引起的抑制無需是完全抑制，只要其能被化驗檢測到 即可?？梢允褂肈LL-4功能的任何化驗，本文提供了一些示例。能夠被DLL-4抑制劑所抑 制或被DLL-4激動劑所增加的DLL-4功能的例子包括：癌細胞生長或凋亡（程序性細胞死 亡）等等。DLL-4抑制劑和DLL-4激動劑類型的例子包括但不限于：DLL-4結(jié)合多肽（例如 抗原結(jié)合蛋白（如：DLL-4抑制抗原結(jié)合蛋白））、抗體、抗體片段和抗體衍生物。
[0127] 術(shù)語"肽"、"多肽"和"蛋白"均指包括2個或以上相互以肽鍵連接的氨基酸殘基 的分子。這些術(shù)語涵蓋，例如，天然和人工蛋白、蛋白片段、蛋白序列的多肽類似物（例如突 變蛋白、變體蛋白或融合蛋白），以及翻譯后修飾蛋白，或共價或非共價修飾蛋白。肽、多肽 或蛋白可以是單體或聚合體。
[0128] 多肽（例如，抗體）的"變體"包括：相對于其他多肽序列而插入、刪除和/或取代 了一個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列。已公開的變體包括，例如，融合蛋白。
[0129] 多肽的"衍生物"是經(jīng)過化學(xué)修飾的多肽（例如，抗體），如通過連接另一個化學(xué)部 分（例如，聚乙二醇，或白蛋白，如人血清白蛋白）、磷酸化和糖基化。除非另有說明，否則術(shù) 語"抗體"除了指含有兩條全長的重鏈和兩條全長的輕鏈的抗體之外，還包括其衍生物、變 體、片段及突變蛋白，其示例如下所述。
[0130] "抗原結(jié)合蛋白"是包括以下部分的蛋白：與抗原結(jié)合的部分；以及可選地，允許 抗原結(jié)合部分采取促進抗原結(jié)合蛋白與蛋白的結(jié)合的構(gòu)型的支架或骨架部分?？乖Y(jié)合 蛋白的例子包括抗體、抗體片段（例如，抗體的抗原結(jié)合部分）、抗體衍生物和抗體類似物。 該抗原結(jié)合蛋白可以包括，例如，具有接枝的CDRs或CDRs衍生物的替代蛋白支架或人工 支架。所述支架包括但不限于，包含引入了突變（例如用于穩(wěn)定該抗原結(jié)合蛋白的三維結(jié) 構(gòu)的突變）的抗體衍生支架，以及包括例如生物可相容聚合物的全合成支架。例如參見： Korndorfer et al.，2003, Proteins:Structure，F(xiàn)unction，and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129 ;Roque et al.，2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654。此外，可以使用 多肽抗體模擬物（"PAMs")，以及基于以纖維蛋白連接素成分為支架的抗體模擬物的支架。
[0131] 抗原結(jié)合蛋白可以具有，例如，天然存在的免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)。"免疫球蛋白"是 四聚物分子。在天然存在的球蛋白中，每個四聚物由2對相同的多肽鏈組成，每對中有一條 "輕"（約25kDa)鏈和一條"重"鏈（約50-70kDa)。每條鏈的氨基末端部分包括約100-110或 以上氨基酸的可變區(qū)，主要負責(zé)抗原識別。每條鏈的羰基末端部分具有恒定區(qū)，主要負責(zé)效 應(yīng)子功能。人輕鏈歸類為K (kappa)或X (lambda)輕鏈；重鏈歸類為ii (mu)、A (delta)、 Y (gamma)、a (alpha)或 e (epsilon),分別令抗體的種型定義為]^、]^、]^、]^和]^。 優(yōu)選地，本申請公開的該抗DLL-4抗體的特征在于其重鏈和輕鏈氨基酸序列中的可變域序 列（％和V J。優(yōu)選抗體為VK-B8 (kIgG抗體）。在輕鏈和重鏈中，可變域和恒定域由約12 個或以上氨基酸的"J"區(qū)連接，其中重鏈還包括一個含約10個或以上氨基酸的"D"區(qū)。一般 請參見 Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W.，ed.，2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))。 每對輕/重鏈的可變域組成了抗體結(jié)合位點，因此一個完整的免疫球蛋白具有2個結(jié)合位 點。
