修飾，其中采用了/^e^tom(was的SE83-acyll?；傅陌被嵝蛄?SEQIDNO:l)的氨基酸位置編號。更優(yōu)選地，本發(fā)明還提供了下述突變體II型/3-內(nèi)酰胺?；?，其是具有II型/5-內(nèi)酰胺酰化酶活性的模型多肽的變體，其中，突變體/5-內(nèi)酰胺?；篙^之具有/3-內(nèi)酰胺酰化酶活性的模型多肽而言，針對己二酰-7-ADCA的體外/3-內(nèi)酰胺酰化酶活性提高了至少1.5倍，更優(yōu)選地，至少2倍，更優(yōu)選地，至少2.5倍，更優(yōu)選地，至少3倍，更優(yōu)選地，至少4倍，更優(yōu)選地，至少5倍，更優(yōu)選地，至少6倍，更優(yōu)選地，至少7倍，更優(yōu)選地，至少8倍，更優(yōu)選地，至少9倍，更優(yōu)選地，至少10倍，更優(yōu)選地，至少11倍，并且，其中，所述突變體II型/S-內(nèi)酰胺酰化酶至少在選自第161、270、296、442和589位構(gòu)成的組或第10、29、274、280、314、514、645、694、706和726位構(gòu)成的組或第10、29、161、270、274、280、296、314、442、514、589、645、694、706和726位構(gòu)成的組或第10、29、270、274、280、442、514、589、645、694禾n726構(gòu)成的組的氨基酸位置上經(jīng)過修飾，其中采用了尸wt^omomw的SE83-acy11?；傅陌被嵝蛄?SEQIDNO:l)的氨基酸位置編號。本發(fā)明優(yōu)選提供了下述突變體II型/3-內(nèi)酰胺?；福涫蔷哂蠭I型3-內(nèi)酰胺?；富钚缘哪Ｐ投嚯牡淖凅w，其中，所述突變體II型/3-內(nèi)酰胺?；钢辽僭诘?0位或至少在第29位，至少在第161位或至少在第270位或至少在第274位或至少在第280位或至少在第296位或至少在第314位或至少在第442位或至少在第514位或至少在第589位或至少在第645位或至少在第694位或至少在第706位或至少在第726位經(jīng)過修飾，其中采用了/^t^omo"os的SE83-acy11?；傅陌被嵝蛄?SEQIDNO:1)的氨基酸位置編號。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，提供了在第161位或第296位具有單種修飾的突變體n型/3-內(nèi)酰胺酰化酶。本發(fā)明還提供了下述突變體II型/3-內(nèi)酰胺酰化酶，其是具有II型&內(nèi)酰胺酰化酶活性的模型多肽的變體，其中，所述突變體II型/3-內(nèi)酰胺?；钢辽僭谖恢?61+270的組合或至少在位置161+296的組合或至少在位置161+442的組合或至少在位置161+589的組合或至少在位置270+296的組合或至少在位置270+442的組合或至少在位置270+589的組合或至少在位置296+442的組合或至少在位置296+589的組合或至少在位置442+589的組合或至少在位置161+270+296的組合或至少在位置161+270+442的組合或至少在位置161+270+589的組合或至少在位置161+296+589的組合或至少在位置296+442+589的組合或至少在位置161+296+442的組合或至少在位置161+296+589的組合或至少在位置296+442+589的組合或至少在選自161、270、296、442和589構(gòu)成的組的4個位置的任何組合或至少在位置161、270、296、442和589的組合處經(jīng)過修飾，并且，其中，所述突變體II型/3-內(nèi)酰胺?；缚赡茉诔诉@些位置或前述所有可能的其組合處之外的其它氨基酸位置具有修飾，其中采用了i^z^o,ms的SE83-acy11?；傅陌被嵝蛄?SEQIDNO:l)的氨基酸位置編號。本文中使用的具有II型/5-內(nèi)酰胺?；富钚缘哪Ｐ投嚯倪x自由下列多肽構(gòu)成的組具有II型^-內(nèi)酰胺?；富钚郧覂?yōu)選具有SEQIDNO:1的氨基酸序列(即，/^Wo附w^的種SE83的SE83-acy11酰化酶)或具有SEQIDNO:2的氨基酸序列(即，i^wdomo"o的種N176的N176?；?或具有SEQIDNO:3的氨基酸序列(即，5revwm/z>womw&>w>mtoV22的V22?；?的多肽和具有與SEQIDNO:1有至少70%,優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%的百分比同一性的氨基酸序列，或具有與SEQIDNO:2有至少70%，優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%的百分比同一性的氨基酸序列，或具有與SEQIDNO:3有至少70%，優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%的百分比同一性的氨基酸序列的且具有II型/5-內(nèi)酰胺?；富钚缘亩嚯?。作為用于本發(fā)明的具有II型/3-內(nèi)酰胺?；富钚缘哪Ｐ投嚯亩裕鼉?yōu)選的是具有II型/S-內(nèi)酰胺酰化酶活性，并且具有SEQIDNO:1的氨基酸序列或具有SEQIDNO:2的氨基酸序列或具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的多肽。