專利名稱：：對胎盤生長因子(pigf)介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移和/或血管生成的抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抑制血管生成、尤其是病理性血管生成和/或腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移的方法和組合物。在具體實施方案中，所述組合物和方法涉及靶向胎盤生長因子-2(PIGF)和/或其受體Flt-l的抑制劑，包括但不限于肽、抗體、抗體片段、人源化抗體、嵌合抗體、抗體類似物、適體、有機(jī)化合物和/或本領(lǐng)域已知的可以用來抑制PIGF介導(dǎo)的血管生成和/或轉(zhuǎn)移的任何其他分子或化合物。在更具體的實施方案中，所述抑制劑可以是通過針對PIGF的噬菌體展示分離的肽。相關(guān)技術(shù)介紹高表達(dá)的血管生成生長因子是眾多癌癥生長發(fā)展所必需的(Caoetal.,1998,JClinInvest101:1055-1063)。在這樣的血管生成生長因子中，高表達(dá)的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與腫瘤惡性程度和轉(zhuǎn)移增加的相關(guān)性受到最高泛的關(guān)注(Abdulraufetal.,1998,JNeurosurg88:513-52;Ahmedetal.,2000,Placenta21SupplA,S16-24)。然而，VEGF和VEGF家族生長因子的其他成員在腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性生長中的作用還未完全清楚。許多治療，包括放療、細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性藥物，它們的治療作用部分歸因于抗血管生成機(jī)制，其中一種才幾制為向下調(diào)節(jié)VEGF(Tayloretal.,2002a,ClinCancerRes8:1213-1222;Jiangetal.,1999,MolCarcinog26:213-225;Macheinetal.,1999,NeumpatholApplNeurobiol25:104-112)。而且，顯著抑制VEGF夠恢復(fù)血液供應(yīng)使腫瘤細(xì)胞存活。因此本領(lǐng)域需要直接針對有效抑制腫瘤血管生成和/或生長和轉(zhuǎn)移以及其他疾病伴有的血管生成的方法和組合物。發(fā)明概述本發(fā)明通過提供用于抑制、遏制、阻斷和/或消除血管生成和/或腫瘤轉(zhuǎn)移的方法和組合物，滿足了本領(lǐng)域一項未被滿足的需要。在某些實施方案中，組合物和/或方法可涉及胎盤生長因子-2(P1GF)的配體和/或既與Flt-l結(jié)合又與PlGF結(jié)合的配體。這類配體可包括但不限于肽、抗體、抗體片段、人源化抗體、嵌合抗體、抗體類似物、適體(aptamers)、有機(jī)化合物和/或本領(lǐng)域已知是P1GF配體的任何其它分子或化合物。在各種實施方案中，P1GF配體可為肽。用于鑒定與特定靶標(biāo)結(jié)合的肽的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，包括例如如下所述的噬菌體展示技術(shù)。在噬菌體展示中，產(chǎn)生在噬菌體(例如絲狀噬菌體)表面表達(dá)的肽文庫，并且可通過針對目標(biāo)靶進(jìn)行選擇來篩選肽文庫。在一輪或多輪針對靶的篩選(淘選)后，可以分離含有與靶結(jié)合的展示肽的噬菌體，并且可通過例如對噬菌體核酸中編碼肽的DNA插入片段測序，確定肽序列。其它實施方案涉及用于治療患者(例如患有癌癥和/或例如黃斑變性等血管生成相關(guān)疾病的患者)的方法和/或組合物。受治療者可包括但不限于人、動物、貓、狗、牛、綿羊、山羊、馬、羊駝和哺乳動物。方法和組合物可包括給予受治療者一種或多種P1GF配體。在優(yōu)選的實施方案中，可以給予通過針對P1GF的噬菌體展示鑒定為配體的肽?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何途徑給予，例如口服、經(jīng)鼻、口腔、吸入、直腸、陰道或局部。或者可以通過原位(orthotopic)、真皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)注射給予。在優(yōu)選的實施方案中，P1GF配體(抑制劑)經(jīng)口服給予。在更優(yōu)選的實施方案中，P1GF配體可包含下述實施例中所公開的(結(jié)合蛋白)BP-1、BP-2、BP-3或BP-4的序列。給予P1GF配體可以有效抑制或消除胂瘤轉(zhuǎn)移、實體瘤中的血管生成、腫瘤細(xì)胞存活和/或胂瘤細(xì)胞移動。在優(yōu)選的實施方案中，給予一種或多種P1GF配體可以阻止肺瘤轉(zhuǎn)移，或者可以導(dǎo)致現(xiàn)有腫瘤消退或抑制生長。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，一種或多種P1GF配體可以單獨給予，或者可與其它已知的癌癥和/或血管生成的治療性療法聯(lián)用，例如化學(xué)療法、放射療法、免疫療法、抗VEGF藥物和/或其它已知的抗血管生成藥物等。在一些實施方案中，P1GF配體可與雙特異性抗體一起給予，該抗體具有一個針對P1GF配體的結(jié)合部位及第二個針對腫瘤抗原或其它靶標(biāo)的結(jié)合部位。在其它實施方案中，P1GF配體可與抗體、抗體片段、單克隆抗體、Fc片段、Fc結(jié)合蛋白或抗體結(jié)合蛋白共價連接，或者作為與抗體、抗體片段、單克隆抗體、Fc片段、Fc結(jié)合蛋白或抗體結(jié)合蛋白的融合蛋白提供。在替代實施方案中，P1GF配體可用于治療除癌癥以外的血管生成相關(guān)疾病。血管生成相關(guān)疾病的實例包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、節(jié)段性回腸炎(Crohn'sdisease)、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病、譯喘、水腫、肺動脈高壓、腫瘤的形成與發(fā)展、牛皮癬、糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑變性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、心肌血管生成、斑塊新血管形成、再狹窄、血管創(chuàng)傷后新內(nèi)膜形成、毛細(xì)管擴(kuò)張、血友病性關(guān)節(jié)、血管纖維瘤、慢性炎癥相關(guān)的纖維化、肺纖維化、深部靜脈血栓形成和傷口肉芽形成。在其它替代實施方案中，本文所公開的P1GF配體可以例如通過與復(fù)合物或治療藥物綴合，用作尋靶肽。P1GF配體(例如BP-1、BP-2、BP-3和/或BP-4)可以通過本領(lǐng)域眾所周知的方法，例如4吏用共價交聯(lián)劑，與各種部分共價或非共價連接。已知并可以使用多種這類試劑，例如碳二亞胺、雙亞氨酸酯(bisimidate)、辛二酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯、二甲基-3,3'-二石克-雙亞氨丙酸酯(dimethyl-3,3'-dithio-bispropionimidate)、疊氮基乙二醛、1,5-二氟-2,4-(二硝基苯)和其它用于蛋白質(zhì)和/或肽的交聯(lián)劑。在各種實施方案中，P1GF配體可與以下部分連接抗體、抗體片段、化療藥物、抗血管生成藥、促凋亡藥、摻有這些藥物的或任何其它已知治療用化合物。在另一些實施方案中，PlGF配體可以用作診斷和/或成^象目的添加劑。例如，P1GF配體用任何已知的造影劑或檢測劑標(biāo)記，或者可以采用任何已知方法(例如ELISA等)檢測。可以離體使用P1GF配體，例如通過組織切片的免疫組織化學(xué)，來檢測表達(dá)P1GF的腫瘤或其它組織。或者，P1GF配體可以給予受治療者用于體內(nèi)檢測表達(dá)P1GF的組織。例如，可以使用這些組合物和方法檢測或診斷表達(dá)P1GF胂瘤的存在，和/或鑒定患有以下疾病的患者血管生成或可受益于針對P1GF靶向療法的細(xì)力包移動相關(guān)疾病。附圖簡述下面的附圖構(gòu)成本說明書的組成部分，；波用來進(jìn)一步it明本發(fā)明具體實施方案的某些方面。結(jié)合本文提供的發(fā)明詳述，參照一個或多個附圖可以更好地理解實施方案。圖l.BPl與Flt-l的肝素結(jié)合區(qū)的相互作用。按圖中的下圖部分所述，將試劑加到Flt-l包被的孔中。在本實驗中所用的BP1在其C端含有接頭和的FLAG表位。通過探測FLAG表位來評價肽結(jié)合。A:僅ljiMBPl;B:僅2.5/25U/ml肝素；C:2.5U/ml肝素后加入linMBP1;D:lpMBPl后加入2.5U/ml肝素。所示數(shù)值是兩個獨立實驗一式兩份孔的平均值士SD。肝素后加入1iliMBP1(C)相對于僅BP1(A)<0細(xì)2(ANOVA)。圖2.P1GF體外刺激MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲。該圖表示累積結(jié)果士SD(i^3-5次實驗)。圖中所用縮寫詞'P1'表示P1GF;'VE'表示VEGF。承P〈0.05(ANOVA)。圖3.BP1抑制MDA-MB-231異種移植物生長和轉(zhuǎn)移。肺瘤體積對時間，皮下才莫型。所示結(jié)果得自兩個實驗之一士SD(n二3-4只小鼠/治療)。對于才莫擬品治療或CPA(腫瘤體積變化(ANOVA))*P<0.05。圖4A-4C.外源P1GF刺激腫瘤細(xì)胞存活力提高。在低血清濃度(1%)條件下，乳腺腫瘤細(xì)胞系用P1GF(2nM)或PlGF及指定肽(l-2^M)處理。24小時后，用MTT評價細(xì)胞的存活力。弁表示P1GF處理細(xì)胞與未處理對照相比i3<0.04。星號("表示與僅P1GF相比尸<0.03(ANOVA)。圖4A-MCF-7人乳腺癌細(xì)胞。圖4B-MDA-MB-468人乳腺癌細(xì)胞。圖4C-MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞。圖5A-5B.帶有MDA-MB-468異種移植物的小鼠用肽BP1或BP3治療。按方法部分中所述，小鼠每隔3-4天用200嗎BP治療。每周2次測量腫瘤體積。在第10天、第14天、第17天和第24天*尸<0.05(月中瘤體積變化(ANOVA))。圖5A-用結(jié)合肽1治療的腫瘤。圖5B-用結(jié)合肽3治療的腫瘤。圖6.hFc的表達(dá)載體。該圖提供示例性載體(pdHL2-sCD20-hFc)的示意圖，該載體用作構(gòu)建表達(dá)hFc的載體(pdHL2-hFc)的沖莫板。