包含來(lái)自胎盤生長(zhǎng)因子的序列的偶聯(lián)物及其作為生物材料組成成分和在醫(yī)藥中的應(yīng)用
【專利說(shuō)明】包含來(lái)自胎盤生長(zhǎng)因子的序列的偶聯(lián)物及其作為生物材料 組成成分和在醫(yī)藥中的應(yīng)用
[0001] 對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本專利申請(qǐng)要求2012年7月3日提交的美國(guó)序列號(hào)61/667, 630的優(yōu)先權(quán)，據(jù)此 其通過(guò)提述完整并入。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 所屬技術(shù)領(lǐng)域，總體而言，涉及通過(guò)特異性結(jié)合相互作用結(jié)合胞外基質(zhì) (extracellular matrices)的肽。
【背景技術(shù)】
[0004] 胞外基質(zhì)（ECM)為組織提供結(jié)構(gòu)支撐，并為細(xì)胞提供信號(hào)傳導(dǎo)能力。ECM在發(fā)育和 組織修復(fù)中起重要作用。
[0005] 發(fā)明概述
[0006] 如本申請(qǐng)所報(bào)道的，已發(fā)現(xiàn)胎盤生長(zhǎng)因子（P1GF)顯示出對(duì)于ECM的特異性結(jié)合活 性。P1GF是一種血管生成細(xì)胞因子，其存在多種剪接變體。P1GF最初是在胎盤中被鑒定出 來(lái)，并提出其控制滋養(yǎng)層的生長(zhǎng)及發(fā)育。P1GF在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中表達(dá)。已顯示P1GF 在絨毛滋養(yǎng)層表達(dá)，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)在絨膜板中的間充質(zhì)起源的細(xì)胞中表達(dá)。 P1GF在包括心、肺、甲狀腺、骨骼肌以及脂肪組織在內(nèi)的若干種其他器官中表達(dá)。P1GF充 當(dāng)單核細(xì)胞VEGF分泌的有效刺激物，并顯著地提高炎癥前期趨化因子白介素-1 0、白介 素-8、單核細(xì)胞化學(xué)引誘物蛋白-1、以及健康受試者外周血單核細(xì)胞中VEGF的mRNA水平。 P1GF通過(guò)將循環(huán)中的定向造血干細(xì)胞和巨噬細(xì)胞募集到生長(zhǎng)中的腫瘤的位點(diǎn)來(lái)誘導(dǎo)腫瘤 血管發(fā)生（Ribatti D, 2008)。
[0007] -種具體實(shí)施方案是經(jīng)分離的多肽，其包含選自具有0-5個(gè)保守取代的SEQID N〇:4,具有0-5個(gè)保守取代的SEQIDNO:5,及其亞序列的序列。所述的亞序列可以因顯 示出特異結(jié)合血纖蛋白原、纖連蛋白、玻連蛋白、生腱蛋白C、骨橋蛋白和血纖蛋白中的一種 或以上而被選擇?？梢灾付ń怆x常數(shù)，例如所述多肽與血纖蛋白原的特異結(jié)合具有小于約 100nM，或小于約40nM，或小于約25nM的解離常數(shù)（KD)。
[0008] -種具體實(shí)施方案是生物遞送載體（delivery vehicle)，其包含生物試劑和肽的 分子融合物，所述肽包含選自具有0-約15%保守取代的SEQ ID N0:4和具有0-約15%保 守取代的SEQ ID N0:5的序列的至少6個(gè)殘基的序列或亞序列。如本申請(qǐng)中更加詳細(xì)解釋 地，所述的肽顯示出特異性結(jié)合下述一種或以上甚或全部胞外基質(zhì)分子，所述胞外基質(zhì)分 子選自：血纖蛋白原、纖連蛋白、玻連蛋白、生腱蛋白C、骨橋蛋白、血纖蛋白、膠原、膠原I和 硫酸肝素。事實(shí)上，經(jīng)測(cè)試的肽顯示出特異結(jié)合上述的全部胞外基質(zhì)分子。生物試劑的示 例選自蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)藥物、標(biāo)記、免疫試劑、趨化因子、細(xì)胞因子以及細(xì)胞粘附肽。本申請(qǐng) 所用的術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子，包括生長(zhǎng)因子和形態(tài)發(fā)生素。
