一種化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測模型及其建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測模型及其建立方法，尤其設(shè)及一種小鼠胚胎 干細胞定向誘導(dǎo)分化為具有搏動能力的屯、肌細胞，并在所獲得的屯、肌細胞上建立化學(xué)品胚 胎毒性的識別和預(yù)測模型，并應(yīng)用于新化學(xué)品胚胎毒性的預(yù)測中。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，化學(xué)品的毒性數(shù)據(jù)多在實驗動物中獲得，如急性毒性試驗，亞急性毒性試 驗，慢性毒性試驗等。但是，開展動物實驗存在幾個不容忽視的問題；1.需要大量的財力， 2.實驗周期長，3.需要大量的實驗動物，4.因體內(nèi)影響因素較多，難W進行代謝和機制 研究。出于動物保護原則，Russell和Burch提倡"3R"原則，即減少（Reduction),優(yōu)化 化efinement)和替代化巧lacement)，無論是從科學(xué)角度還是從經(jīng)濟角度，毒理學(xué)替代法 對外源性化學(xué)物的危害評價及管理都有非常重要的意義。
[0003] 據(jù)歐洲化學(xué)品管理、評估和限制機構(gòu)（REACH)估計，接下來的15年中將會有30000 種化學(xué)品需要進行安全性測試，根據(jù)現(xiàn)有的測試指南，將犧牲7百萬只動物，其中約64%是 用于化學(xué)品的生殖和發(fā)育毒性評價；每檢測2000種新化合物的發(fā)育毒性，約需耗資6億歐 元。而新化合物的數(shù)目W每年1000種遞增，其中90%W上沒有安全性評價的數(shù)據(jù)。在該 一過程中，無論是動物的使用情況，還是測試過程中人力、物力、財力的消耗，如此巨大的數(shù) 字，讓人觸目驚屯、。
[0004] 我國幅員迂闊，人口眾多，因此在面臨評價化合物暴露導(dǎo)致的健康問題時情況將 比其他國家更為復(fù)雜。并且由于各地化合物種類、比例不同，在開展流行病學(xué)調(diào)查的時候重 點也不相同，加上工業(yè)快速發(fā)展、城市化進程加快的同時也帶來了新型污染物及其快速擴 散的問題。毒理學(xué)替代法的應(yīng)用與推廣同樣適用于我國的國情。
[0005]自1986年歐盟實施動物福利指導(dǎo)原則W來，歐盟大力支持替代法的發(fā)展與使用。 胚胎干細胞試驗巧ST)是經(jīng)過歐洲替代方法研究中屯、巧U化-ECVAM)驗證的一類用于預(yù)測 化合物潛在胚胎毒性的實驗方法。該方法充分利用了胚胎干細胞的分化潛能，設(shè)置分化的 觀察終點，結(jié)合細胞的一般毒理學(xué)數(shù)據(jù)，通過判別方程式對化合物的潛在胚胎毒性進行評 估和分級，從而實現(xiàn)對化合物的安全性評價，屬于一種測試方法的替代體系。借助EST，在 誘導(dǎo)的不同階段或不同的誘導(dǎo)方向進行化學(xué)品的暴露，可模擬反應(yīng)分化過程中化合物對機 體發(fā)育的影響，在毒性篩選、毒性祀器官確定、毒性作用機制等毒理學(xué)研究中具有獨特的優(yōu) 勢。隨著國際上干細胞生物學(xué)研究的不斷深化，胚胎干細胞模型也得到進一步發(fā)展，即利 用其分化潛能尋找祀器官或監(jiān)測分化過程中關(guān)鍵基因的表達，發(fā)現(xiàn)化合物對肝臟、肌肉、血 管、骨等器官組織的影響，通過選擇多個觀察終點，可W分別評估化合物對相應(yīng)器官組織的 潛在毒性。整個評估周期在10至21天之間，并且在整個實驗過程中都不需要用到活體的 動物，節(jié)約人力、物力、財力和時間，可重復(fù)性強，易于操作，符合國際上化合物毒性評價替 代研究的要求，因而引起廣泛的關(guān)注。