重組hFc可按實施例4所述方法與BPl進(jìn)行化學(xué)綴合，或者按實施例5所述方法與hFc融合。說明性實施方案的描述本申請引用的所有文獻(xiàn)或文獻(xiàn)選段包括但不限于專利、專利申請書、文章、書籍和論文，通過引用全部特別結(jié)合到本文中。定義本文所用不定冠詞"a"或"an"可指一項中的一個或多個。本文所用術(shù)語"和"與"或"可用來既指連接詞又指轉(zhuǎn)折連詞。即除非另有說明二者應(yīng)理解為等同于"和/或，，。"配體"是指能夠與靶結(jié)合的任何分子、化合物或組合物。例如，P1GF配體是可與P1GF結(jié)合的配體。結(jié)合能力可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法直接測定，例如使用標(biāo)記配體或靶的放射性檢測、親和層析、免疫沉淀法、點漬法、狹線印跡、蛋白質(zhì)印跡、ELISA、微陣列結(jié)合(microarraybinding)等。或者，可以通過間接方法，例如用噬菌體展示技術(shù)，淘選針對靶的攜帶肽的噬菌體，來測定結(jié)合。所使用的縮寫詞為BSA，牛血清白蛋白；ELISA，酶聯(lián)免疫吸附測定；FGF，成纖維細(xì)胞生長因子；FGFR，成纖維細(xì)胞生長因子受體；FITC，異硫氰酸熒光素；flk-l，VEGF受體II;FIt-l，fms樣酪氨酸激酶-l,VEGF受體I;FLAG,檢測靶蛋白或耙肽的表位附加標(biāo)記系統(tǒng)；HEC,人微血管內(nèi)皮細(xì)胞；HRP，辣根過氧化物酶；IHC,免疫組織化學(xué)；MTT,基于3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基溴化四唑鏡的存活力測定法；PBS，磷酸鹽緩沖鹽水；P1GF，胎盤生長因子；RT,室溫；RTK，受體酪氨酸激酶；UT，未處理對照；VEGF，血管內(nèi)皮生長因子。腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移中的胎盤生長因子(P1GF)P1GF與VEGF的血小板衍生生長因子樣區(qū)有53%同一性(Maglione等，1991，尸rac淑"ca"c/園88:9267-9271)。產(chǎn)生兩種主要的同工型，PlGF-l和PlGF-2。以二聚體分泌，二聚體由132個^J^酸或153個氨基酸單體組成，通過二硫鍵以首尾方式連接(Maglione等，1991),總分子量為46-50kD。由mRNA剪切變異體產(chǎn)生三種同工型，但是僅PlGF-l和PlGF-2得到充分表征(Ahmed等，2000;Cao等，1997，倫c/z削腸;—y4cto235，493-498)。PlGF最早從胎盤中克隆(Maglione等，1991)，P1GF通常由滋養(yǎng)層、正常曱狀腺表達(dá)以及在傷口愈合期間進(jìn)行表達(dá)(Viglietto等，1995，Owcogewe11:1569-1579;Failla等，2000，J/"ve對Derwato/115:388-395)。在滋養(yǎng)層中，P1GF的表達(dá)被低氧應(yīng)激消除(Gleadle等，爿w.J.尸/y^zo/.268:C1362-8,1995)，但是曾在下列情形中發(fā)現(xiàn)低氧驅(qū)動的表達(dá)至少一種原發(fā)性腫瘤(Yonekum等，J.Biol.Chem.274:35172-8,1999)、肺瘤異種移植物(Taylor等，Clin.CancerRes.61:2696-703,2001)和成纖維細(xì)胞(Green等，CancerRes.61:2696-703,2001)。許多惡性月中瘤表達(dá)PlGF受體Flt-l(Luttun等，Nat.Med.8:831-40,2002)。在正常血清中發(fā)現(xiàn)P1GF的水平低，但是在妊娠后期無先兆子癇的女性血清中發(fā)生9-10倍的增加(1^13]^等，2001,7^0///"附7:205-210;Re訓(xùn)kamp等，1999，G，aeco/106:1019-1022;Vuorela-Vepsalainen等，1999，Hwmieprac/14:1346-1351)。即使正常腦組織中不表達(dá)P1GF，但卻在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和腦膜瘤中檢測出P1GF(Gleadle等，1995，J尸/^wo/268:C1362-1368;Donnini等，1999，JPaAo/189:66-71)。在許多其它的原發(fā)性惡性腫瘤中也檢測出P1GF(Nomura等，1998，丄胸腦歸/.40:123-30;Taylor等，2003a，v4^ocCawcer44:4-5[摘要R22];Matsumoto等，2003,爿""cawcer23:3767-3773;Chen等，2004，Ca"cwLe"213:73-82;Wei等，2005，666-672;Lacal等，2000,J/騰WDe匿to/115,1000-1007)。曾經(jīng)還觀察到P1GF表達(dá)與伴有新血管增生的糖尿病性視網(wǎng)膜病有關(guān)(Khaliq等，1998,丄a6/"ve對.78:109-16)。在動物沖莫型中，用P1GF的缺失實驗顯示抑制腫瘤生長，降低視網(wǎng)膜新血管形成(Carmeliet等，2001,胸U.7:575-83)。缺少肝素結(jié)合區(qū)的PlGF-l，僅與Flt-l(亦稱VEGFR1)結(jié)合，而在COOH端有21個氨基酸肝素結(jié)合區(qū)的PlGF-2，則與神經(jīng)氈蛋白-l(neuropilin-l)和Flt-l結(jié)合(Migdala等，1998，J說o/C/zem273:22272-22278;Hauser和Weich，1993，Oow&Factor9:259-268)。當(dāng)與Flt-l結(jié)合時，PlGF-2能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分化、增殖和遷移(Landgren等，1998，O"coge"e16:359-367)。在滋養(yǎng)層中，P1GF的表達(dá)被低氧應(yīng)激消除(Gleadle等，1995),但是曾在下列情形中發(fā)現(xiàn)低氧驅(qū)動的表達(dá)至少一種原發(fā)性腫瘤(Yonekura等，1999，丄CVew.274:35172-8)、腫瘤異種移植物(Taylor等，2004，Pnc爿mO"cwM45:981[摘要4255])和成纖維細(xì)胞(Green等，2001，O臟r板61:2696-2703)。P1GF-1和P1GF-2兩者都天然與VEGF形成異型二聚體。異型二聚體的相對活性可能取決于與VEGF結(jié)合的P1GF的形式。由P1GF-1異構(gòu)體和VEGF組成的異型二聚體在體外或體內(nèi)都幾乎沒有活性或者無活性(Eriksson等，2002,C"""rCe/H:99-108)。另一方面，PlGF-2/VEGF異型二聚體幾乎與VEGF同型二聚體一樣有效(Clauss等，1996，J歷o/C/ew271:17629-17634;Cao等，1996,/說o/Ozem271:3154-3162;DiSalvo等，1995，J&o/C/em270:7717-7723)。P1GF(和VEGF)的受體Flt-l是酪氨酸激酶家族受體(RTK)的成員。以當(dāng)被活化配體結(jié)合時其胞質(zhì)域上酪氨酸殘基的自身磷酸化為特征。Flt-l具有7個胞外Ig樣結(jié)構(gòu)域和一個分隔開的胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。Flt-1與P1GF的相互作用主要依賴于第二胞外域。Flt-l的第四結(jié)構(gòu)域與二聚化有關(guān)，包含有效使Flt-l與其配體緊密締合的肝素結(jié)合區(qū)(Park和Lee，1999,5,oc/ze/w祝o//z"W"Owww"264:730-734)。反向平行P1GF二聚體確保了結(jié)合區(qū)在二聚體的相對兩端上，因此，當(dāng)結(jié)合時，F(xiàn)lt-l最可能使受體緊密締合，使受體連接使之活化(Fuh等，1998，J胸C/2，273:11197-11204;Wiesmann等，1997，Ce//91:695-704)。肝素與PlGF和Flt-l的肝素結(jié)合區(qū)的相互作用可能是P1GF使Flt-l完全活化必不可少的。肝素結(jié)合的作用在成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)-成纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFR)配體-酪氨酸激酶受體對中已得到充分表征(Schlessinger等，2000,Mo/ecw/wCW/6:743-750)。在該實例中，肝素與配體和受體兩者都多重接觸，促進(jìn)FGF-FGFR彼此間的結(jié)合和受體二聚化作用，這是活化中的必需步驟。肝素結(jié)合區(qū)存在于PlGF的更高活性形式(PlGF-2)中，提示肝素可能在經(jīng)PlGF的Flt-l活化中具有作用。在我們的紳瘤復(fù)發(fā)研究中，我們在用》文射性標(biāo)記抗體進(jìn)行細(xì)胞毒處理后，檢測出由存活腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的PlGF(Taylor等，2002a;Taylor等，2003;Taylor等，2002b,Proc爿m/4^ocC朋cwi^y43:10-11[摘要51])，即使在處理前，也無法檢測到P1GF表達(dá)?，F(xiàn)已確認(rèn)的是，P1GF是內(nèi)皮細(xì)胞的存活因子(Adini等，2002，Q/"cer62:2749-2752)，但是經(jīng)處理誘導(dǎo)經(jīng)肺瘤細(xì)胞表達(dá)P1GF是未曾預(yù)料到的發(fā)現(xiàn)(Taylor等，2002a;Taylor等，2003b，/WJC""cw105:158-169)。進(jìn)一步的研究將P1GF表達(dá)與細(xì)胞毒處理后回收量提高聯(lián)系了起來(Taylor等，2003b)。還發(fā)現(xiàn)某些腫瘤細(xì)胞系經(jīng)處理誘導(dǎo)的表達(dá)以及組成型表達(dá)。缺氧-一種腫瘤中因代謝活動或處理所致的普遍情況，導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的PlGF表達(dá)增加(Ahmed等，2000;Taylor等，2002a;Taylor等，2003b)。某些惡性細(xì)胞在其表面的Flt-l表達(dá)水平低，然而通過配體-受體的直接信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用未得到充分表征。