[0009] -種具體實(shí)施方案是包含基質(zhì)的生物材料，所述的基質(zhì)包含多肽，所述多肽包含 選自具有0-5個(gè)保守取代的SEQ ID N0:4,具有0-5個(gè)保守取代的SEQ ID N0:5及其全部 亞序列的序列，所述肽顯示特異性結(jié)合胞外基質(zhì)分子。所述基質(zhì)可以是天然的和合成的、共 價(jià)交聯(lián)的、交聯(lián)但無(wú)共價(jià)結(jié)合的和無(wú)交聯(lián)的。
[0010] 一種具體實(shí)施方案是藥物，所述藥物包含肽，載體（vehicle)，或含P1GF2(如 P1GF2的結(jié)構(gòu)域）的生物材料。所述藥物可以用于，例如藥物治療，制備藥物組合物，例如作 為疫苗，用于藥物遞送，傷口愈合，和組織愈合，例如骨、瘺或潰瘍愈合。
[0011] 附圖簡(jiǎn)述
[0012] 圖1:P1GF2(P1GF2123_144)中的結(jié)構(gòu)域，強(qiáng)烈地且雜亂地結(jié)合ECM蛋白。（a)GF與 ECM蛋白的結(jié)合通過(guò)ELISA測(cè)定。超過(guò)0. 1的信號(hào)（灰色框）被認(rèn)為是代表特異性結(jié)合。 P1GF2與被測(cè)試的全部ECM蛋白強(qiáng)烈結(jié)合（灰色柱）。（b)剪接變體P1GF2和P1GF-1 (其不 結(jié)合）的蛋白序列比對(duì)。P1GF2包含位于C-末端附近的附加的21氨基酸插入（P1GF2123_ 144， 灰色）。（c)使P1GF2123_144在與非-結(jié)合模型蛋白GST (GST-P1GF2 123_144)融合的情況下結(jié)合 ECM 蛋白。擾亂形式（scrambled version)的 P1GF2123_144(GST-P1GF2sJ 不結(jié)合 ECM 蛋白。 在（a)和（c)中，n彡3,平均值土SEM。比對(duì)顯示P1GF-1的序列（P1GF-1LPAVPPQQWALSAG NGSSEVEVVPFQEVWGRSYCRALERLVDVVSEYPSEVEHMFSPSCVSLLRCTGCCGDENLHCVPVETANVTMQLLKI RS⑶RPSYVELTFSQHVRCECRPLREKMKPERCGDAVPRR(SEQ ID N0:58)與 P1GF2 的序列相比較（LP AVPPQQWALSAGNGSSEVEVVPFQEVWGRSYCRALERLVDVVSEYPSEVEHMFSPSCVSLLRCTGCCGDENLHCVPV ETANVTMQLLKIRS⑶RPSYVELTFSQHVRCECRPLREKMKPERRRPKRGKRRREKQRPTDCHLC⑶AVPRR, SEQ ID NO:59)。
[0013] 圖2:使各種GST-P1GF2123_14$段與纖連蛋白、膠原I、硫酸類肝素和神經(jīng)氈 蛋白-1結(jié)合。（a)GST-PlGF2 123_144片段的設(shè)計(jì)方案。（b)使GST-P1GF2 123_144片段與 纖連蛋白、膠原I、硫酸類肝素和神經(jīng)氈蛋白-1結(jié)合。所描述的比對(duì)包括GST-P1GF2 的片段：RRRPKGRGKRRREKQRPTDCHLC⑶AVPRR(SEQID N0:60),RRRPKGRGKRRREKQRPTDC HL(SEQ ID N0:61), RRPKGRGKRRREKQRPTD(SEQ ID NO:62), RRRPKGRGKRRREKQ (SEQID NO: 1), GKRRREKQ (SEQ ID NO: 2),以及 RRRPKGRG (SEQ ID NO: 3)。
[0014] 圖3:用P1GF2123_144 (黑色框）取代VEGF-A165的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域以生成 VEGF-A121-P1GF2123_ 144(SEQ ID N0:7)。P1GF2123_144與 PDGF-BB 的 C-末端融合以產(chǎn)生 PDGF-BB-P1GF2123_144(SEQ ID N0:9)。含點(diǎn)突變（Cys142至 Ser)的 P1GF2123_144*(灰色框）插 入到 BMP-2 的 C-末端以生成 BMP-2_P1GF2123_144*(SEQID NO: 13)。