[0132] "多特異抗體"是設(shè)別一種或多種抗原上的多個表位的抗體。此類型抗體的一個子 類為"雙特異抗體"，其識別相同或不同抗體上的兩個不同表位。
[0133] 若抗原結(jié)合蛋白在結(jié)合抗原（例如人DLL-4)時的解離常數(shù)為InM或以下，則稱其 與抗原"特異結(jié)合"。
[0134] "抗原結(jié)合域"、"抗原結(jié)合區(qū)"或"抗原結(jié)合位點"是指抗原結(jié)合蛋白上含有與抗原 相互作用的氨基酸殘基（或其他化學(xué)部分）并有利于該抗原結(jié)合蛋白對該抗原的特異性和 親和性的部分。對于與其抗原特異結(jié)合的抗體而言，這包括其至少一個⑶R域的至少一部 分。
[0135] "表位"是分子上連接抗原結(jié)合蛋白（例如，抗體）的部分。表位可以包括該分子 的非鄰近部分（例如，在多肽中，在多肽一級序列中并不相鄰但在該多肽的三級和四級結(jié) 構(gòu)中相互足夠靠近以被抗原結(jié)合蛋白結(jié)合的氨基酸殘基）。
[0136] 兩個多核苷酸或兩個多肽序列的"同源百分比"是用GAP電腦程序（GCG Wisconsin Package, versionlO. 3 (Accelrys, San Diego, Calif.)中的一部分）以其默認參數(shù)來比較 序列而確定的。
[0137] "宿主細胞"是可用于表達核酸的細胞。宿主細胞可以是原核細胞，例如E.coli ; 或真核細胞，例如真核單細胞（如酵母菌或其他真菌）、植物細胞（例如，煙草或番茄 植物細胞）、動物細胞（如人細胞、猴細胞、倉鼠細胞、小鼠細胞、大鼠細胞或昆蟲細胞） 或雜種細胞。宿主細胞的例子包括猴腎細胞C0S-7系（ATCC CRL 1651)(Gluzman et &1.，1981，〇611 23:175)、1細胞、(：127細胞、3了3細胞仏了0：〇(^163)、中國倉鼠卵巢（010) 細胞或其衍生物I (例如Veggie CH0)和在無血清培養(yǎng)基上生長的相關(guān)細胞系（Rasmussen et al.，I"8, Cytotechnology 28:31)，或 CH0 的 DX-B11 品系（缺少 DHFR) (Urlaub et al.，1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20)、HeLa 細胞、BHK (ATCC CRL 10)細胞系、 源于非洲綠猴腎細胞系 CV1 的 CV1/EBNA細胞系（ATCC CCL 70) (McMahan et al.，1991，EMB0 J. 10:2821)、人胚腎細胞（例如293、293EBNA或MSR293)、人表皮A431細胞、人C〇1〇205細 胞、其他轉(zhuǎn)化靈長類細胞系、正常二倍體細胞、源于初生組織和初生外植體的體外培養(yǎng)所得 的細胞系、HL-60、U937、HaK或Jurkat細胞。典型地，宿主細胞是能夠以編碼多肽且能夠在 該宿主細胞中表達的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染得到的培養(yǎng)細胞。術(shù)語"重組宿主細胞"可用于表示 已經(jīng)用需表達的核酸來轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。宿主細胞還可以是指包含該核酸，但在調(diào) 控序列被引入該宿主細胞并與該核酸可操作連接以前，并不以所需表達水平來表達該核酸 的細胞。應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語"宿主細胞"并不單指特定的對象細胞，而是也指所述細胞的后代 或潛在后代。因為由于例如突變或環(huán)境影響的存在，后代中可能發(fā)生某些修飾，使得這些后 代事實上與其親代細胞并不等同，但其仍應(yīng)屬于本文中的"宿主細胞"術(shù)語所涵蓋的范圍。
[0138] 抗原結(jié)合蛋白
[0139] 抗原結(jié)合蛋白（例如抗體、抗體片段、抗體衍生物、抗體突變蛋白和抗體變體）是 與DLL-4(優(yōu)選為人DLL-4)結(jié)合的多肽?？乖Y(jié)合蛋白包括抑制DLL-4生物活性的抗原結(jié) 合蛋白。