作為具有II型/3-內(nèi)酰胺?；富钚缘哪Ｐ投嚯亩裕顑?yōu)選的是Pseudomonas的SE83-acyII?；?SEQIDNO:1)。本發(fā)明優(yōu)選提供了選自下述組的模型II型/3-內(nèi)酰胺?；傅耐蛔凅w，所述組由具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的?；负途哂蠸EQIDNO:2的氨基酸序列的?；负途哂蠸EQIDNO:3的氨基酸序列的?；?，以及具有與SEQIDNO:1有至少70%，優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%的百分比同一性的氨基酸序列，或具有與SEQIDNO:2有至少70%，優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%的百分比同一性的氨基酸序列，或具有與SEQIDNO:3有至少70。/。，優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%的百分比同一性的氨基酸序列且具有II型/5-內(nèi)酰胺?；富钚缘亩嚯臉?gòu)成，并且，所述突變體具有至少在第10位或至少在第29位，至少在第161位或至少在第270位或至少在第274位或至少在第280位或至少在第296位或至少在第314位或至少在第442位或至少在第514位或至少在第589位或至少在第645位或至少在第694位或至少在第706位或至少在第726位上的修飾。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了下述突變體II型/5-內(nèi)酰胺酰化酶，其在第161位或第296位具有單種修飾，其中采用了i^o^owomw的SE83-acylI酰化酶的氨基酸序列(SEQIDNO:l)的氨基酸位置編號。在氨基酸位置上的修飾可包含另外的氨基酸(選自天然存在的20種L-氨基酸的組，見表l)的取代?；蛘?，氨基酸位置上的修飾可包含所述位置上氨基酸的缺失。此外，氨基酸位置上的修飾可包含對所述氨基酸C-末端側(cè)或N-末端側(cè)一個或多個氨基酸的取代。表l<table>complextableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>本發(fā)明的突變體II型/3-內(nèi)酰胺?；?，優(yōu)選地，選自具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的?；负途哂蠸EQIDNO:2的氨基酸序列的酰化酶和具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的?；傅哪Ｐ虸I型/3-內(nèi)酰胺?；傅耐蛔凅w可能攜帶一種或多種下述修飾第10位上的谷氨酸(SEQIDNO:l)或丙氨酸(SEQIDNO:2和SEQIDNO:3)被帶正電荷的氨基酸殘基(例如賴氨酸或精氨酸)或具有o;-螺旋形成的構(gòu)象偏好的小氨基酸殘基(例如丙氨酸)取代，優(yōu)選被賴氨酸取代；第29位上的絲氨酸被具有芳香族(樣)側(cè)鏈的氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和組氨酸)或具有更大的不帶電荷的極性側(cè)鏈或帶正電荷的側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸和賴氨酸)取代，優(yōu)選被天冬酰胺或苯丙氨酸取代；.第161位上的亮氨酸被更小且更具極性的氨基酸(例如蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸和半胱氨酸)或在？11=9左右?guī)д姾傻陌被?例如精氨酸和賴氨酸)取代，優(yōu)選被絲氨酸或蘇氨酸或甘氨酸取代，最優(yōu)選被蘇氨酸取代；第274位上的組氨酸被至少在側(cè)鏈7位含有碳、氧或硫原子并且尺寸比組氨酸要小的氨基酸殘基(例如亮氨酸、異亮氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、纈氨酸和脯氨酸)取代，優(yōu)選被亮氨酸、異亮氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸取代；第280位上的精氨酸被由負(fù)電荷取代了正電荷的氨基酸殘基(例如天冬氨酸和谷氨酸)或被具有不分支且不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸殘基(例如谷氨酰胺、天冬酰胺和絲氨酸)取代，優(yōu)選被谷氨酰胺和天冬酰胺取代，最優(yōu)選被谷氨酰胺取代；第296位上的組氨酸被帶電荷的或極性的氨基酸或能代替模型?；钢幸延械逆I合到組氨酸殘基的N-5或N-e原子上的氫鍵的氨基酸殘基取代，例如，被天冬酰胺和谷氨酰胺取代，優(yōu)選被谷氨酰胺取代；第314位上的異亮氨酸被具有/5-分支的更小的氨基酸殘基(例如纈氨酸)或具有中等大小的極性側(cè)鏈的氨基酸殘基(例如谷氨酰胺、天冬酰胺、絲氨酸和蘇氨酸)取代，優(yōu)選被纈氨酸或谷氨酰胺取代；第442位上的谷氨酸被沒有疏水側(cè)鏈或具有小疏水側(cè)鏈的氨基酸殘基(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸和異亮氨酸)取代，優(yōu).