這些發(fā)現(xiàn)提示P1GF可能對腫瘤細(xì)胞及在腫瘤環(huán)境下發(fā)揮作用。本說明書研究了PlGF和Flt-l對人乳腺癌細(xì)胞和異種移植物的直接作用。P1GF和VEGF在血管生成中的相對作用PlGF和VEGF都與Flt-l受體結(jié)合，而且據(jù)報道兩者都刺激腫瘤和正常組織的血管生成。已經(jīng)對VEGF與Flt-l受體結(jié)合對血管生成的作用進(jìn)行了研究(El-Mousawi等，2003，,說o/.C/zem278:46681-91;美國專利申請公布號20040266694)。El-Mousawi等人(2003)使用隨機(jī)16-mer噬菌體展示系統(tǒng)對重組Flt-l進(jìn)行淘選以分離幾種明顯的VEGF結(jié)合肽。觀察到稱為V5.2的肽有最強(qiáng)的相互作用。據(jù)報道，將V5.2加到用VEGF或P1GF刺激的HUVEC和HCEC內(nèi)皮細(xì)胞中抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，另據(jù)報道稱在Matrigel中抑制VEGF介導(dǎo)的HCEC遷移和VEGF誘導(dǎo)的毛細(xì)管形成(El-Mousawi等，2003)。有研究表明V5.2的這些作用是通過與Flt-l受體結(jié)合介導(dǎo)的(出處同上)。然而，這些作者沒有表征與V5.2結(jié)合的Flt-l的結(jié)構(gòu)域，并且沒有確定V5.2的作用是否與Flt-l的肝素激活拮抗。在各種實施方案中，如果涉及P1GF配體與另一種抗血管生成藥(例如抗VEGF藥物)聯(lián)用時，則肽V5.2和類似的VEGF抑制劑可能是有用的。Malik等人研究了VEGF-A、VEGF-B和P1GF在血管生成中的作用(Malik等,"RedundantrolesofVEGF-BandP1GFduringselectiveVEGF-Ablockadeinmice"，Blood,2005年9月27日在線發(fā)表)。這些作者報道了缺少VEGF-B或P1GF的小鼠只顯示較小的發(fā)育缺陷。VEGF-A活性的抑制與VEGF-A、VEGF-B和P1GF的抑制相比，對新生小鼠的生長和存活產(chǎn)生類似的作用，包括血管生成減少。得出的推論AP1GF和VEGF-B不能補(bǔ)償阻斷VEGF-A,表明VEGF-B和P1GF激活的VEGFR-l受體比起VEGF-A激活的VEGFR-2，在出生后的發(fā)育和成人血管穩(wěn)態(tài)中起著相對較小的作用。這些結(jié)果與其它報道相沖突，其它才良道稱在抑制異種移植物腫瘤生長和血管生成中，抗VEGFR-l抗體幾乎與抗VEGFR-2抗體同樣有效(Carmeliet等，2001，」VW.7:575-83;Stefanik等，2001,J.A^wra朋co/.55:91-100)。有研究提出VEGF陽B和P1GF可能參與調(diào)節(jié)成人病理性血管生成期間的炎性活動(Malik等，2005)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，本文所公開的PIGF配體可與一種或多種VEGF抑制劑聯(lián)用?？梢允褂玫腣EGF抑制劑包括新伐司他(Neovastat⑧)(Falardeau等，2001，0"co/28:620-25)、IM862(Tupule等，2000，丄C"".0"co/.18:716-23)，Angiozyme(RPI國4610)(Weng和Usman，2001，Cw/r.0"co/.3:141-46)、貝伐單抗(Gordon等，2001，J.C/z"O"co/.19:843-50)、Semaxanib(SU-5416)(Fong等，1999，Owcer/化59:99)和TNP-470(Figg等，1997，P/2amjocW/2era/7y17:91-97)。通過抑制血管生成治療性治療患者在各種實施方案中，涉及可以阻斷或抑制P1GF介導(dǎo)的血管生成的P1GF配體的方法和組合物應(yīng)用于治療以病理性血管生成為特征的這些疾病中。這些疾病的實例包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、節(jié)段性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病、譯喘、水腫、肺動脈高壓、肺瘤的形成與發(fā)展、牛皮癬、糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑變性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、心肌血管生成、斑塊新血管形成、再狹窄、血管創(chuàng)傷后新內(nèi)膜形成、毛細(xì)管擴(kuò)張、血友病性關(guān)節(jié)、血管纖維瘤、慢性炎癥相關(guān)的纖維化、肺纖維化、深部靜脈血栓形成、傷口肉芽形成和腫瘤血管生成、生長和存活。不是所有患血管生成或細(xì)胞移動相關(guān)疾病狀態(tài)的患者在患病組織中表達(dá)P1GF,本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，在某些實施方案中，可以利用離體和/或體內(nèi)PlGF表達(dá)測定法，鑒定最可能從靶向P1GF的治療性干預(yù)中獲益的患者。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，抗血管生成療法可以使用一種或多種本文所公開的P1GF配體，在某些替代實施方案中，可包括給予本領(lǐng)域已知的其它抗血管生成藥，例如內(nèi)皮生長抑素(endostatinTM)、血管生長抑素、層粘連蛋白肽、纖連蛋白肽(包括ED-B纖連蛋白)、纖溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白介素12、IP-10、Gro-P、血小板應(yīng)答蛋白、2-曱氧基雌二醇、增殖蛋白相關(guān)蛋白、carboxiamidotriazole、CM101、馬立馬司4也、戊聚斗唐多聚硫酸酯、促血管生成素2、干擾素-a、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利諾胺、沙利度胺、己酮可可堿、染料木堿、TNP-470、紫杉醇、accutin、血管生長抑素、西多福韋、長春新堿、博來霉素、AGM-1470、血小板因子4或二甲胺四環(huán)素。技術(shù)人員還應(yīng)理解的是，在治療腫瘤患者的情況中，本文所公開的P1GF配體可與將在下面更為詳細(xì)討論的任何已知的癌癥療法聯(lián)用。已知的癌癥療法包括但不限于給予化療藥物、放射療法、手術(shù)切除、局部高溫、抗肺瘤抗體和其它抗血管生成藥。給予肽要求保護(hù)的方法和/或組合物的各種實施方案可涉及給予患者一種或多種治療用肽?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何途徑給予，包括但不限于口服、經(jīng)鼻、口腔、吸入、直腸、陰道、局部給予、原位(orthotopic),真皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)或靜脈注射給予?？诜o予患者的未修飾肽可在消化道內(nèi)降解，且根據(jù)序列和結(jié)構(gòu)可顯示穿過腸內(nèi)層的吸收不佳。但是，眾所周知的是用化學(xué)方法修飾肽從而賦予其對內(nèi)源性蛋白酶降解較低的敏感性或者增加其通過消化道的吸收(參見例如Blondelle等，1995,Biophys.J.69:604-11;Ecker和Crooke,1995,Biotechnology13:351-69;Goodman和Ro,1995,BURGER'SMEDICINALCHEMISTRYANDDRUGDISCOVERY,笫I巻，主編Wollf,JohnWiley&Sons;Goodman和Shao,1996,Pure&Appl.Chem.68:1303-08)?？稍谂c所選擇目標(biāo)(例如PIGF)結(jié)合的肽上實施這些方法。文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了制備肽類似物(例如含有D-氨基酸的肽)的文庫、由模擬肽結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子組成的肽模擬物、或擬肽例如插烯(vinylogou)擬肽的方法，且可用于構(gòu)建適于口服給予患者的PIGF結(jié)合肽。在某些實施方案中，可以在要求保護(hù)的方法和組合物的范圍內(nèi)，應(yīng)用模擬已知P1GF配體(例如BP-1、BP-2、BP-3或BP-4)結(jié)構(gòu)的肽模擬物的制備和給藥方法。在這些化合物中，標(biāo)準(zhǔn)的肽鍵連接可被一種或多種備選連接基團(tuán)置換，例如CH2-NH、CH2-S、CH2-CH2、CH=CH、CO-CH2、CHOH-CH2等。用于制備肽才莫擬物的方法是眾所周知的(例如Hruby,1982,h/e31:189-99;Holladay等，1983,re^a/^firow24:4401-04;Jennings-White等,1982，rwra/zefirow23:2533;Almquiest等，1980,丄AfedC/iem.23:1392-98;Hudson等，1979,/W.J.尸e;f.i^s.14:177-185;Spatola等，1986,Z^/e38:1243-49;美國專利號5,169,862、5,539,085、5,576,423、5，051,448、5,559,103，各所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)。與其肽類似物相比，肽模擬物表現(xiàn)出穩(wěn)定性提高和/或體內(nèi)吸收增加?；蛘?，可經(jīng)口服給予治療用肽，使用N端和/或C端封端(capping)以防止外肽酶活性。例如，C端可以用酰胺肽封端，而N端可以通過肽的乙酰化封端。也可將肽環(huán)化以阻斷外肽酶，例如通過形成環(huán)酰胺、二硫化物、醚、硫化物等。也可通過用D-氨基酸替代天然存在的L-氨基酸，而使肽穩(wěn)定化，尤其是在已知內(nèi)肽酶起作用的位置上發(fā)生取代。內(nèi)肽酶結(jié)合和切割序列是本領(lǐng)域已知的，摻入D-氨基酸的肽的制備和使用方法已有記載(例如美國專利申請公布號20050025709,McBride等，2005年3月2日申請，所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)。另一個替代方法可使用包含兩端與半胱氨酸殘基相接的BP-1、BP-2、BP-3或BP-4序列并且由全部D-氨基酸組成的環(huán)肽。