[0140] 含有一個或多個抗原結(jié)合蛋白的寡聚物可以用作DLL-4的拮抗劑。寡聚物可以是 共價連接或非共價連接的二聚體、三聚體或更高寡聚物的形式。也可以使用包括2個或更 多抗原結(jié)合蛋白的寡聚物，其例子之一為同源二聚體。其他寡聚物包括異源二聚體、同源三 聚體、異源三聚體、同源四聚體、異源四聚體等。
[0141] 其中一個實施例指向的寡聚物中，包含多個抗原結(jié)合蛋白，這些抗原結(jié)合蛋白之 間的連接，是通過抗原結(jié)合蛋白上所融合的多肽部分之間的共價或非共價相互作用而形成 的。所說多肽可以是連接多肽（間隔子）或具有寡聚反應(yīng)促進性質(zhì)的多肽。一些多肽可以 促進與該多肽連接的抗原結(jié)合蛋白的寡聚反應(yīng)，包括亮氨酸拉鏈和某些源自抗體的多肽， 下面將更加詳細地進行描述。
[0142] 在特定實施例中，這些寡聚物包括2-4個抗原結(jié)合蛋白。該寡聚物的抗原結(jié)合蛋 白可以是任何形式，例如上述任何形式，例如變體或片段。優(yōu)選地，所述寡聚物包括具有 DLL-4結(jié)合活性的抗原結(jié)合蛋白。
[0143] 在一個實施例中，寡聚物是用源自免疫球蛋白的多肽來制備的。含有與源于抗 體的多肽的各部分（包括Fc域）相融合的某些異源多肽的融合蛋白，其制備記載于例如 Ashkenazi et al. , 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535 ；Byrn et al. , 1990, Nature 344:677 ；以及 Hollenbaugh et al.，1992〃Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins"，in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10. 19. 1-10. 19. 11 中。
[0144] 一個實施例指向一種含有2個融合蛋白的二聚體，所述融合蛋白是通過將一種抗 DLL-4抗體的DLL-4結(jié)合片段與一個抗體的Fc區(qū)域相融合來獲得的。該二聚體可以例如如 下所述地制備：將編碼該融合蛋白的基因融合插入適當(dāng)?shù)谋磉_載體中，在以該重組表達載 體轉(zhuǎn)化的宿主細胞中表達該基因融合，并允許所表達的融合蛋白大致如抗體分子般組裝， 由此在Fc部分之間形成鏈間二硫鍵，以獲得該二聚體。
[0145] 術(shù)語"Fc多肽"包括源于抗體Fc區(qū)域的多肽的原生和突變形式。還包括含有促進 二聚化的鉸鏈區(qū)的所述多肽的截短形式。含有Fc部分的融合蛋白（及由此形成的寡聚物） 提供的有益效果在于，易于通過蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G柱來以親和層析法進行純化。
[0146] 另一種用于制備寡聚抗原結(jié)合蛋白的方法包括使用亮氨酸拉鏈。亮氨酸拉鏈域是 促進其所在的蛋白質(zhì)的寡聚化的多肽。亮氨酸拉鏈最初是在若干DNA結(jié)合蛋白中識別出來 的（Landschulz et &1.，1988,3(^611〇6240:1759)，此后在各種不同蛋白中也發(fā)現(xiàn)過。在已 知的亮氨酸拉鏈中，有天然存在的多肽及其衍生物，能夠二聚化或三聚化。適用于制備可 溶寡聚蛋白的亮氨酸拉鏈域的例子如W0 94/10308所述，以及如Hoppeet al.，1994, FEBS Letters 344:191中所述的源自肺表面活化蛋白D(SPD)的亮氨酸拉鏈。Fanslow et al.，1994, Semin. Immunol. 6:267-78描述了一種修飾亮氨酸拉鏈，其允許與其融合的外源 蛋白穩(wěn)定地三聚化。在一種途徑中，在適當(dāng)?shù)乃拗骷毎斜磉_含有與亮氨酸拉鏈融合的抗 VEGFR2抗體片段或衍生物的重組融合蛋白，并從培養(yǎng)基上清液中回收可溶寡聚抗VEGFR2 抗體片段或衍生物。