選被甘氨酸取代；第514位上的脯氨酸被具有更具極性和/或更具柔性的側(cè)鏈(能帶來額外的氫鍵)的氨基酸殘基(例如谷氨酰胺、天冬酰胺、蘇氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)取代，優(yōu)選被谷氨酰胺取代；第589位上的精氨酸被在某些環(huán)境下能保持正電荷的氨基酸殘基(例如組氨酸和賴氨酸)或被具有能形成氫鍵的芳香族側(cè)鏈的氨基酸殘基(例如酪氨酸和色氨酸)或被能代替模型酰化酶中己有的鍵合到組氨酸殘基的N-S或N-e原子上的氫鍵的氨基酸殘基(例如天冬酰胺和谷氨酰胺)取代，優(yōu)選被組氨酸取代；第645位上的丙氨酸被具有對0-鏈形成的增加的偏好的小氨基酸殘基(例如蘇氨酸、纈氨酸、絲氨酸、半胱氨酸和亮氨酸)取代，優(yōu)選被蘇氨酸取代；第694位上的天冬酰胺被具有小于天冬酰胺的側(cè)鏈的氨基酸殘基(例如丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、纈氨酸和甘氨酸)取代，優(yōu)選被蘇氨酸取代；第706位上的酪氨酸被沒有側(cè)鏈或具有比亮氨酸小的側(cè)鏈的氨基酸殘基(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸和脯氨酸)取代，優(yōu)選被甘氨酸取代；第726位上的纈氨酸被具有更大疏水側(cè)鏈的氨基酸殘基(例如異亮氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸)取代，優(yōu)選被異亮氨酸取代。本發(fā)明的高度優(yōu)選的實(shí)施方式是選自下述組的模型II型/3-內(nèi)酰胺酰化酶的突變體，所述組由具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的酰化酶和具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的?；负途哂蠸EQIDNO:3的氨基酸序列的?；?，以及具有與SEQIDNO:1有至少70%，優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%的百分比同一性的氨基酸序列，或具有與SEQIDNO:2有至少70。/c)，優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%的百分比同一性的氨基酸序列，或具有與SEQIDNO:3有至少70。/。，優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%,更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%的百分比同一性的氨基酸序列且具有II型^-內(nèi)酰胺?；富钚缘亩嚯臉?gòu)成，并且，所述突變體攜帶下述修飾中之一H296Q、L161G、L161S或L161T。本發(fā)明的更加高度優(yōu)選的實(shí)施方式是選自下述組的模型II型/3-內(nèi)酰胺?；傅耐蛔凅w，所述組由具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的?；负途哂蠸EQIDNO:2的氨基酸序列的酰化酶和具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的酰化酶，以及具有與SEQIDNO:1有至少70%，優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%的百分比同一性的氨基酸序列，或具有與SEQIDNO:2有至少70%，優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%的百分比同一性的氨基酸序列，或具有與SEQIDNO:3有至少70%，優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%的百分比同一性的氨基酸序列且具有II型^-內(nèi)酰胺?；富钚缘亩嚯臉?gòu)成，并且，所述突變體攜帶位置上突變。最優(yōu)選的是下述突變體?；福湓谙率?個位置的組合處具有修飾[161+10]、[161+29]或[161+694]或[161+726]或[161+274]或[161+706]或[161+442]或[161+589]或[161+314]，或在下述3個位置的組合處[161+29+274]、[161+29+706]、[161+29+514]、[161+274+589]或[161+274+706]，或在下述4個位置的組合處[161+29+274+726]、[161+274+280+314]，或在下述5個位置的組合處[161+29+274+314+694]、[161+274+280+514+726]，或在下述6個位置的組合處具有修飾[161+29+280+314+645+726]。本發(fā)明優(yōu)選提供了/^wcfomo"M的SE83-acy11?