這樣的D-氨基酸環(huán)狀類似物可具有與L型相同的折疊構(gòu)象，這可用本領(lǐng)域已知技術(shù)，通過計算機(jī)建才莫研究進(jìn)行評價。在優(yōu)選的實施方案中，修飾肽顯示出以納摩爾或更低范圍的P1GF結(jié)合。通過標(biāo)準(zhǔn)測定法(例如ELISA),可以測定修飾肽的P1GF結(jié)合。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，肽修飾后應(yīng)測定靶結(jié)合活性以指導(dǎo)肽修飾過程。在某些實施方案中，肽和/或蛋白質(zhì)可以通過與蛋白酶抑制劑和/或肽酶抑制劑共同配制，經(jīng)口服給予?？诜f送治療用肽的其它方法公開于Mehta("OraldeliveryandRecombinantproductionofpeptidehormones",2004年6月，5/o尸/2arm/加ema"owcr/)?？梢阅c溶衣的固體劑型給予肽，該劑型的賦形劑調(diào)節(jié)腸道蛋白水解活性并增加肽穿過腸壁而轉(zhuǎn)運。應(yīng)用該技術(shù)，完整肽的相對生物利用度范圍為給藥劑量的1%-10%。使用含有膽酸鈉和蛋白酶抑制劑的腸溶衣微膠嚢劑，已經(jīng)成功將比本文所公開的P1GF結(jié)合肽大得多的蛋白質(zhì)(胰島素)給予狗(Ziv等，l"4,丄A/,"eri仏18(增刊2):792-94。用?；舛緣A作為滲透增強(qiáng)劑和腸溶衣，已經(jīng)實現(xiàn)了口服給予肽(EudragitL30D-55,RohmPharmaPolymers,參見Mehta,2004)。用于口服給予肽的賦形劑通常包括一種或多種腸道蛋白酶抑制劑/肽酶抑制劑以及去垢劑或其它試劑，以提高肽的溶解度或吸收，它們可以包裝在腸溶衣膠嚢或片劑中(Mehta,2004)。腸溶衣是抗酸的，允許肽穿過胃進(jìn)入腸道吸收。膠嚢中可以包含有機(jī)酸，一旦膠嚢在腸道中溶解時，有機(jī)酸就可酸化腸道并抑制腸道蛋白酶活性(Mehta,2004)?？诜f送肽的另一替代方法包括與基于聚乙二醇(PEG)的兩親寡聚體綴合，該兩親寡聚體增加吸收和對酶促降解的抗性(Soltero禾口Ekwuribe,2001，尸/zar附.rec/wo/.6:110)。在又一些實施方案中，可以通過與某些蛋白質(zhì)(例如IgGl的Fc區(qū))綴合而修飾肽(例如PlGF結(jié)合肽)，用于口服或吸入給藥(參見實施例3-7)。肽-Fc綴合物的制備和使用方法公開于例如Low等(2005,i^pracf.20:1805-13)和Dumont等(2005,丄v4eraso/.A/W.18:294-303),所述各文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。Low等(2005)公開了采用在CHO細(xì)胞中的重組表達(dá)，將FSH的a和(3亞基與IgGlFc區(qū)以單鏈或異型二聚體的形式綴合。Fc綴合的肽通過新生Fc受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)穿過肺或腸道的上皮細(xì)胞吸收。與天然肽相比，F(xiàn)c綴合的肽表現(xiàn)出體內(nèi)穩(wěn)定性提高，吸收增加。還觀察到異型二聚體綴合物的活性要比單鏈形式的高。應(yīng)用Fc綴合，通過吸入法還可有效地遞送較大的蛋白質(zhì)，例如紅細(xì)胞生成素(Dumont等，2005)。在替代實施方案中，可以通過吸入途徑給予治療用肽(例如Sievers等，2001,jpp/C/iem.73:1299-1303)。超臨界二氧化碳霧化已經(jīng)用來從包括蛋白質(zhì)和肽的各種藥物中產(chǎn)生納米尺度或微米尺度的顆粒(出處同上)?？赏ㄟ^將超臨界二氧化碳與水性蛋白質(zhì)或肽溶液混合所形成的微氣泡，在比形成藥物粉劑的備選方法低的溫度(25-65。C)下干燥，仍保持治療用肽的結(jié)構(gòu)和活性(出處同上)。在某些情況下，可以將例如海藻糖、蔗糖、其它糖類、緩沖劑或表面活性劑等穩(wěn)定性化合物加到溶液中以進(jìn)一步保持功能活性。所形成的顆粒足夠小，可通過吸入法給藥，避免了腸道蛋白酶/腸道肽酶和穿過胃腸內(nèi)層吸收的某些問題。給予患者治療用肽的劑量可以變化，取決于藥代動力學(xué)特征、給藥方式和途徑、患者年齡、體重和健康狀態(tài)、癥狀的性質(zhì)和程度、并用療法和治療頻率。肽劑量的范圍介于約lmg/50kg體重和3000mg/50kg體重之間，優(yōu)選10-1000mg/50kg，更優(yōu)選25-800mg/50kg。介于8mg/50kg和800mg/50kg的劑量可以分成每天l-6劑給藥，或者以緩釋形式給藥。在一項研究中，給予病人單次500ng的肽劑量導(dǎo)致90-180分鐘內(nèi)的峰值血漿濃度范圍約150-600pg/ml(Mehta，2004)。噬菌體展示要求保護(hù)的組合物和/或方法的某些實施方案涉及各種蛋白質(zhì)靶標(biāo)(例如P1GF)的結(jié)合肽和/或肽模擬物?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法筌定P1GF結(jié)合肽(BP)，該方法包括但不限于噬菌體展示技術(shù)。用于產(chǎn)生多樣化肽群體的各種噬菌體展示方法和技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，美國專利第5,223,409、5,622,699和6,068,829號(所述各專利通過引用結(jié)合到本文中)公開了制備噬菌體文庫的方法。噬菌體展示技術(shù)包括對噬菌體進(jìn)行遺傳操作，使得小肽可以在其表面表達(dá)(Smith和Scott,1985,Science228:1315-1317;Smith和Scott,1993，Meth.Enzymol.21:228-257)。過去十幾年來，在噬菌體展示肽文庫的構(gòu)建和用該肽文庫分離肽配體的篩選方法的開發(fā)方面已取得很大進(jìn)展。例如，使用肽文庫可以表征許多蛋白質(zhì)內(nèi)的相互作用位點和受體-配體結(jié)合基序，所述蛋白質(zhì)例如參與炎癥反應(yīng)的抗體或介導(dǎo)細(xì)胞粘附的整聯(lián)蛋白。該方法也已用于鑒定新的肽配體，這可用作對肽^^擬藥物或造影劑開發(fā)的前導(dǎo)(Arap等，1998a,Science279:377-380)。除了肽之外，更大的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(例如單鏈抗體)也可展示在噬菌體顆粒表面(Arap等，1998a)?？梢酝ㄟ^淘選，來分離對給定的器官、組織、細(xì)胞類型或靶分子具有選擇性的尋靶氨基酸序列(Pasqualini和Ruoslahti，1996,Nature380:364-366;Pasqualini,1999,TheQuart.J.Nucl.Med.43:159-162)。簡而言之，將含有推定尋靶肽的噬菌體文庫給予完整生物體或給予分離的器官、組織、細(xì)胞類型或靶分子，收集含有結(jié)合噬菌體的樣品?？梢詮陌衅鞴?、靶組織、靶細(xì)胞類型或靶分子上洗脫出與靶標(biāo)連接的噬菌體，然后通過在宿主菌中培養(yǎng)而擴(kuò)增。在某些實施方案中，可以在幾輪淘選中使噬菌體在宿主菌中增殖。細(xì)菌不被噬菌體裂解，而是分泌多拷貝噬菌體，這些噬菌體展示特定插入物。如有必要，可再次將擴(kuò)增的噬菌體暴露給靶器官、草巴組織、靶細(xì)胞類型或靶分子，并收集起來用于進(jìn)一步多輪淘選?？梢赃M(jìn)行多輪淘選，直至得到選擇性或特異性結(jié)合物群體?？梢詫κ删w基因組中靶向肽插入物的相應(yīng)DNA進(jìn)行測序，從而確定肽的氨基酸序列。然后可通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)產(chǎn)生經(jīng)鑒定的靶向肽作為合成肽(Arap等，1998a，Smith等，1985)。在一些實施方案中，可以應(yīng)用減法方案(subtractionprotocol)以進(jìn)一步降低本底噬菌體結(jié)合。減法的目的是從與不是目標(biāo)耙的靶標(biāo)結(jié)合的文庫中去除噬菌體。在替代實施方案中，可針對對照細(xì)胞、組織或器官對噬菌體文庫進(jìn)行預(yù)篩選。例如，在針對對照正常細(xì)胞系對文庫進(jìn)行預(yù)篩選后，可以鑒定出腫瘤結(jié)合肽。減去以后，可以針對目標(biāo)分子、細(xì)胞、組織或器官篩選出文庫。減法方案的其它方法是已知的，可以用于實施要求保護(hù)的方法中，例如參見美國專利笫5,840,841、5,705,610、5,670,312和5,492,807號，所述專利通過引用結(jié)合到本文中。蛋白質(zhì)和肽在本文要求保護(hù)的方法和組合物的范圍內(nèi)，可以使用各種多肽或蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，蛋白質(zhì)可包含抗體或含有抗原結(jié)合位點的抗體片段。在其它實施方案中，把標(biāo)(例如P1GF)的短肽配體，可用于各種目的，例如檢測細(xì)胞、組織或器官中P1GF受體的存在，抑制或阻斷P1GF與其受體結(jié)合，促進(jìn)或激活PlGF與其受體結(jié)合或者^f莫擬部分P1GF分子或其受體。本文所用的蛋白質(zhì)、多肽或肽通常是指但不限于大于約200個氨基酸多至自基因翻譯的全長序列的蛋白質(zhì)；大于約IOO個氨基酸的多肽；和/或約3至約100個氨基酸的肽。為了方便起見，術(shù)語"蛋白質(zhì)"、"多肽"和"肽"在本文可互換使用。因此，術(shù)語"蛋白質(zhì)或肽"包括氨基酸序列，所述序列包含天然蛋白質(zhì)中存在的20種常見氨基酸中的至少一種，或至少一個修飾氨基酸或稀有氨基酸。本文所用的"氨基酸殘基"是指本領(lǐng)域已知的任何天然存在的氨基酸、任何氨基酸衍生物或任何氨基酸模擬物。在某些實施方案中，蛋白質(zhì)或肽殘基是連續(xù)的，沒有任何非氨基酸間插在氨基酸殘基序列中。在其它實施方案中，序列可包含一個或多個非氨基酸部分。在具體實施方案中，蛋白質(zhì)或肽殘基序列可以間插一個或多個非氨基酸部分。因此，術(shù)語"蛋白質(zhì)或肽"包括氨基酸序列，該序列包含天然蛋白質(zhì)中存在的20種常見氨基酸中的至少一種，或者至少一個修飾氨基酸或稀有氨基酸，包括但不限于下表4所列氨基酸。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表4<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法制備蛋白質(zhì)或肽，所述方法包括通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)表達(dá)蛋白質(zhì)、多肽或肽，從天然來源分離出蛋白質(zhì)或肽，或者化學(xué)合成蛋白質(zhì)或肽。