[0147] 本公開提供一種DLL-4抗原結(jié)合蛋白（例如，抗DLL-4抗體），其具有一種或多種 下列特征：與人DLL-4和鼠DLL-4結(jié)合，抑制人DLL-4激活，抑制鼠DLL-4激活，與DLL-4 的蛋白質(zhì)水解切割位點或其附近區(qū)域結(jié)合，這對細胞表面表達的DLL-4的向下調(diào)節(jié)相對很 少。
[0148] 本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白的抗體結(jié)合片段可以用常規(guī)技術(shù)制備。所述片段的例子包 括但不限于Fab和F(ab'） 2片段。
[0149] 本公開提供與DLL-4結(jié)合的單克隆抗體。單克隆抗體可以使用本領(lǐng)域已知的任何 方法來制備，例如從完成免疫接種程序的轉(zhuǎn)基因動物中收獲脾細胞并使其無限增殖化。所 述脾細胞可以使用本領(lǐng)域任何技術(shù)來達成無限增殖化，例如將其與骨髓瘤細胞融合以形成 雜交瘤。用于制備融合蛋白的雜交瘤技術(shù)的骨髓瘤細胞優(yōu)選為不產(chǎn)生抗體、融合效率高，且 缺乏某些酶從而無法在某些僅支持所需融合細胞（雜交瘤）生長的選擇性培養(yǎng)基中生長的 細胞。適用于小鼠融合的細胞系的例子包括3口-20、？3463/^ §8、？34634§8.653、呢1/1. Ag 41、Sp210-Agl4、F0、NS0/U、MPC-ll、MPCll-X45-GTG 1.7 和 S194/5XX0Bul ;用于大鼠融 合的細胞系的例子包括R210. RCY3、Y3-Ag 1. 2. 3、IR983F和48210?？捎糜诩毎诤系钠?他細胞系有 U-266、GM1500-GRG2、LICR-L0N-HMy2 和 UC729-6。
[0150] 針對DLL-4的抗原結(jié)合蛋白可用于例如檢測DLL-4多肽的存在的體外或體內(nèi)化 驗。所述抗原結(jié)合蛋白還可用在以親和層析法對DLL-4蛋白進行的純化中。能夠額外阻止 配體結(jié)合介導(dǎo)的DLL-4激活的抗原結(jié)合蛋白可以用于抑制來源于所述結(jié)合的生物活性。阻 斷性抗原結(jié)合蛋白可用于本申請所公開的方法中。具有DLL-4拮抗劑功能的所述抗原結(jié)合 蛋白可用于智力愛哦任何DLL-4引起的病癥，包括但不限于各種癌癥。
[0151] 抗原結(jié)合蛋白可用于體外過程或體內(nèi)給藥以抑制DLL-4誘導(dǎo)的生物活性。由此可 以治療由DLL-4激活所導(dǎo)致或加重（直接或間接）的病癥，所述病癥的例子如本文所述。在 一個實施例中，本發(fā)明提供了一種治療方法，包括以降低DLL-4誘導(dǎo)的生物活性的有效劑 量，用DLL-4阻斷性抗原結(jié)合蛋白對哺乳動物進行體內(nèi)給藥。
[0152] 抗原結(jié)合蛋白包括抑制DLL-4生物活性（例如血管生成）的全人單克隆抗體。
[0153] 抗原結(jié)合蛋白可以由多種常規(guī)技術(shù)中的任一種來制備。例如，可以使用任何本領(lǐng) 域已知技術(shù)，從天然表達所述蛋白的細胞中純化而得（例如，從產(chǎn)生一種抗體的雜交瘤中純 化該抗體），或在重組表達體系中制備。例如，參見：Monoclonal Antibodies, Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses,Kennet et al. (eds. ), Plenum Press, New York (1980) ；and Antibodies:A Laboratory Manual, Harlow and Land(eds.),Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , (1988)〇