；?SEQIDNO:1)的突變體，其具有至少在位置L161+M270的組合上或至少在位置L161+H296的組合上或至少在位置L161+E442的組合上或至少在位置L161+R589的組合上或至少在位置M270+H296的組合上或至少在位置M270+E442的組合上或至少在位置M270+R589的組合上或至少在位置H296+E442的組合上或至少在位置H296+R589的組合上或至少在位置E442+R589的組合上或至少在位置L161+M270+H296的組合上或至少在位置L161+M270+E442的組合上或至少在位置L161+M270+R589的組合上或至少在位置L161+H296+R589的組合上或至少在位置H296+E442+R589的組合上或至少在位置L161+H296+E442的組合上或至少在位置L161+H296+R589的組合上或至少在位置H296+E442+R589的組合上或至少在選自L161、M270、H296、E442和R589構(gòu)成的組的4個位置的任何組合上或至少在位置L161、M270、H296、E442禾nR589的組合上的修飾，并且，其中，所述突變體n型/3-內(nèi)酰胺酰化酶可能在除了這些位置或前述所有可能的其組合處之外的其它氨基酸位置上具有修飾。本發(fā)明的高度優(yōu)選的實(shí)施方式是實(shí)施例中表2-5的尸化i^/omwzosSE83-Acy11突變體。在第二個方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的突變體II型/3-內(nèi)酰胺?；傅亩嗪塑账?。本發(fā)明還提供了編碼所述突變體II型/3-內(nèi)酰胺?；傅腶-亞基的多核苷酸以及編碼所述突變體II型/3-內(nèi)酰胺?；傅?5-亞基的多核苷酸。WO2005/014821在第8頁和第9頁公開編碼SE83-組的?；傅幕蚓幋a由a-亞基、間隔肽和^-亞基(按該順序)構(gòu)成的多肽。在宿主細(xì)胞中經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄和翻譯之后，源自/^ew&mo"Msp.SE83的?；敢源笮榇蠹s84kDa的非活性單鏈多肽的形式產(chǎn)生。之后，SEQIDNO:1的氨基酸序列中第230和第231位以及第239和第240位上的氨基酸之間發(fā)生兩次自消化，這導(dǎo)致除去了由9個氨基酸構(gòu)成的間隔肽，并將其分離為25kDa的a-亞基和58kDa的^-亞基。一個a-亞基和一個/S-亞基通過疏水相互作用結(jié)合，形成大約83kDa的具有酰化酶活性的異二聚體。如技術(shù)人員所公知的，編碼N-末端甲硫氨酸的第一個密碼子(ATG)是在原核生物中進(jìn)行蛋白合成期間翻譯起始所必需的。甲硫氨酸在翻譯后被去除。根據(jù)本發(fā)明的編碼突變體II型/3-內(nèi)酰胺?；富騩;-亞基或/5-亞基的多核苷酸可以是編碼根據(jù)本發(fā)明的合適的氨基酸序列的任何多核苷酸?；蛘?，本發(fā)明的多核苷酸可包含這樣的編碼序列，其中，針對多種氨基酸的密碼子使用源自尸化wt/omoww中的密碼子使用。例如，可對密碼子使用加以改變，使其適合將或已用編碼改變的n型/3-內(nèi)酰胺酰化酶的DNA片段轉(zhuǎn)化的特定宿主細(xì)胞的密碼子使用。在第三個方面，本發(fā)明提供了包含前文定義的本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體或表達(dá)盒。在第四個方面，本發(fā)明提供了經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其是用本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的表達(dá)載體或表達(dá)盒轉(zhuǎn)化過的。經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可用于生產(chǎn)本發(fā)明的突變體II型/3-內(nèi)酰胺酰化酶。用于生產(chǎn)本發(fā)明的突變體II型/5-內(nèi)酰胺酰化酶的宿主細(xì)胞優(yōu)選是本領(lǐng)域已知能細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)高效生產(chǎn)蛋白或酶的那些宿主細(xì)胞，例如，微生物，例如真菌、酵母和細(xì)菌。優(yōu)選的宿主細(xì)胞的例子包括但不限于下述屬:J，/^'〃us(例如J.、A)、尸em'c/ffi訓(xùn)(例如尸.emeraom'Z、尸.cA>wogewwm)、jSaccAaram少ce51(例如5*.cerevz'w'ae)、X7w_yverom_yc&s(例如尤/acto)、5aa'〃ws(例如及ra6rifc、5.//c/zem》/T^、及)、^&c/zm'c/n'a(五.co/z')、》，畫少c&s1(例如51c/avw/ZgemsO、Pseudomonas。在第五個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)本發(fā)明的突變體n型/5-內(nèi)酰胺?；傅墓に?，所述工藝包括在有益于生產(chǎn)突變體擴(kuò)環(huán)酶的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及可選地，回收所述突變體擴(kuò)環(huán)酶。