[0006]EST適用于從細胞水平分析發(fā)育過程，并判斷某因素是否具備胚胎毒物或致崎潛 能。目前，EST多選擇屯、肌細胞作為分化發(fā)育后的衡量指標，其原因有第一、屯、臟發(fā)育始于 胚胎發(fā)育早期，使得在體外通過誘導(dǎo)胚胎干細胞（簡稱ES或者ESC)分化為屯、肌細胞模擬 體內(nèi)的屯、臟發(fā)育過程較易實現(xiàn)；第二、屯、臟發(fā)育是一個高度特化的過程，對發(fā)育過程的細微 干擾即可導(dǎo)致屯、臟發(fā)育出現(xiàn)異常，因而具備較高的靈敏度；第S、由于ES誘導(dǎo)分化的屯、肌 細胞具有搏動能力，作為觀測終點具有良好的可視性。
[0007] 為了驗證EST的準確性，Scholz進行了W下實驗；1.受試物對分化的3T3成纖維 細胞的細胞毒性效應(yīng)；2.受試物對未分化的ES細胞的細胞毒性效應(yīng)；3.受試物對ES細胞 向屯、肌細胞分化的影響。W相應(yīng)的體內(nèi)試驗資料作為根據(jù)，在10種受試物中，100%準確地 判斷了非胚胎毒性物質(zhì)，88. 9%準確地判斷了弱胚胎毒性物質(zhì)，91. 7%準確地判斷了強胚 胎毒性物質(zhì)。在此實驗數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，結(jié)合受試物的體內(nèi)試驗信息，Genschow等建立了判別 方程模型，對化合物的胚胎毒性開展=級預(yù)測，即判斷化合物為無胚胎毒性、低胚胎毒性或 者高胚胎毒性。EST具備篩選化合物胚胎毒性的功能，因此被世界各大化學(xué)品制造商、藥廠 等用于對新原料或新藥的篩選及胚胎毒性的安全性測試。
[0008] 國際上許多致力于優(yōu)化EST的科學(xué)家通過大量的研究，提出了EST的標準化操作 流程中存在W下兩點亟待優(yōu)化的地方；第一、EST是基于ES細胞系D3建立和推廣的，建議 同時采用其他ES細胞系建立模型，保證評價結(jié)果的準確性；第二、觀測屯、肌細胞的搏動受 主觀因素影響較大，因此建議W分子生物學(xué)指標作為觀測終點，W提高準確度。
[0009] 目前，除了D3細胞系外，在其他的研究中，J1，R1，E14TG2a，E14. 1，DBA/llacZ等 ES細胞系也被使用，并發(fā)現(xiàn)了不同細胞系對誘導(dǎo)分化的敏感性不同，并造成了分化為具搏 動能力屯、肌的時間存在差異。然而，該些已使用的ES細胞系核型均為XY，即都是"雄性"的 ES。當前尚無利用核型為XX的ES細胞系建立胚胎毒性評價模型并開展應(yīng)用的先例。
[0010] 利用分子生物學(xué)手段檢測關(guān)鍵的特異性基因在ES誘導(dǎo)的屯、肌細胞中的表達可更 精確地建立劑量一效應(yīng)曲線，在Seiler等人的實驗中，強調(diào)了利用分子觀測終點獲得受試 化合物抑制屯、臟發(fā)育的相關(guān)數(shù)據(jù)，獲得了良好的劑量一效應(yīng)曲線W及與傳統(tǒng)觀測終點在評 價結(jié)果中的一致性。然而，當前已有的EST僅采用編碼屯、肌蛋白重鏈的基因Myh6作為分子 觀測終點，其他的基因的表達情況是否也能作為可用于EST預(yù)測化學(xué)品胚胎毒性的分子觀 測終點，仍待確證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 為了彌補上訴現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明公開了一種化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測模 型，包括細胞種類；該細胞種類包括核型為XX的SP3ES細胞誘導(dǎo)分化出的屯、肌細胞。
[001引進一步地，還包括分子觀測終點；該分子觀測終點包括Myl4。