[0154] 本領(lǐng)域已知的任何表達體系均可用于制備本發(fā)明的重組多肽。一般來說，以含 有編碼一種所需多肽的DNA的重組表達載體來轉(zhuǎn)化宿主細胞?？梢允褂玫乃拗骷毎?括原核細胞、酵母菌或更高等的真核細胞。原核細胞包括革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性 菌，例如E. coli或bacilli。更高等的真核生物包括昆蟲細胞擴已建立的源于哺乳類的 細胞系。使用的哺乳類宿主細胞系的例子包括猴腎細胞（ATCC CRL 1651)(Gluzman et al.，1981，Cell 23:175)，L cells, 293cells、C127 細胞、3T3 細胞（ATCC CCL 163)、中國倉 鼠卵巢（CHO)細胞、HeLa細胞、BHK(ATCC CRL 10)細胞系、源于非洲綠猴腎細胞系CV1的 CV1/EBNA 細胞系（ATCC CCL70) (McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821)。適用于細菌、 真菌、酵母菌和哺乳類細胞宿主的克隆和表達載體如Pouwels et al. (Cloning Vectors:A Laboratory Manual, Elsevier, N. Y. , 1985)所述。
[0155] 轉(zhuǎn)化后的細胞可以在促進多肽表達的條件下培養(yǎng)，且以常規(guī)蛋白純化程序來回收 多肽。一種所述純化過程包括使用親和層析法，例如，通過能與DLL-4的全部或部分（例如 胞外域）結(jié)合的基質(zhì)。本申請的思路中使用的多肽包括基本不含內(nèi)源性污染雜質(zhì)的基本同 質(zhì)的重組哺乳類抗DLL-4抗體多肽。
[0156] 可以使用多種已知技術(shù)中的任一種來制備抗原結(jié)合蛋白并篩選所需性質(zhì)。某些技 術(shù)涉及分離編碼有感興趣的抗原結(jié)合蛋白（例如，抗DLL-4抗體）的多肽鏈（或其部分） 的核酸，并通過重組DNA技術(shù)操作該核酸。例如，該核酸可以融合到另一感興趣的核酸，或 通過添加、刪除或取代一個或多個氨基酸殘基來改變（例如，通過誘變或其他常規(guī)技術(shù)）。
[0157] 單鏈抗體可通過氨基酸橋接（短連接肽）來連接重鏈和輕鏈可變域（Fv區(qū)）片段， 以形成單一多肽鏈。所述單鏈Fvs(scFvs)通過在編碼兩個可變域多肽（VdPV H)的DNAs 之間融合編碼連接肽的DNA來制備。所得多肽可以自身折疊來形成抗原結(jié)合單體，或能夠 形成多聚體（例如二聚體、三聚體或四聚體），取決于兩個可變域之間的柔性連接子的長 度（Kortt et al.，1997, Prot. Eng. 10:423 ;Kortt et al.，2001，Biomol. Eng. 18:95-108)。 通過連接不同的含 '和VH的多肽，可以形成與不同表位結(jié)合的多價scFvs(Kriangkum et al.，2001，Biomol. Eng. 18:31-40)。為制備單鏈抗體而開發(fā)的技術(shù)包括如美國專利 4946778 ；Bird,1988,Science242:423 ；Huston et al. , 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879 ；ffard et al. , 1989, Nature 334:544,de Graaf et al.,2002, Methods Mol. Biol. 178:379-87 所述的技術(shù)。
[0158] 用于從感興趣的抗體獲得不同子類或種型的抗體的方法是已知的，即子類轉(zhuǎn)換 (subclass switching)。因此，例如可以從IgM抗體得到IgG抗體，反之亦然。此類技術(shù)允許 制備既具有特定抗體（親代抗體）的抗原結(jié)合性質(zhì)，也具有不同于親代抗體種型或子類的 抗體的相關(guān)生物性質(zhì)的新抗體?？梢允褂弥亟MDNA技術(shù)。所述過程中可以使用編碼特定抗 體多肽的克隆DNA，例如編碼所需種型抗體的恒定域的DNA (Lantto et al.，2002, Methods Mol.Biol. 178:303-16)。此外，若需要的是IgG4,還可能希望在鉸鏈區(qū)中引入點突變 (CPSCP->CPPCP) (Bloom et al.，1997, Protein Science 6:407)，以減緩重鏈間形成二硫鍵 從而可能導(dǎo)致IgG4抗體異質(zhì)性的趨勢。