在第六個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)感興趣的脫?；?3-內(nèi)酰胺化合物的工藝，所述工藝包括使用本發(fā)明的突變體II型/3-內(nèi)酰胺酰化酶對感興趣的/5-內(nèi)酰胺化合物的?；绑w進(jìn)行脫?；牟襟E。感興趣的脫?；?3-內(nèi)酰胺化合物可以是天然存在的青霉素或頭孢菌素的衍生物，例如，6-APA、7-ACA、7-ADCA、7-ADAC、7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢霉素核-4-羧酸(例如WO2004/106347)等。優(yōu)選地，感興趣的脫?；?3-內(nèi)酰胺化合物是7-ADCA或7-ACA，最優(yōu)選是7-ADCA。感興趣的/5-內(nèi)酰胺化合物的?；绑w可具有屬于二羧酸構(gòu)成的組的?；?。優(yōu)選的酰基是琥珀酰基、戊二?；?、己二?；?、a-酮己二?；桶被憾；８鼉?yōu)選的是己二?；桶被憾；叨葍?yōu)選的是己二?；?yōu)選的感興趣的^-內(nèi)酰胺化合物的?；绑w是己二酰-7-ADCA、己二酰-7-ACA、氨基己二酰-7-ADCA和氨基己二酰-7-ACA，后者作為CEFC已知；最優(yōu)選的是己二酰-7-ADCA。本發(fā)明用于生產(chǎn)感興趣的脫?；痠S-內(nèi)酰胺化合物的工藝可以以分批模式進(jìn)行，其中，突變體II型/3-內(nèi)酰胺酰化酶在包含感興趣的/3-內(nèi)酰胺化合物的?；绑w的溶液中以溶解狀態(tài)使用。更優(yōu)選地，突變體n型/3-內(nèi)酰胺酰化酶作為被固定的形式使用。其好處在于，完成脫酰基化反應(yīng)后可回收突變體n型/5-內(nèi)酰胺?；?，并將其重新用于進(jìn)一步的脫酰基化反應(yīng)。以這種方式，使用突變體n型/5-內(nèi)酰胺?；傅某杀究娠@著降低，由此增加脫?；慕?jīng)濟(jì)吸引力。用于脫?；磻?yīng)的條件以及對酶的固定是現(xiàn)有技術(shù)已知的(例如，Kallenberg，A丄^a/.Adv.Synth.Catal.(2005)，347,905-926)。在第七個方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的突變體II型/3-內(nèi)酰胺酰化酶用于生產(chǎn)感興趣的脫?；?3-內(nèi)酰胺化合物的工藝中的用途，所述工藝包括對感興趣的/3-內(nèi)酰胺化合物的?；绑w進(jìn)行脫?；牟襟E。感興趣的脫?；?3-內(nèi)酰胺化合物可以是天然存在的青霉素或頭孢菌素的衍生物，例如，6-APA、7-ACA、7-ADCA、7-ADAC、7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢霉素核-4-羧酸等。優(yōu)選地，感興趣的脫酰基化^-內(nèi)酰胺化合物是7-ADCA或7-ACA，最優(yōu)選是7-ADCA。感興趣的卩-內(nèi)酰胺化合物的?；绑w可具有屬于二羧酸構(gòu)成的組的?；?yōu)選的?；晴牾；?、戊二?；⒓憾；?、a-酮己二?；桶被憾；?。更優(yōu)選的是己二酰基和氨基己二酰基，高度優(yōu)選的是己二?；?。最優(yōu)選的感興趣的/3-內(nèi)酰胺化合物的?；绑w是己二酰-7-ADCA、己二酰-7-ACA、己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢霉素核-4-羧酸、a-酮己二酰-7-ADCA、a-酮己二酰-7-ACA、氨基己二酰-7-ADCA和氨基己二酰-7-ACA，后者作為CEFC已知。本發(fā)明用于生產(chǎn)感興趣的脫?；?3-內(nèi)酰胺化合物的工藝可以以分批模式進(jìn)行，其中，突變體II型/5-內(nèi)酰胺?；冈诎信d趣的/3-內(nèi)酰胺化合物的?；绑w的溶液中以溶解狀態(tài)使用。更優(yōu)選地，突變體II型^-內(nèi)酰胺?；敢员还潭ǖ男问绞褂?。材料和方法制備酰化酶將具有wt基因或突變體基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliTop10細(xì)胞(Invitrogen)。使用20ml2xTY培養(yǎng)基(含有50jtig/mlZeocine)，在37。C和280rpm下，在100ml瓶中接種細(xì)胞。24小時后，以1:1000向具有100ml2xTY培養(yǎng)基、50嗎/mlZeocine和0.05%阿拉伯糖的瓶中接種50pl培養(yǎng)物，在25°C和280rpm下培養(yǎng)。對培養(yǎng)物進(jìn)行離心，冷凍于-20°C。為制備不含細(xì)胞的提取物，將沉淀團(tuán)重新懸浮于提取緩沖液(50mMTris/HCL、0.1mg/mlDNAsel、2mg/mlLysozyme、10mMDTT(二硫蘇糖醇)、5mMMgS04)中，并進(jìn)行孵育。30分鐘后，對提取物進(jìn)行離心，含有酰化酶活性的上清液被用于進(jìn)行活性測量。使用SDS-PAGE凝膠電泳和分析性HPLC尺寸排除色譜(在TSK3000SWxl柱上，用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)作為洗脫劑來進(jìn)行)來測定酰化酶含量。