[0015] 圖4:有兩幅子圖。（a)通過(guò)ELISA測(cè)定細(xì)胞因子-P1GF2123_ 144@^ECM蛋白（纖連 蛋白、玻連蛋白、生腱蛋白C、骨橋蛋白、膠原I、血纖蛋白原）以及硫酸類肝素的結(jié)合。ELISA 板經(jīng)細(xì)胞因子包被，并進(jìn)一步在升高的濃度（〇.〇2_320nM)下與ECM蛋白一起溫育。利用抗 體檢測(cè)結(jié)合的ECM蛋白。使結(jié)合曲線擬合非線性回歸以獲得應(yīng)用A 45(lnm= Bmax*[濃度]/ (KD+[濃度])的解離常數(shù)（KD)。n = 3,平均值土SEM。（b)細(xì)胞因子s-P1GF2123_144W保留在 血纖蛋白基質(zhì)中。血纖蛋白基質(zhì)在野生型細(xì)胞因子（P1GF-1、P1GF2、VEGF-A121、VEGF-A165、 PDGF-BB 和 BMP-2)或經(jīng)修飾的細(xì)胞因子（VEGF-A121-P1GF2123_144、？06?-88呼16?2 123_144或 BMP-2_P1GF2123_144W存在下制備，并進(jìn)一步在8倍體積的生理緩沖液中溫育7天。每天更 換所述的緩沖液，并且每天對(duì)累積釋放的細(xì)胞因子進(jìn)行定量。野生型P1GF-1、VEGF-A121、 VEGF-A165、PDGF-BB 和 BMP-2 被快速地釋放，而 VEGF-A121-P1GF2123_144、PDGF-BB-P1GF2123_ 144 以及BMP-2-P1GF2H彬被隔尚在基質(zhì)中。
[0016] 圖5:在體外，P1GF2123_144-融合的GFs顯示與野生型GFs類似的生物活性。 (a) 用 VEGF-A121、VEGF-A165 或 VEGF-A-P1GF2123_144刺激人 ECs，（b)用 PDGF-BB 或 H)GF-BB-P1GF2123_144刺激人間充質(zhì)干細(xì)胞。磷酸化的GF受體（VEGFR-2和roGFR-0)通過(guò) ELISA(n = 3,平均值土SEM)定量。將P1GF2123_144插入到VEGF-A和PDGF-BB中不改變它 們的信號(hào)傳導(dǎo)。而且，P1GF2 123_144插入到VEGF-A121中，將其活性提高至VEGF-A165的水 平。對(duì)于VEGF-A165而言，對(duì)受體磷酸化提高的活性最可能時(shí)由于使PlGF2 123_144g合于神 經(jīng)氈蛋白-1造成的，其提高VEGF-A刺激VEGFR-2磷酸化的潛力（Migdal M等，1998 ;Pan Q 等，2007 ;Whitaker GB 等，2001)。Student t_ 檢驗(yàn)用于統(tǒng)計(jì)比較；*p〈0. 05,林p〈0. 01。 (c)通過(guò)BMP-2_P1GF2123_144*在人間充質(zhì)干細(xì)胞中促進(jìn)ALP活性的能力（誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分 化）對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。對(duì)在BMP-2或BMP-2_P1GF2 123_144#存在下培養(yǎng)了 14天之后的細(xì)胞ALP 進(jìn)行定量。在經(jīng)BMP-2或BMP-2_P1GF2123_144JS療的細(xì)胞間沒(méi)有觀察到細(xì)胞數(shù)量和ALP活 性的差異。結(jié)果是以ALP/10k細(xì)胞的ng(n = 4,平均值土SEM)表達(dá)。
[0017] 圖6:P1GF2123_144-融合的GFs展示對(duì)ECM組成成分增強(qiáng)的親和力。（a)野生型相比 于P1GF2 123_144-融合的GFs對(duì)ECM蛋白和硫酸類肝素的親和力（表示為KD)n = 3,平均值 土SEM。（b-f)相對(duì)于野生型GFs，P1GF2123_144-融合的GFs在遞送位點(diǎn)持續(xù)保留一段時(shí)間。 (b) 在皮下注射到小鼠背部皮膚時(shí)，VEGF-A165和VEGF-A-P1GF2123_144保持（retention)。n =6/時(shí)間點(diǎn)，平均值土SEM。（c-f)當(dāng)置于填充有血纖蛋白基質(zhì)的、小鼠背部皮膚（c，d) 和小鼠顱蓋（e，f)中的5mm直徑缺陷時(shí)，野生型和P1GF2 123_144-融合的GF保持。在血纖蛋 白基質(zhì)（灰色柱）和所述缺陷周圍的組織中（黑色柱，遠(yuǎn)于2mm)3和6天后保持。4/ 時(shí)間點(diǎn)，平均值土SEM。對(duì)于所有的小圖，Student' s t-檢驗(yàn)；#p〈0. 01，*#p〈0. 001。