先前已經(jīng)公開了對應(yīng)于不同基因(例如P1GF基因)的核苦酸和蛋白質(zhì)、多肽和肽序列，并且可以在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的計算機(jī)數(shù)據(jù)庫中查詢。一個這樣的數(shù)據(jù)庫就是國立生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的Genbank和GenPept數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/)。采用本文所7>開的4支術(shù)或本領(lǐng)》或普通才支術(shù)人員已知技術(shù)，可以擴(kuò)增和/或表達(dá)已知基因的編碼區(qū)?；蛘?，各種市售的蛋白質(zhì)、多肽和肽制劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。肽模擬物多肽制備的另一實施方案是采用肽模擬物。模擬物是含肽分子，其才莫擬蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)組件。參見例如Johnson等，"PeptideTurnMimetics"載于萬/(97EC7fiV(9丄(9Gy"AVZ)尸/L4M"CT,Pezzuto等主編，ChapmanandHall,NewYork(1993)，所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。使用肽模擬物的基本原理是，蛋白質(zhì)肽主鏈的存在，主要能適應(yīng)氨基酸側(cè)鏈，以便于分子的相互作用，例如抗體與抗原的相互作用。預(yù)期肽模擬物允許類似于天然分子的分子相互作用。可以采用這些原理來改造第二代分子，所述分子具有本文所公開的結(jié)合肽的許多天然特性，但也具有改變或改進(jìn)的特性，例如通過胃或腸的吸收增加和/或體內(nèi)穩(wěn)定性或活性提高。融合蛋白不同實施方案可涉及融合蛋白。這些分子通常具有肽的全部或重要部分，其在N-端或C-端與第二多肽或蛋白質(zhì)的全部或部分連接。例如，融合可用來自其它物種的前導(dǎo)序列，以便在異源宿主中進(jìn)行蛋白質(zhì)的重組表達(dá)。另一可用的融合包括加入免疫活性區(qū)，例如抗體表位。而另一有用的融合形式可包括連接用于純化的部分，例如FLAG表位(Prickett等，1989,Wofechm'gwes7:580國589;Castrucci等，1992,JFzra/66:4647-4653)。融合蛋白的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這些蛋白質(zhì)可通過如下方式制備例如通過使用雙官能交聯(lián)劑的化學(xué)連接，通過從頭合成完整的融合蛋白，或者通過將編碼第一蛋白質(zhì)或肽的DNA序列與編碼第二肽或蛋白質(zhì)的DNA序列連接在一起，再進(jìn)行完整融合蛋白的表達(dá)。蛋白質(zhì)純化在一些實施方案中，可以分離或純化蛋白質(zhì)或肽。蛋白質(zhì)純化技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。這些技術(shù)在一個水平上包括將細(xì)胞、組織或器官勻漿并粗略分級分離出多肽和非多肽部分?？梢圆捎脤游黾夹g(shù)和電泳技術(shù)進(jìn)一步純化目標(biāo)蛋白或多肽，達(dá)到部分純化或完全純化(或者純化至同質(zhì))。特別適于制備純肽的分析方法是離子交換層析、凝膠排阻層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳、親和層析、免疫親和層析和等電聚焦。一個特別有效的肽的純化方法是快速蛋白液相層析(fplc)或甚至Ahplc。適用于蛋白質(zhì)純化的各種技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。這些方法包括例如與硫酸銨沉淀、PEG、抗體等，或者通過熱變性，緊接著離心；層析步驟例如離子交換層析、凝膠過濾層析、反相層析、羥磷灰石層析和親和層析；等電聚焦；凝膠電泳；及這些技術(shù)和其它技術(shù)的結(jié)合。如本領(lǐng)域通常所知，一般認(rèn)為可以改變各種純化步驟的操作順序，或者可以省略某些步驟，仍可得到用于制備基本純的蛋白質(zhì)或肽的合適方法。通常不要求總是以最純狀態(tài)提供蛋白質(zhì)或肽。實際上，在某些實施方案中，預(yù)期不太純的產(chǎn)物是有用的?？梢杂幂^少的純化步驟組合，或者采用同一通用純化流程的不同形式，實現(xiàn)部分純化。例如，要理解的是，用HPLC儀進(jìn)行的陽離子交換柱層析，一般導(dǎo)致純化"倍數(shù)"比用低壓層析系統(tǒng)相同技術(shù)的高。顯示純化程度相對較低的方法，可在蛋白質(zhì)產(chǎn)物的總回收或者在維持表達(dá)蛋白質(zhì)的活性方面具有優(yōu)勢。親和層析是依賴于被分離物質(zhì)與其可特異性結(jié)合分子之間的特異性親和力的層析方法。這是一種受體-配體類型的相互作用。通過將結(jié)合配偶體之一與不溶性基質(zhì)共價偶聯(lián)，不溶性基質(zhì)例如磁珠(Dynal)或瓊脂糖凝膠(Sepharose)或交聯(lián)葡聚糖珠(Pharmacia)，來合成柱材料。然后柱材料能夠特異性地吸收溶液中的物質(zhì)。通過改變條件使得不再結(jié)合而洗脫出來(例如pH、離子強(qiáng)度、溫度等改變)?；|(zhì)應(yīng)該是本身不以任何顯著程度吸收分子并且具有大范圍的化學(xué)、物理和熱穩(wěn)定性的物質(zhì)。配體應(yīng)該以不影響其結(jié)合性能的方式偶聯(lián)。配體還應(yīng)該沖是供相對牢固的結(jié)合。而且應(yīng)該可以洗脫出物質(zhì)而又不石皮壞樣品或配體。合成肽按照常規(guī)技術(shù)，可以在溶液中或在固相支持體上，合成完整或部分的蛋白質(zhì)或肽。各種自動合成儀是市售的，可按照已知方案來使用。參見例如Stewart和Young,(1984,尸e;"t/e5>"^^,》，第2版，PierceChemicalCo.);Tam等(1983,J.C/zew.Soc,105:6442);Merrifield(1986，Sc/e"ce,232:341-347);和Barany和Merrifield(1979,尸e/7"cfes,Gross和Meienhofer主編，AcademicPress,NewYork,第l-284頁)。按照這些方法，可以容易地合成通常約6至約35-50個氨基酸的短肽序列?；蛘撸梢圆捎弥亟MDNA技術(shù)，其中將編碼目標(biāo)肽的核苷酸序列插入表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到合適宿主細(xì)胞內(nèi)，并在適于表達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。抗體不同實施方案可涉及靶標(biāo)的抗體配體(例如抗P1GF抗體)。本文所用的術(shù)語"抗體"是指具有抗原結(jié)合區(qū)的抗體樣分子，包括抗體片段，例如Fab'、Fab、F(ab')2、單域抗體(DAB)、Fv、scFv(單鏈Fv)等。各種基于抗體的構(gòu)建體和片段的制備和使用技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的?？贵w的制備和表征方法也是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如Harlowe和Lane,1988,/4礎(chǔ)h^es:jZ^ora〖o(jì)r少Af朋wa/,ColdSpringHarborLaboratory)。所用的抗體也可以是市售的，得自各種已知來源。例如，各種分泌抗體的雜交瘤系可得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC,Manassas,VA)。多克隆抗體可以通過用免疫原免疫動物，從免疫動物中收集抗血清，來制備多克隆抗體。許多動物物種可用于產(chǎn)生抗血清。通常用于產(chǎn)生抗血清的動物為非人類動物，例如兔、小鼠、大鼠、倉鼠、豬或馬。因為兔的血量相對較大，所以兔是產(chǎn)生多克隆抗體的優(yōu)選選擇?？梢圆捎贸Ｒ?guī)免疫技術(shù)制備多克隆和單克隆抗體?？梢杂煤锌乖砦坏慕M合物免疫一種或多種實驗動物，例如兔或小鼠，然后用來繼續(xù)產(chǎn)生特異性抗體。在抗體產(chǎn)生的許可時間之后，只要通過給動物放血，從全血中制備血清樣品，便可獲得多克隆抗血清。給定的組合物可以改變其免疫原性。因此，加強(qiáng)宿主免疫系統(tǒng)常常是必需的，因為可通過將免疫原與載體偶聯(lián)獲得。示例性和優(yōu)選的載體是匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其它白蛋白例如卵清蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可以用作載體。將抗原與載體蛋白綴合的方法是眾所周知的，包括交聯(lián)劑例如戊二醛、間馬來酰亞胺苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯、碳二亞胺和雙重氮聯(lián)苯胺(bis-biazotizedbenzidine)?？梢酝ㄟ^使用免疫應(yīng)答的非特異性刺激物(稱為佐劑)，增強(qiáng)具體免疫原組合物的免疫原性。示例性和優(yōu)選的佐劑包括完全弗氏佐劑(Freund'sadjuvant)(—種含有殺死結(jié)核分支桿菌(A^co6a"ehwwrt^wcw/o^O的免疫應(yīng)答非特異性刺激物)、不完全弗氏佐劑和氫氧化鋁佐劑。用于產(chǎn)生多克隆抗體的免疫原組合物的量隨免疫原的性質(zhì)以及用來免疫的動物而變化。可采用多種途徑給予免疫原(皮下、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi))?？稍诿庖咧蟛煌瑫r間點上采集免疫動物血樣而監(jiān)測多克隆抗體的產(chǎn)生。還可給予第二次(加強(qiáng))注射。重復(fù)加強(qiáng)和滴定過程直到達(dá)到合適滴度。當(dāng)獲得所需的免疫原性水平時，可給免疫動物放血，分離并保存血清，和/或動物可用來產(chǎn)生單克隆抗體。單克隆抗體通過應(yīng)用眾所周知的技術(shù)(例如美國專利4,1%,265中所例舉的技術(shù))，可容易地制備單克隆抗體。通常這種技術(shù)包括用選定的免疫原組合物免疫合適的動物。