應(yīng)用的色譜條件流速1.0ml/分鐘，在280nm處檢測。通過比較觀察到的?；傅姆宓拿娣e，可對不同樣品的蛋白含量進(jìn)行比較。使用154350(M".cm—1)的摩爾消光系數(shù)，從OD280來計(jì)算?；傅鞍缀?。HPLC色譜有其它峰的情況下，針對其它峰的作用對樣品的E280值加以校正。純化將來自100ml培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀團(tuán)重新懸浮于1ml20mMTrispH8中。在冰上以10p的振幅進(jìn)行9x10秒的超聲波處理(Soniprep150I-BU03)后，在微離心管中于14000ipm和4。C下對細(xì)胞懸浮液進(jìn)行5分鐘的離心。用0.1MHC1將上清液調(diào)節(jié)為pH5.3-5.4之后，對其進(jìn)行離心，以除去沉淀。隨后，用NaOH將上清液滴定回pH=8。大約100-400pl被加到1mlMonoQ柱(用含有10%NaCl的20mMTrispH8平衡過)上。洗脫期間按照下文所述來混合緩沖液A(20mMTrispH8)和緩沖液B(20mMTrispH8+1MNaCl):0-1分鐘，10%B/90%A;1-5分鐘，20%B/80%A;5-9分鐘，40%B/60%A;9-12分鐘，60%B/40%A;12-15分鐘，100%B。收集含有?；富钚缘姆寮壏?，加到凝膠過濾柱TSKGel3000SWxl上，該柱已用100mM磷酸鈉緩沖液pH7平衡過。收集峰級分，儲藏起來以備后用。試劑可按照WO9848037所述，通過酶促合成，從己二酸和7-ADCA來制備己二酰-7-ADCA。此外，可按照Shibuyaetal.在Agric.Biol.Chem.,1981:45(7),1561-1567中所述，但從己二酸酐開始(代替戊二酸酐)，通過化學(xué)合成來制備己二酰-7-ADCA。在合適的緩沖液中制備己二酰-7-ADCA底物的8%(w/v)C液，用4NNaOH將其調(diào)節(jié)至想要的pH。通過將200mg4-(二甲基氨基)-苯甲醛(p-DMBA)溶解于100ml檸檬酸(溶解于1升乙醇中的315.5g檸檬酸單水合物)中，來新鮮制備顏料試劑。在0.2MCHES緩沖液(2-(N-環(huán)己基氨基)乙磺酸)中，于pH8.0至pH10.0的范圍內(nèi)進(jìn)行活性測量，如果需要的話，用4NHC1或4NNaOH將所述緩沖液調(diào)節(jié)至想要的pH。測量?；富钚詫?80pi合適的緩沖液與200pi處于相應(yīng)緩沖液中的底物貯液和20)Lil酶溶液混合，在想要的溫度下孵育20分鐘，如無特別指明的話，通常是在室溫下孵育。加入600pi顏料試劑來停止反應(yīng)。室溫下10分鐘后，在415nm處測量吸光度。通過在加入酶之前就向檢驗(yàn)體系中加入顏料溶液來進(jìn)行空白測量。?；富钚员挥?jì)算為每分鐘光密度(OD)的增加(SOD/分鐘)。為計(jì)算絕對活性，使用每升0.1至1g7-ADCA范圍內(nèi)的7-ADCA校正線。Km測定和pH曲線。按照所述的檢驗(yàn)來進(jìn)行Km測定。但是，己二酰-7-ADCA濃度在0.5至4%(w/v)己二酰-7-ADCA之間變化。實(shí)施例實(shí)施例1SE83ACYii突變體的?；富钚杂眉憾?7-ADCA作為底物，在pH=8.5和pH=9.5時測量突變體的?；富钚?。結(jié)果示于表2中。表2:野生型和突變體?；笇憾?7-ADCA的相對活性，將<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>在pH=8.5以及pH=9.5時，突變體的活性較之野生型?；革@著更高。此外，當(dāng)將pH=9.5時的活性與pH=8.5時的活性相比時，明顯可見，突變體?；冈趐H9.5的活性較之野生型相對更高。突變體的pH活性曲線向更高的pH遷移，這使得這些突變體特別適合在升高的pH下使用。這點(diǎn)特別重要，因?yàn)檗D(zhuǎn)化產(chǎn)率將在更高的pH下增加，這是由于熱力學(xué)平衡更進(jìn)一步朝向完成水解反應(yīng)的方向。鑒于在己二酰-7-ADCA向7-ADCA和己二酸轉(zhuǎn)化的過程中，后者的濃度將增加，因此，產(chǎn)物抑制可能會降低在初始速率條件下測量到的突變體的提高效果。因此，在存在1.5%(w/v)的己二酸時，測量野生型和突變體?；傅幕钚?。表3顯示，在這些條件下，在pH=8.5以及pH=9.5時，突變體的活性較之野生型也顯著更高。這些突變體的pH活性曲線沒有遷移到更高的pH。使用己二酰-7-ADCA作為底物，在pH-8.6、pH=9.1禾卩pH=9.5時，存在1.5%(w/v)的己二酸時，測定野生型和突變體?；傅孽；富钚?。結(jié)果如表4所示。表4顯示，在pl^8.6、pH=9.1和pH=9.5時，突變體的活性較之野生型?；革@著更高。當(dāng)將pH=9.1時的活性提高與pH=8.6時的活性提高相比時，明顯可見，突變體酰化酶在pH9.1的活性較之野生型提高更顯著。突變體的pH活性曲線向更高的pH遷移，這使得這些突變體特別適合在升高的pH下使用。當(dāng)將pH-9.5與pH-8.6相比時，大多數(shù)突變體酰化酶的活性相對野生型而言在pH=9.5時仍比pH=8.5時提高更多。