[0159] 在一些特定實施例中，本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白對DLL-4的結(jié)合親和性（Ka)為至少 1〇 6。在另外一些實施例中，抗原結(jié)合蛋白的Ka為至少107、至少108、至少10 9、或至少101(1。 在另一個實施例中，該抗原結(jié)合蛋白的Ka與本申請實施例中所述的抗體實質(zhì)相同。
[0160] 在又一個實施例中，本公開提供了一種與DLL-4的解離常數(shù)低的抗原結(jié)合蛋白。 在一個實施例中，該抗原結(jié)合蛋白的1(。"為lXl(T 4tc^或更低。在又一個實施例中，該K。"為 5Xl(T5to_1或更低。在又一個實施例中，1(。"與本申請實施例中所述的抗體實質(zhì)相同。在又 一個實施例中，抗原結(jié)合蛋白與DLL-4結(jié)合的K a與本申請實施例中所述的抗體實質(zhì)相同。
[0161] 本公開的另一個方面中，提供抑制DLL-4活性的抗原結(jié)合蛋白。在一個實施例中， 該抗原結(jié)合蛋白的IC5Q為lOOOnM或以下。在又一個實施例中，該IC5Q為lOOnM或以下；在 又一個實施例中，該IC5(I為10nM或以下。在又一個實施例中，該IC5(I與本申請實施例中所 述的抗體實質(zhì)相同。在又一個實施例中，該抗原結(jié)合蛋白抑制DLL-4活性的IC 5(I與本申請 實施例中所述的抗體實質(zhì)相同。
[0162] 本公開的另一個方面中，提供與細胞表面表達的人DLL-4結(jié)合的抗原結(jié)合蛋白， 且當(dāng)發(fā)生該結(jié)合時，抑制DLL-4在該細胞中的信號活動，而不會顯著降低細胞表面的DLL-4 量?？梢允褂萌魏斡糜跍y定或估計細胞表面和/或細胞內(nèi)部的DLL-4量的方法。在其他實 施例中，該抗原結(jié)合蛋白綁定至DLL-4表達細胞，使得低于約75 %、50 %、40 %、30 %、20 %、 15%、10%、5%、1%或0.1%的細胞表面01^-4得到內(nèi)部化。
[0163] 本公開的另一個方面中，提供一種抗原結(jié)合蛋白，其體外或體內(nèi)（例如，對人類對 象給藥時）的半排出期為至少1天。在一個實施例中，該抗原結(jié)合蛋白的半排出期為至少3 天。在又一個實施例中，該抗原結(jié)合蛋白的半排出期為4天或以上。在又一個實施例中，該 抗原結(jié)合蛋白的半排出期為8天或以上。在又一個實施例中，該抗原結(jié)合蛋白衍生化或改 性，從而使其半排出期與未衍生化或未改性的抗原結(jié)合蛋白相比更為長久。在又一個實施 例中，該抗原結(jié)合蛋白包括一個或多個點突變，以增加血清半排出期，例如W000/09560所 述，在此以引用方式并入。
[0164] 本公開還提供了多特異性抗原結(jié)合蛋白，例如雙特異抗原結(jié)合蛋白（例如通過兩 個不同的抗原結(jié)合位點或區(qū)域，與DLL-4的兩個不同表位結(jié)合或與DLL-4的表位和另一分 子的表位結(jié)合的抗原結(jié)合蛋白）。此外，本申請公開的雙特異抗原結(jié)合蛋白可以包括：來自 此述的一種抗體的DLL-4結(jié)合位點，以及來自此述的另一種抗體的另一 DLL-4結(jié)合區(qū)，其中 涵蓋本文引用其他出版物所描述的抗體?？蛇x地，一種雙特異性抗原結(jié)合蛋白可以包括一 個來自此述的一種抗體的抗原結(jié)合位點，以及來自本領(lǐng)域所知的另一種DLL-4抗體或以已 知方法或此述方法制備的抗體的又一抗原結(jié)合位點。
[0165] 本領(lǐng)域中已知多種制備雙特異性抗體的方法。所述方法包括使用雜交-雜交 瘤（hybrid-hybridomas),如 Milstein et al.，1983，Nature 305:537 所述，以及抗體 片段的化學(xué)連接（Brennan et al., 1985, Science 229:81 ;Glennie et al., 1987, J. Immunol. 139:2367 ;美國專利6, 010, 902)。此外，雙特異性抗體可以通過重組途徑來制備， 例如使用亮氨酸拉鏈部分（即，來自優(yōu)選地形成異源二聚體的Fos和Jun蛋白；Kostelny et al.，1992, J. Immunol. 148:1547)或其他鎖匙互動域結(jié)構(gòu)，如美國專利5582996所述。額外 的可用技術(shù)包括如美國專利5959083和5807706中所述的技術(shù)。