[0018] 圖 7:VEGF-A-P1GF2123_144和 PDGF-BB-P1GF2 123_144比野生型 VEGF-A 和 TOGF-BB誘導(dǎo)更好的傷口愈合和血管發(fā)生。（a-j)遞送低劑量VEGF-A-P1GF2123_ 144* H)GF-BB-P1GF2123_14 (各200ng，組合）4促進(jìn)糖尿病小鼠中的皮膚-傷口愈合，而相同劑量 的野生型VEGF-A165和TOGF-BB沒(méi)有。表面（topically)遞送GFs (在第0,3,和6天， 在第10天分析傷口；在0, 3, 6和9天，在第15天分析傷口）或在血纖蛋白基質(zhì)中遞送一 次，治療全層背部-皮膚傷口（直徑6_)。對(duì)6個(gè)不同的組進(jìn)行的試驗(yàn)：表面，僅PBS載 體，VEGF-A165+PDGF-BB,和 VEGF-A-P1GF2123_144+PDGF-BB-P1GF2123_ 144;在血纖蛋白中，僅 血纖蛋白、含 VEGF-A165PDGF-BB 的血纖蛋白和含 VEGF-A-P1GF2123_144+PDGF-BB-P1GF2123_ 144 的血纖蛋白。在10和15天后通過(guò)組織學(xué)評(píng)價(jià)（表面組；a-b)，或7和10天后（血纖蛋白 組；f-g)的傷口閉合以及肉芽組織形成。全部的點(diǎn)為平均值土SEM(n = 8-10傷口每組每 時(shí)間點(diǎn)。31：11(16111:'8 1：-檢驗(yàn)；噸〈0.05，*噸〈0.01，**噸〈0.001。在第10天（(3，11)對(duì)血纖蛋 白組，代表性的組織學(xué)，第15天對(duì)表面組（蘇木精和伊紅染色）。黑色箭頭指示傷口邊緣； 紅色箭頭指示愈合中的上皮舌的尖端。所述肉芽組織，染成粉-紫色。傷口下面的肌肉染 成粉-紅色。比例尺（Scale bar) = 1mm。（d，e，i，j)肉定量芽組織中的血管發(fā)生。10天 和15天之后（表面組；d，e)，或7天和10天之后（血纖蛋白組；I，J)，針對(duì)ECs(⑶31+細(xì) 胞）和SMCs(結(jié)蛋白+細(xì)胞）將傷口組織染色；雙重染色指示穩(wěn)定的血管形態(tài)（n多4/時(shí)間 點(diǎn)，平均值土 SEM)。利用Student's t-檢驗(yàn)比較野生型GFs和P1GF2123_144-融合的GFs ; *p〈0. 05, **p〈0. 01，***p〈0. 001。
[0019] 圖8:與相同劑量的野生型VEGF-A165(10yg)相比，VEGF-A-P1GF2123_14^導(dǎo)更少 的血管滲透。（a)該圖顯示在小鼠耳部皮膚中的血管滲透測(cè)定。n多4,平均值土SEM。為 了統(tǒng)計(jì)比較，利用非參數(shù)Mann-WhitneyU試驗(yàn)將VEGF-A165和VEGF-A-P1GF2 123_144進(jìn)行比 較；*p〈0. 05。（b，c)應(yīng)用VEGF-A20min后小鼠耳部皮膚脈管系統(tǒng)的代表性圖像。由紅色標(biāo) 記的葡聚糖從脈管中泄露使得VEGF-A誘導(dǎo)的滲透可視化。比例尺=0. 2mm。
[0020] 圖 9:與野生型 PDGF-BB 和 BMP-2 相比，遞送 PDGF-BB-PlGF2123_14jP BMP-2_P1GF2123_ 144#在大鼠中誘導(dǎo)更多的骨再生。通過(guò)表面地或在血纖蛋白基質(zhì)中遞送 GFs治療臨界-大小的（Critical-size)顏蓋缺損（直徑6mm)。對(duì)6個(gè)不同的組進(jìn)行的 試驗(yàn)：表面地，僅鹽水載體、BMP-2+PDGF-BB 和 BMP-2-PlGF2123_144*+PDGF-BB-PlGF2123_ 144; 在血纖蛋白中，僅血纖蛋白、含BMP-2+PDGF-BB的血纖蛋白和含BMP-2-PlGF2123_144#+PDGF -BB-P1GF2 123_144的血纖蛋白。劑量為：對(duì)表面治療組，遞送至硬腦膜GF各1 yg，組合；對(duì) 血纖蛋白組，GF各200ng，組合。（a-d)治療后4后，通過(guò)yCT以骨量和缺損的覆蓋范圍 (coverage)測(cè)定骨修復(fù)（a，b顯示表面組；c，d顯示血纖蛋白組）。（e-j)代表性的顱蓋重 建。e，鹽水載體；f.BMPj+PDGF-BB^BMPj-PlGFZuH彬+PDGF-BB-PlGF2 123_144;h，僅血纖 蛋白，i，帶有