按有效刺激抗體產(chǎn)生細(xì)胞的方式給予免疫組合物。優(yōu)選得自嚙齒動物(例如小鼠和大鼠)的細(xì)胞。更優(yōu)選小鼠，最優(yōu)選BALB/c小鼠，因為這是最常用的，一般提供較高百分比的穩(wěn)定融合物。免疫后，篩選可產(chǎn)生抗體、具體地講B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)的體細(xì)胞，用于mAb產(chǎn)生方法?？梢詮钠?、扁桃腺或淋巴的活檢組織中，或者從外周血樣品中得到這些細(xì)胞。優(yōu)選脾細(xì)胞和外周血細(xì)胞，后者則是因為外周血易于獲得。通常免疫一組動物，取出具有最高抗體滴度的動物脾臟，脾臟用注射器勻漿，獲得脾淋巴細(xì)胞。通常得自免疫小鼠的脾大約含有5x107-2x108個淋巴細(xì)胞。然后，將得自免疫動物的產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞與無限增殖化骨髓瘤細(xì)胞融合，一般該細(xì)胞與被免疫的動物是同一物種。適用于雜交瘤生成融合物方法的骨髓瘤細(xì)胞系優(yōu)選不產(chǎn)生抗體，具有高融合效率，因酶缺陷故不能在僅供所需要的融合細(xì)胞(雜交瘤)生長的特定選擇性培養(yǎng)基中生長?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種骨髓瘤細(xì)胞的任一種。例如，如果免疫動物是小鼠，則可以使用P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NSl/l.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC國ll、MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0Bul;對于大鼠，則可以使用R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和48210;U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6也都可用于與細(xì)胞融合?？贵w生成脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞雜合的產(chǎn)生方法通常包括將體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞按比率2:1相混合，在促進(jìn)細(xì)胞膜融合的一種或多種成分(化學(xué)或電)存在下，所述比率可分別在約20:1至約1:1間變化。有文獻(xiàn)記載了用仙臺病毒和用聚乙二醇(PEG)的融合方法，例如37。/。(體積/體積)PEG。采用電誘導(dǎo)融合方法也是適合的。在低頻度下(大約lxlO-s至lxl(T8),融合方法通常產(chǎn)生活的雜合體。然而，這并不構(gòu)成問題，因為通過在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，的未融合骨髓瘤細(xì)胞)區(qū)分開來。選擇性培養(yǎng)基一般是含有阻斷組織培養(yǎng)基中核香酸從頭合成的藥劑的培養(yǎng)基。示例性和優(yōu)選的藥劑為M蝶呤、甲氨蝶呤和重氮絲氨酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻斷嘌呤和嘧啶從頭合成，而重氮氨基酸僅阻斷噪呤合成。如果使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤，則培養(yǎng)基補(bǔ)充次黃噤呤和胸苷作為核苷酸來源(HAT培養(yǎng)基)。如果使用重氮絲氨酸，則培養(yǎng)基補(bǔ)充次黃嘌呤。優(yōu)選的精選培養(yǎng)基^HAT。僅能夠進(jìn)行核苷酸補(bǔ)救途徑的細(xì)胞能夠在HAT培養(yǎng)基中存活。骨髓瘤細(xì)胞缺少補(bǔ)救途徑的關(guān)鍵酶，例如次黃噪呤-疇酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)，因此他們不能存活。B細(xì)胞可以進(jìn)行該途徑，但是它們在培養(yǎng)中的壽命有限，一般兩周內(nèi)死亡。因此，僅可在選擇性培養(yǎng)基中存活的細(xì)胞是由骨髓瘤和B細(xì)胞形成的雜合細(xì)胞。這種培養(yǎng)提供一群雜交瘤，從中篩選特異性雜交瘤。通常在微量滴定板中通過單克隆稀釋培養(yǎng)細(xì)胞后，檢測符合所需反應(yīng)性的單克隆的上清液(約2-3周后)，進(jìn)行雜交瘤的篩選。該測定應(yīng)該是靈敏、簡易和快速的，例如放射免疫測定、酶免疫測定、細(xì)胞毒性測定、噬菌斑測定、免疫酶斑測定等等。然后，將選出的雜交瘤連續(xù)稀釋，克隆成單種抗體產(chǎn)生細(xì)胞系，然后將該克隆無限繁殖以提供mAb?？梢詢煞N基本方式利用細(xì)胞系產(chǎn)生mAb?？蓪㈦s交瘤樣品注射到組織相容性動物類型體內(nèi)(通常為腹膜腔內(nèi))，該類型的動物用來提供最初融合的體細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞。經(jīng)注射動物出現(xiàn)分泌由融合雜合細(xì)胞產(chǎn)生的特異性單克隆抗體的腫瘤。然后，可以放出動物體液(例如血清或腹水)以提供高濃度的mAb。也可以體外培養(yǎng)單個細(xì)胞系，其中mAb自然分泌到培養(yǎng)基中，從培養(yǎng)基中可容易地獲得高濃度的mAb。如有需要，可以用過濾、離心和各種層析方法(例如HPLC或親和層析)，對由兩種方法產(chǎn)生的mAb進(jìn)行進(jìn)一步純化?？贵w片段的產(chǎn)生要求保護(hù)的方法和/或組合物的某些實施方案可涉及抗體片段。這類抗體片段可用常規(guī)方法由胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗體而獲得。例如，抗體片段可通過將抗體用胃蛋白酶酶促切割而得到，以提供5S片段(稱為F(ab')2)。該片段還可用巰基還原劑切割，并且任選使用針對二硫鍵斷裂得到的巰基的封閉基團(tuán)，以產(chǎn)生3.5SFab'單價片段。或者，用胃蛋白酶的酶促切割產(chǎn)生兩個單價Fab片段和一個Fc片段?？贵w片段的示例性制備方法^^開于美國專利第4,036,945號；美國專利第4,331,647號；Nisonoff等，1960,Arch.Biochem.Biophys.,89:230;Porter,1959,Biochem.J.,73:119;Edelman等，1967,METHODSINENZYMOLOGY,第422頁(AcademicPress)和Coligan等(編著)，1991,CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY,(JohnWiley&Sons)。也可釆用切割抗體的其它方法，例如分離重鏈以形成單價輕鏈-重鏈片段、進(jìn)一步切割片段或其它酶促、化學(xué)或遺傳技術(shù)，只要片段能結(jié)合被完整抗體識別的抗原。例如，F(xiàn)v片段包括VH和Vi鏈的締合。該締合可以是非共價的,參見Inbar等，1972，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,69:2659?；蛘?，可變鏈可以由分子間二硫4定連接或由化學(xué)試劑(例如戊二醛)交聯(lián)。參見Sandhu,1992,Crit.Rev.Biotech.，12:437。優(yōu)選Fv片段包含由肽接頭連接的VH鏈和Vt鏈。通過構(gòu)建包含DNA序列的結(jié)構(gòu)基因，制備這些單鏈抗原結(jié)合蛋白(sFv)，所述DNA序列編碼VH區(qū)和VL區(qū)，這兩區(qū)由寡核普S臾接頭序列連接。將結(jié)構(gòu)基因插入到表達(dá)載體中，隨后導(dǎo)入宿主細(xì)胞例如大腸桿菌內(nèi)。重組宿主細(xì)胞合成單一多肽鏈，其具有接頭肽連接兩個V區(qū)。sFv的制備方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見Whitlow等，1991,Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology2:97;Bird等，1988,Science,242:423;美國專利第4,946,778號；Pack等，1993,Bio/Technology,11:1271和Sandhu，1992,Crit.Rev.Biotech.,12:437。另一形式的抗體片段是編碼單個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的肽。通過構(gòu)建目標(biāo)抗體CDR的編碼基因可以得到CDR肽("最小識別單元")。通過例如用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，由抗體生成細(xì)胞的RNA合成可變區(qū)，來制備這類基因。參見La訂ick等，1991,Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology2:106;Ritter等(編著)，1995,MONOCLONALANTIBOD正S:PRODUCTION,ENGINEERINGANDCLINICALAPPLICATION,第166-179頁(CambridgeUniversityPress);Birch等(編著)，1995,MONOCLONALANTIBODIES:PRINCIPLESANDAPPLICATIONS,第137-185頁(Wiley-Liss,Inc.)。嵌合抗體和人源化抗體嵌合抗體是其中人抗體可變區(qū)被例如抗P1GF小鼠抗體可變區(qū)，包括小鼠抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)置換的重組蛋白。當(dāng)給予受試者時，嵌合抗體表現(xiàn)出免疫原性降低，穩(wěn)定性增加。嵌合抗體的構(gòu)建方法是本領(lǐng)域眾所周知的(例如Leung等，1994,Hybridoma13:469)?？梢允骨逗蠁慰寺】贵w人源化，即通過將來自小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)的小鼠CDR轉(zhuǎn)移到人抗體相應(yīng)可變區(qū)。嵌合單克隆抗體中的小鼠構(gòu)架區(qū)(FR)也用人FR序列置換。為了保持人源化單克隆的穩(wěn)定性和抗原特異性，一種或多種人FR殘基可以用小鼠相應(yīng)殘基置換。人源化單克隆抗體可用于患者的治療性治療。通過選擇性修飾CDR序列也可提高人源化抗體對耙標(biāo)的親和性(W00029584A1)。