[0166] 在又一個方面中，抗原結(jié)合蛋白包括抗體的衍生物。該衍生化抗體可以包括能夠 賦予該抗體所需性質(zhì)的任何分子或物質(zhì)，例如在一種特定用途中增加其半排出期。所述衍 生化抗體可以包括例如可檢測的（或標(biāo)簽）部分（例如：放射性、比色的、抗原性或酶活性 分子）、可檢測珠（例如磁性或電子致密性的（如金珠））、結(jié)合另一分子（例如生物素或鏈 霉親和素）的分子、治療性或診斷性部分（例如，放射性、細胞毒性或藥學(xué)活性部分）或能 夠增加該抗體對一種特定用途（例如向?qū)ο笕缛祟悓ο蠼o藥，或其他體內(nèi)或體外用途）的 適用度的分子。可用于衍生抗體的分子的例子包括白蛋白（例如人血清白蛋白）和聚乙二 醇（PEG)。連接白蛋白且聚乙二醇化的抗體衍生物可以使用本領(lǐng)域所熟知的技術(shù)來制備。 在一個實施例中，該抗體與甲狀腺素運載蛋白（TTR)或TTR變體綴合或以其他方式結(jié)合。 該TTR或TTR變體可以用選自以下種類的化學(xué)物質(zhì)進行化學(xué)改性：葡聚糖、聚（N-乙烯基吡 咯烷）、聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇及聚乙烯 醇。
[0167] 含有本公開的抗體及其片段的藥物組合物以適用于其適應(yīng)癥的方式向?qū)ο蠼o藥。 可以用任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)對藥物組合物進行給藥，包括但不限于，非腸道給藥、外敷或吸入。 若注射，則該藥物組合物可以通過例如關(guān)節(jié)內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、病灶內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下途徑 的大劑量注射或持續(xù)輸注來給藥。局部給藥，例如可在疾病或損傷的部位，作為經(jīng)皮遞送和 從植入物持續(xù)釋放。吸入遞送，包括例如經(jīng)鼻或經(jīng)口吸入，使用噴霧器，吸入氣霧劑形式的 拮抗劑，等等。其他可選形式包括：眼藥水；口服制劑，包括丸劑、糖漿劑、錠劑或口香糖；和 外用制劑，如洗劑、凝膠劑、噴霧劑和軟膏劑。
[0168] 本公開還涵蓋了抗原結(jié)合蛋白在間接體內(nèi)療法中的用途。例如，可以令患者的血 液或其他體液與DLL-4結(jié)合性抗原結(jié)合蛋白進行體外接觸。該抗原結(jié)合蛋白可以與適當(dāng)?shù)?不溶性基質(zhì)或固體支持材料結(jié)合。
[0169] 優(yōu)選地，抗原結(jié)合蛋白的給藥形式為一種包含一種或多種附加成分（例如生理學(xué) 可接受的載體、賦形劑或稀釋劑）的組合物?？蛇x地，該組合物還包括一種或多種生理活性 藥劑，例如，第二種炎癥或免疫抑制物質(zhì)、抗血管生成物質(zhì)、鎮(zhèn)痛物質(zhì)等等，本公開中提供了 一些非限制性示例。在多種特定實施例中，該組合物中除DLL-4結(jié)合性抗原結(jié)合蛋白外，還 包括1、2、3、4、5或6種生理活性藥劑。
[0170] 實施例1
[0171] 本實施例展示了細胞結(jié)合體外數(shù)據(jù)，作為本公開中數(shù)種抗體的初步篩選的一部 分。以無酶解離緩沖液轉(zhuǎn)移穩(wěn)定表達DLL-4的CH0-K1細胞（CH0-DLL-4細胞），將其移入尖 底96孔板（每孔100000細胞）。在冰上的FACS緩沖液（PBS+2% FBS) +NaN3中用抗DLL-4 抗體培養(yǎng)細胞45分鐘。用FACS緩沖液洗滌2次后，加入1:1000倍稀釋的藻紅蛋白綴合抗 人IgG(Y_鏈特異），培養(yǎng)30分鐘。最終洗滌后，用Intellicyt高通量流式細胞儀（HTFC) 測量熒光強度。使用Graphpad Prism軟件來對數(shù)據(jù)進行非線性回歸擬合分析。圖示數(shù)據(jù) 點為陽性標(biāo)記細胞的平均熒光強度（MFI)+/_標(biāo)準(zhǔn)誤差。EC 5(I值為達到DLL-