[0013] 進一步地，該細胞種類還包括核型為XY的R1ES細胞誘導(dǎo)分化出的屯、肌細胞。
[0014] 進一步地，該分子觀測終點還包括cTnT和/或Myh6。
[00巧]進一步地，還包括Myl4的上游引物序列；AAGAAACCCGAGCCTAAGAAGG，和Myl4的下 游引物序列；TGGGTCAAAGGCAGAGTCCT。
[0016] 進一步地，還包括cTnT的上游引物序列；CAGAGGAGGCCAACGTAGAAG，cTnT的下游引 物序列；CTCCATCGGGGATCTTGGGT，Myh6 的上游引物序列；GCCCAGTACCTCCGAAAGTC和Myh6 的 下游引物序列；GCCTTAACATACTCCTCCTTGTC。
[0017] 本發(fā)明還揭示了如上所述的化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測模型的建立方法，其特征在于， 包括W下步驟：
[001引步驟一：小鼠胚胎成纖維細胞的分離和培養(yǎng)；
[001引步驟二：小鼠ES的體外擴增培養(yǎng)；
[0020] 步驟立；小鼠ES的核型分析及性別鑒定；
[0021] 步驟四：小鼠ES多能性的維持和鑒定；
[0022] 步驟五：小鼠ES體外誘導(dǎo)分化為屯、肌細胞；
[0023] 步驟六：小鼠ES誘導(dǎo)分化的屯、肌細胞的屯、肌特異性標志蛋白的免疫化學(xué)檢測；
[0024] 步驟^;：;小鼠ES誘導(dǎo)分化的屯、肌細胞的表達譜的Real-timePCR檢測；
[0025] 步驟八；模式化合物的選擇；選擇4種及W上模式化合物使得該模式化合物集合 包含強致崎性化合物、弱智崎性化合物、無致崎性化合物W及在雌雄性別中致崎性有所不 同的化合物；
[0026] 步驟九：模式化合物細胞毒性的檢測；獲得各模式化合物對細胞的半數(shù)致死劑量 1〔50;
[0027] 步驟十；模式化合物對ES分化能力的抑制效應(yīng)的檢測；獲得各模式化合物對ES 細胞分化的半數(shù)抑制劑量1町。的值；
[0028] 步驟十一；模式化合物胚胎毒性的評價：通過步驟九得到的ICg。和步驟十得到的 1町。分析各模式化合物對胚胎毒性的影響程度，建立得到所述化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測模型，從 而推廣到對其他化學(xué)品胚胎毒性的預(yù)測；
[0029] 所述ES包括SP3ES細胞。
[0030] 進一步地，還包括步驟十二；分子觀測終點和傳統(tǒng)觀測終點用于反映模式化合物 對ES分化能力的抑制作用下的相關(guān)性分析，即采用SPSS19. 0軟件的配對散點圖功能對分 子觀測終點和傳統(tǒng)觀測終點用于測量半數(shù)分化抑制能力間的相關(guān)性進行分析，同時計算決 定系數(shù)；當分子觀測終點和傳統(tǒng)觀測終點間決定系數(shù)大于0. 9時，分子觀測終點和傳統(tǒng)觀 測終點高度相關(guān)性；W此判斷所述化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測模型的準確性和有效性。
[0031] 進一步地，所述步驟六中所述的屯、肌特異性標志蛋白包括cTnT;所述步驟走中的 所述表達譜包括Myh6、Myl4和cTnT基因；所述步驟八中的所述模式化合物包括5-氣尿喀 晚、阿司匹林、嘲噪美辛、抗壞血酸、青霉素G;所述步驟四中包括WNIH3T3成纖維細胞為 對照；所述ES還包括R1ES細胞。
[0032] 進一步地，所述步驟九中獲得各模式化合物對3T3細胞和ES細胞的半數(shù)致死劑量 IC^3T3和ICwES;所述步驟十中獲得各模式化合物對ES細胞分化的半數(shù)抑制劑量1化。的 值；所述步驟十一中通過將所述ICw3T3、ICsnES和IDs。數(shù)據(jù)代