表3:野生型和突變體?；笇憾?7-ADCA的相對活性，將pH=8.5時野生型的活性設(shè)定為1。括號中是pH=9.5時相對于野生型活性的活性。在室溫下進(jìn)行檢驗(yàn)。在存在4%(w/w)己二酰-7-ADCA時測量起始底物濃度。在存在1.5%(w/v)己二酸時測量起始活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表4:野生型和突變體?；笇憾?7-ADCA的相對活性，將pH=8.6時野生型的活性設(shè)定為1。括號中是分別在pH=9.1和pH=9.5時相對于野生型活性的活性。在室溫下進(jìn)行檢驗(yàn)。在存在2%(w/w)己二酰-7-ADCA時測量起始底物濃度。在存在1.5。/。(w/v)己二酸時測量起始活性。酶/突變體<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>實(shí)施例2通過對SE83ACYii突變體的km測量指示底物親和性表5顯示了針對多種突變體測得的相對于野生型的Km惶。Michaelis常數(shù)KM代表當(dāng)酶以其最大速度的50%運(yùn)作時的底物濃度。在低于Km的底物濃度下，酶會更慢，而在高于Km的底物依度下，酶會運(yùn)作得更快，直到在高底物濃度下酶完全飽和并且以最大速度運(yùn)作。在酶促轉(zhuǎn)化的終點(diǎn)(此時底物耗盡)，低km是關(guān)鍵的，以保持相當(dāng)?shù)幕钚?。在突變體的相對km值〈1.00時，這表示在更低的底物濃度(例如在轉(zhuǎn)化終點(diǎn))時，突變體相對野生型而言在保持相對較高的活性方面具有優(yōu)勢。表5:以相對KM值表示的相對底物親和性。使用前文所述的檢驗(yàn)來進(jìn)行Km測定。己二酰-7-ADCA的濃度在0.5至4。/。己二酰-7-ADCA之間變化。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實(shí)施例3被固定的SE83ACYii突變體的?；富钚园凑誛O97/04086所述，使用明膠和殼多糖作為膠凝劑，戊二醛作為交聯(lián)劑，來進(jìn)行固定。通過在溫度和pH受控的100ml反應(yīng)器中進(jìn)行對己二酰-7-ADCA的完全水解，來測量被固定的野生型?；负屯蛔凅w酰化酶的表現(xiàn)。以3.2。/。己二酰-7-ADCA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以使得能在想要的條件下在120分鐘內(nèi)獲得至少卯％的轉(zhuǎn)化的方式，來提供被固定的酶。在pKN8.8和30。C以及pH二9.5和40。C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化。用同樣的量(重量)的野生型和突變體?；竵磉M(jìn)行轉(zhuǎn)化。反應(yīng)期間，通過加入1MKOH溶液使pH保持恒定。被固定的?；傅幕钚员槐硎緸槊糠昼姷腒OHml數(shù)。在圖2a和圖2b中，顯示了作為轉(zhuǎn)化率函數(shù)的速率(其被表示為每分鐘的mlKOH)。在pH=8.8和30°C時取六次的平均。轉(zhuǎn)化的最初30%的數(shù)據(jù)不包括在內(nèi)，因?yàn)橄到y(tǒng)還沒有完全穩(wěn)定，使得數(shù)據(jù)大為發(fā)散。在pH=9.5和40°C時取兩次的平均。因此，變動更大。但是，計(jì)算出的斜率給出了對活性的良好指示。圖2a和圖2b顯示，整個轉(zhuǎn)化期間，突變體?；傅幕钚远硷@著更高。通過用同一批被固定的?；?，測量隨后20次180分鐘的轉(zhuǎn)化率，來測定被固定的?；傅姆€(wěn)定性。測量每次孵育中轉(zhuǎn)化的30至50%之間的速率。被固定的?；傅臍堄嗷钚栽诒疚闹斜欢x為相對于第一次孵育而言在第20次孵育時的活性。表6概括了結(jié)果。觀察到，特別是在能使水解反應(yīng)的動力學(xué)平衡遷移為更完全的轉(zhuǎn)化的條件下(高溫和高pH下)，經(jīng)突變?；傅姆€(wěn)定性較之野生型顯著提高。作為經(jīng)突變的?；傅倪@種更高的水解活性和更高的穩(wěn)定性的結(jié)果，每克經(jīng)突變的?；傅纳a(chǎn)能力也相當(dāng)大地增加。表6:在指出的條件下進(jìn)行20次轉(zhuǎn)化后的殘余活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>權(quán)利要求1.突變體II型β-內(nèi)酰胺酰化酶，其是具有II型β-內(nèi)酰胺酰化酶活性的模型多肽的變體，其中，所述突變體β-內(nèi)酰胺?；篙^之具有β-內(nèi)酰胺?；富钚缘乃瞿Ｐ投嚯亩裕槍憾?7-ADCA的體外β-內(nèi)酰胺?；富钚蕴岣吡酥辽?.5倍。2.突變體II型/3-內(nèi)酰胺?；?，其是具有II型^-內(nèi)酰胺?；富钚缘哪Ｐ投嚯牡淖凅w，其中，所述突變體II型/3-內(nèi)酰胺酰化酶至少在選自第10、29、161、270、274、280、296、314、442、514、589、645、694、706和726位構(gòu)成的組的氨基酸位置上經(jīng)過修飾，其中采用了尸"^/om訓(xùn)w的SE83-acylI?