產(chǎn)生人源化單克隆抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。(參見例如Jones等,1986,Nature,321:522;Riechmann等，Nature,1988,332:323;Verhoeyen等，1988,Science,239:1534;Carter等,1992,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,89:4285;Sandhu,Crit.Rev.Biotech.,1992,12:437;Tempest等，1991,Biotechnology9:266;Singer等，J.I薩un.,1993,150:2844)。其它實施方案可涉及非人類靈長類抗體。在狒狒中產(chǎn)生治療用抗體的通用技術(shù)可參見例如Goldenberg等，WO91/11465(1991)和Losman等，Int.J.Cancer46:310(1990)。在另一個實施方案中，抗體可以是人單克隆抗體。這類抗體得自已經(jīng)過改造、在響應(yīng)抗原性攻擊時產(chǎn)生特定人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。在該項技術(shù)中，將人重鏈和輕鏈基因座元件導(dǎo)入源自胚胎干細(xì)胞系的小鼠品系中，該類胚胎干細(xì)胞系含有定向破壞的內(nèi)源重鏈和輕鏈基因座。轉(zhuǎn)基因小鼠可合成對人抗原具有特異性的人抗體，而且小鼠可用于產(chǎn)生分泌人抗體的雜交瘤。從轉(zhuǎn)基因小鼠獲得人抗體的方法參見Green等，NatureGenet.7:13(1994),Lonberg等，Nature368:856(1994)和Taylor等，Int.Immun.6:579(1994)。人抗體用組合方法或經(jīng)人免疫球蛋白基因座轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因動物來產(chǎn)生完整人抗體的方法是本領(lǐng)域已知的(例如Mancini等，2004,WewA/,'cra6/0/.27:315-28;Conrad和Scheller,2005,ComZ).C&m.招g(shù)/jr/2rawg/戸fScree".8:117-26;Brekke禾口Loset,2003,Cwn*.尸/wmaco/.3:544-50;所述各文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)。與嵌合抗體或人源化抗體相比，這樣的完整人抗體有望表現(xiàn)出更少的副作用，并且基本象內(nèi)源性人抗體一樣在體內(nèi)起作用。在某些實施方案中，要求保護(hù)的方法和過程可使用通過這類技術(shù)而產(chǎn)生的人抗體。在一個替代方案中，如上所述的噬菌體展示技術(shù)可用于產(chǎn)生人抗體(例如Dantas-Barbosa等，2005，Ge"ef.A/o/.ie義4:126-40,所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)。人抗體可以由正常人或表現(xiàn)出特定疾病狀態(tài)(例如癌癥)的病人產(chǎn)生(Dantas-Barbosa等，2005)。由患病個體來構(gòu)建人抗體的優(yōu)點是循環(huán)抗體庫(circulatingantibodyrepertoire)可偏向4十只于疾病相關(guān)抗原的抗體。在該方法的一個非限制性實例中，Dantas-Barbosa等(2005)構(gòu)建了來自骨肉瘤患者的人Fab抗體片段的噬菌體展示文庫。一般來說，總RNA得自循環(huán)血淋巴細(xì)胞(出處同上)。從ja、Y和K鏈抗體庫克隆重組Fab庫，并將其插入噬菌體展示文庫(出處同上)。采用針對重鏈和輕鏈免疫球蛋白序列的特定引物，將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA并用于制備FabcDNA文庫(Marks等，1991，/Mo/.說o/.222:581-97,所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)。按照以下文獻(xiàn)所述方法構(gòu)建文庫Andris-Widhopf等(2000,載于P/2ageD/'5/7/a;;丄Worato^yA/am^r/,Barbas等(主編)，第l版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY第9.1-9.22頁，所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)。最終Fab片段用限制性內(nèi)切核酸酶消化，插入到噬菌體基因組中，制備噬菌體展示文庫。這樣的文庫可以用如上所述的標(biāo)準(zhǔn)噬菌體展示方法來篩選。技術(shù)人員應(yīng)了解該技術(shù)僅僅是示例性的，可以使用任何通過噬菌體展示來制備和篩選人抗體或抗體片段的已知方法。在另一替代方案中，使用如上所述的標(biāo)準(zhǔn)免疫方案，經(jīng)基因工程改造以產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物可用于產(chǎn)生針對幾乎任何免疫原性靶標(biāo)的抗體。這類系統(tǒng)的非限制性實例是來自Abgenix(Fremont,CA)的XenoMouse⑧(例如Green等，1999,丄/mw訓(xùn)o/.A/"/od231:11-23,所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)。在XenoMouse⑧和類似動物中，小鼠抗體基因已經(jīng)被鈍化并被功能性人抗體基因取代，而小鼠免疫系統(tǒng)的其余部分仍保持完整。用種系配置的YAC(酵母人工染色體)轉(zhuǎn)化XenoMouse⑧，所述YAC含有部分人IgH和IgK基因座，包含大部分可變區(qū)序列、輔助基因和調(diào)節(jié)序列。人可變區(qū)庫可用于產(chǎn)生能產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞，所述細(xì)胞可用已知^支術(shù)加工成雜交瘤。用靶抗原免疫的XenoMouse⑧將通過正常免疫應(yīng)答產(chǎn)生人抗體，可以收獲這類抗體和/或通過如上所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來制備。XenoMouse⑧的各種品系都是可得的，它們每個都能產(chǎn)生不同類別的抗體。這類人抗體可以通過化學(xué)交聯(lián)或其它已知方法與例如P1GF配體偶聯(lián)。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的人抗體已經(jīng)顯示出具有治療潛力，同時又保留正常人抗體的藥代動力學(xué)特性(Green等，1999)。技術(shù)人員應(yīng)了解的是，要求保護(hù)的組合物和方法不限于使用XenoMouse系統(tǒng)，也可使用經(jīng)基因工程改造產(chǎn)生人抗體的任何轉(zhuǎn)基因動物。雙特異性抗體和綴合物在某些實施方案中，本文所公開的P1GF配體可與另一個連接配體的分子聯(lián)合使用。連接可以是共價或非共價的。在一些實施方案中，P1GF配體可與雙特異性抗體連接，雙特異性抗體即具有兩個不同結(jié)合部位的抗體，一個用于P1GF配體，另一個用于疾病相關(guān)靶抗原?？梢园邢蛉魏闻c血管生成、癌癥、轉(zhuǎn)移或細(xì)月包移動相關(guān)的疾病或病癥，包括但不限于原發(fā)性癌、轉(zhuǎn)移癌、增生、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、節(jié)段性回腸炎、潰病性結(jié)腸炎、結(jié)節(jié)病、哞喘、水腫、肺動脈高壓、腫瘤的形成與發(fā)展組織、牛皮癬、糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑變性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、心肌血管生成、斑塊新血管形成、再狹窄、血管創(chuàng)傷后新內(nèi)膜形成、毛細(xì)管擴(kuò)張、血友病性關(guān)節(jié)、血管纖維瘤、慢性炎癥相關(guān)的纖維化、肺纖維化、深部靜脈血栓形成和傷口肉芽形成。雙特異性抗體和多特異性抗體的構(gòu)建和使用方法公開于例如2004年2月11日申請的美國專利申請7>布號20050002945，該申請的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。既然雙特異性抗體部分把向腫瘤相關(guān)抗原，因此預(yù)期可如此耙向任何類型的肺瘤和任何類型的肺瘤抗原。可^^皮耙定胂瘤的示例性的類型包括急性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞性白血病、膽管癌、乳腺癌、宮頸癌、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食管癌、胃癌、頭頸部癌、霍金奇淋巴瘤(Hodgkin'slymphoma)、肺癌、甲狀腺髓質(zhì)癌(medullarythyroid)、非霍金奇淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌和膀胱可以被靶定的胂瘤相關(guān)抗原包括但不限于A3、A33抗體特異性抗原、BrE3-抗原、CD1、CDla、CD3、CD5、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、HLA國DR、NCA95、NCA90、HCG及其亞基、CEA(CEACAM-5)、CEACAM-6、CSAp、EGFR、EGP-1、EGP曙2、Ep-CAM、Ba733、HER2/neu、低氧誘導(dǎo)因子(HIF)、KC4-抗原、KS-l-抗原、KSl-4、Le-Y、巨噬細(xì)胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、PAM曙4-抗原、PSA、PSMA、RS5、SIOO、TAG-72、p53、生腱蛋白、IL-6、IL-8、胰島素生長因子-1(IGF-1)、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、VEGF、17-lA-抗原、血管生成標(biāo)記(例如ED-B纖連蛋白)、癌基因標(biāo)記、癌基因產(chǎn)物和其它腫瘤相關(guān)抗原。