；傅陌被嵝蛄?SEQIDN0:1)的氨基酸位置編號。3.如權(quán)利要求1所述的突變體II型/3-內(nèi)酰胺酰化酶，其至少在選自第10、29、161、270、274、280、296、314、442、514、589、645、694、706和726位構(gòu)成的組的氨基酸位置上經(jīng)過修飾，其中采用了尸化i^omo"oy的SE83-acylI?；傅陌被嵝蛄?SEQIDNO:l)的氨基酸位置編號。4.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的突變體II型P-內(nèi)酰胺酰化酶，其中，具有/5-內(nèi)酰胺?；富钚缘乃瞿Ｐ投嚯倪x自下述組，所述組由尸Mwttomo"M的SE83-acylI?；?SEQIDNO:1)、來自"rew"&mo"twA'wZ肌to的N176(SEQIDNO:2)和來自^rew"A'mo"os^mf"wta！的V22酰化酶(SEQIDNO:3)以及具有與SEQIDNO:1有至少70%或與SEQIDNO:2有至少70%或與SEQIDNO:3有至少70%的百分比同一性的氨基酸序列的且具有II型^-內(nèi)酰胺?；富钚缘亩嚯臉?gòu)成。5.如權(quán)利要求4所述的突變體n型^-內(nèi)酰胺酰化酶，其中，所述模型肽是尸w^fomo"ay的SE83-acy11?；?SEQIDNO:1)。6.如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的突變體II型i8-內(nèi)酰胺?；福渲?，所述突變體n型^-內(nèi)酰胺?；冈诘?61位經(jīng)過修飾，優(yōu)選地，與選自由10、29、270、274、280、296、314、442、514、589、645、694、706和726構(gòu)成的組的位置上的至少一處其它修飾組合。7.編碼如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的突變體II型/3-內(nèi)酰胺酰化酶的多核苷酸。8.包含權(quán)利要求7所述的多核苷酸的表達(dá)載體或表達(dá)盒。9.經(jīng)權(quán)利要求7所述的多核苷酸或權(quán)利要求8所述的載體或盒轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。10.生產(chǎn)權(quán)利要求1-6所述的突變體II型^-內(nèi)酰胺酰化酶的工藝，所述工藝包括在有益于生產(chǎn)突變體II型/3-內(nèi)酰胺酰化酶的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞，以及可選地，回收所述多肽。11.生產(chǎn)感興趣的脫酰基化^-內(nèi)酰胺化合物的工藝，所述工藝包括使用權(quán)利要求l-6所述的突變體II型^-內(nèi)酰胺酰化酶對感興趣的/3-內(nèi)酰胺化合物的?；绑w進(jìn)行脫?；牟襟E。12.如權(quán)利要求ll所述的工藝，其中，所述感興趣的脫酰基化/3-內(nèi)酰胺化合物是6-APA、7-ACA、7-ADCA、7-ADAC或7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-頭孢霉素核-4-羧酸。13.如權(quán)利要求11或12所述的工藝，其中，所述感興趣的^-內(nèi)酰胺化合物的?；绑w具有屬于二羧酸構(gòu)成的組的酰基，優(yōu)選地，琥珀酰基、戊二?；?、己二酰基、o;-酮己二酰基和氨基己二?；?，更優(yōu)選地，己二?；?。14.如權(quán)利要求11-13中任意一項(xiàng)所述的工藝，其中，所述突變體II型內(nèi)酰胺酰化酶以被固定的形式使用。15.如權(quán)利要求1-6所述的突變體II型/3-內(nèi)酰胺酰化酶用于對感興趣的/3-內(nèi)酰胺化合物的?；绑w進(jìn)行脫?；挠猛尽?6.如權(quán)利要求15所述的用途，其中所述感興趣的/3-內(nèi)酰胺化合物是7-ADCA或7-ACA。17.如權(quán)利要求15或16所述的用途，其中，所述感興趣的/3-內(nèi)酰胺化合物的?；绑w屬于二羧酸構(gòu)成的組，優(yōu)選地，琥珀?；?、戊二?；?、己二酰基、a-酮己二酰基和氨基己二?；鼉?yōu)選地，己二酰基。18.權(quán)利要求15-17中任意一項(xiàng)所述的工藝，其中，所述突變體II型/3-內(nèi)酰胺?；敢员还潭ǖ男问绞褂?。全文摘要本發(fā)明涉及突變體II型β-內(nèi)酰胺?；福涫蔷哂蠭I型β-內(nèi)酰胺?；富钚缘哪Ｐ投嚯牡淖凅w，其中，突變體β-內(nèi)酰胺酰化酶較之具有β-內(nèi)酰胺?；富钚缘哪Ｐ投嚯亩?，針對己二酰-7-ADCA的體外β-內(nèi)酰胺酰化酶活性提高了至少1.5倍。文檔編號C12N9/80GK101351549SQ200680050115公開日2009年1月21日申請日期2006年12月28日優(yōu)先權(quán)日2005年12月28日發(fā)明者威廉·比杰勒威爾德,比昂卡·吉艾勒森,理查德·克爾曼,簡·米特斯卡·拉恩凡德申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司