目前對腫瘤相關(guān)抗原的報道包括Mizukami等(2005,AtowreAfW.11:992-97);Hatfield等(2005,Cw廳.Ca"cwZ>wg7^ge"5:229-48);Vallbohmer等(2005，丄C//".0"co/.23:3536-44)和Ren等(2005,v4朋.Swrg.242:55-63),所述各文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中?？梢允褂酶鞣N重組方法產(chǎn)生雙特異性抗體和抗體片段。例如，雙特異性抗體和抗體片段可在轉(zhuǎn)基因家畜乳汁中產(chǎn)生(參見例如Colman,A.,Biochem.Soc.Symp.,63:141-147,1998;美國專利第5,827,690號，所述各文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)。制備兩個DNA構(gòu)建體，分別含有編碼成對免疫球蛋白重鏈和輕鏈的DNA節(jié)段。將該片段克隆到表達(dá)載體中，該表達(dá)載體含有在乳腺上皮細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)的啟動子序列。實例包括但不限于得自兔、牛和綿羊酪蛋白基因、牛a-乳球蛋白基因、綿羊P-乳球蛋白基因和小鼠乳清酸性蛋白基因的啟動子。優(yōu)選插入片段在其3'側(cè)與得自乳腺特異性基因的同源基因組序列連接。這就提供了聚腺苷酸化位點和轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定序列。將表達(dá)盒共注射入哺乳動物受精卵的前核，然后將卵植入雌性接受者子宮，使之孕育。出生后，通過DNA分析，篩選出存在兩個轉(zhuǎn)基因的子代。為了抗體存在的目的，重鏈和輕鏈兩個基因必須在同一細(xì)胞中同時表達(dá)。用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)免疫方法，分析得自轉(zhuǎn)基因雌性動物乳汁的抗體或抗體片段的存在和功能。用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法從乳汁中純化出抗體。預(yù)尋把(Pre-Targeting)使用雙特異性抗體的一個策略包括預(yù)尋草巴方法，其中在給予患者雙特異性抗體后，給予患者效應(yīng)分子，例如抗血管生成或抗肺瘤P1GF配體。包括一個P1GF配體結(jié)合部位和一個患病組織結(jié)合部位的雙特異性抗體，定位到患病組織上，并且增加效用分子P1GF配體定位到患病組織上的特異性(美國專利申請?zhí)?0050002945)。因為效應(yīng)分子可以比雙特異性抗體更快地從循環(huán)中清除，所以使用該預(yù)尋靶方法與如果效應(yīng)分子與疾病尋靶抗體直接連接相比，則正常組織暴露在效應(yīng)分子的情況減少。已經(jīng)開發(fā)出增加檢測劑或治療藥物的靶:本底比率的預(yù)尋耙方法。預(yù)尋耙和生物素/抗生物素蛋白方法的實例參見例如Goodwin等，美國專利第4,863,713號；Goodwin等,J.Nucl.Med.29:226，1988;Hnatowich等，J.Nucl.Med.28:1294，1987;Oehr等,J.Nucl.Med.29:728，1988;Klibanov等，J.Nucl.Med.29:1951，1988;Sinitsyn等，丄Nucl.Med.30:66,1989;Kalofonos等，J.Nucl.Med.31:1791，1990;Schechter等，Int.J.Cancer48:167,1991;Paganelli等，CancerRes.51:5960，1991;Paganelli等，Nud.Med.Commim.12:211，1991;美國專利第5,256,395號；Stickney等，CancerRes.51:6650，1991;Yuan等，CancerRes.51:3119,1991;美國專利第6,077,499號；美國順序號09/597,580;美國順序號10/361,026;美國順序號09/337,756;美國順序號09/823,746;美國順序號10/116,116;美國順序號09/382,186;美國順序號10/150,654;美國專利第6,090,381號；美國專利第6,472,511號；美國順序號10/114,315;美國臨時申請?zhí)?0/386,411;美國臨時申請?zhí)?0/345,641;美國臨時申請?zhí)?0/3328,835;美國臨時申請?zhí)?0/426,379;美國順序號09/823，746;美國順序號09/337,756;和美國臨時申請?zhí)?0/342，103，所有這些文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。在某些實施方案中，雙特異性抗體和可尋耙構(gòu)建體可用于治療正?；蚧疾〉慕M織和器官和/或使之成像，例如使用方法參見美國專利號6,126,916、6,077,499、6,010,680、5,776,095、5,776,094、5,776,093、5,772,981、5,753,206、5,746,996、5,697,902、5,328,679、5,128,119、5,101,827和4,735,210,所述各專利通過引用結(jié)合到本文中。其它方法參見1999年6月22日申請的美國申請順序號09/337,756和2001年4月3日申請的美國申請順序號09/823,746。尋把肽在其它實施方案中，肽P1GF配體例如BP-1、BP-2、BP-3或BP-4可以用作尋靶肽以將一種或多種藥劑遞送給患病組織。在這種情況下，藥物可以與P1GF結(jié)合肽共價或非共價連接。可能使用的藥劑包括藥物、前藥、毒素、酶、寡核苷酸、放射性同位素、免疫調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞因子、激素、結(jié)合分子、脂質(zhì)、多聚物、膠束、脂質(zhì)體、納米粒子或其組合。示例性的治療藥物和使用方法參見美國專利公布號20050002945、20040018557、20030148409和20050014207，所述各專利通過引用結(jié)合到本文中。在示例性實施方案中，有用的藥物可包含一種或多種以下藥物aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、氮雜胞苷、博來霉素、硼替佐米、苔蘚抑素-1、白消安、加利車霉素(calicheamycin)、喜樹堿、10-羥基喜樹堿、卡莫司汀、西樂葆、苯丁酸氮芥、順鉑、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡鉑、克拉曲濱、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達(dá)卡巴溱、多西他賽、放線菌素D、葡糖苷酸道諾霉素、柔紅霉素、地塞米松、己烯雌酚、多柔比星、2-二氫吡咯多柔比星(2P-DOX)、氰基嗎啉代多柔比星、葡糖苷酸多柔比星、葡糖苷酸表柔比星、炔雌醇、雌莫司汀、依托泊苷、葡糖苦酸依托泊苷、磷酸依托泊芬、氟尿香(FUdR)、3',5'-0-二油酰基-FudR(FUdR-do)、氟達(dá)拉濱、氟他胺、氟尿嘧啶、氟曱睪酮、吉西他濱、己酸羥孕酮、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、L-天冬酰胺酶、亞葉酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲羥孕酮、醋酸曱地孕酮、美法侖、巰基噪呤、6-巰基噪呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、普卡霉素、絲裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、潑尼松、丙卡巴肼、紫杉醇、噴司他丁、PSI-341、司莫司汀、鏈佐星、他莫昔芬、紫杉烷類、泰素、丙酸睪酮、沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、烏拉莫司汀、velcade、長春堿、長春瑞濱、長春新堿、蓖麻毒蛋白、相思毒蛋白、核糖核酸酶、onconase、rapLRl、脫氧核糖核酸酶I、葡萄^求菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、gelonin、白喉毒素、假單胞菌外毒素、假單胞菌內(nèi)毒素、反義寡核苦酸、干擾RNA或其組合。適體在某些實施方案中，有用的P1GF配體可以適體。構(gòu)建和測定適體結(jié)合特性的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，這類技術(shù)參見美國專利第5,582,981、5,595,877和5,637,459號，所述各專利通過引用結(jié)合到本文中?？捎冒ê铣?、重組和純化方法在內(nèi)的任何已知方法制備般而言，最少需要約3個核苷酸、優(yōu)選至少5個核苷酸以達(dá)到特異性結(jié)合。可以使用序列短于10個石成基的適體，優(yōu)選IO、20、30或40個核苷酸的適體。適體需含有賦予結(jié)合特異性的序列，但也可以用側(cè)翼區(qū)來延伸，或者可以用其它方式衍生。在優(yōu)選的實施方案中，適體的P1GF結(jié)合序列可以鄰接引物結(jié)合序列，以便用PCR或其它擴(kuò)增技術(shù)促進(jìn)適體擴(kuò)增。在另一個實施方案中，側(cè)翼序列可包含這樣的特定序列該序列優(yōu)先識別或結(jié)合一個部分，使適體更牢固地固定在基體上。適體可以作為常規(guī)DNA或RNA分子進(jìn)行分離、測序和/或擴(kuò)增或合成?；蛘?，目標(biāo)適體可包含經(jīng)修飾的寡聚體。適體中通常存在的任何羥基都可被膦酸酯基、磷酸酯基取代，被標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基保護(hù)起來，或者被活化以便與其它核苷酸額外連接、或者可以與固體支持物綴合。一種或多種磷酸二酯鍵可以被其它連接基團(tuán)置換，例如P(O)O尋皮以下基團(tuán)置4奐P(O)S、P(0)NR2、P(O)R、P(O)OR'、CO或CNR2，其中R^JH或烷基(1-20C)，而R'是烷基(1-20C);另外，該基團(tuán)可通過O或S與相鄰核苷酸連接。寡聚體中并非所有連接都要相同。在本發(fā)明測定特異性結(jié)合序列方法中用作原料的適體可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA。在一個優(yōu)選的實施方案中，序列是單鏈DNA，對核酸酶降解比RNA較不敏感。在優(yōu)選的實施方案中，起始適體含有隨機(jī)序列部分，一^:包括約10-400個核苷酸，更優(yōu)選20-100個核苷酸。隨機(jī)序列鄰接引物序列，該引物序列使得與輩巴結(jié)合適體擴(kuò)增。為了合成隨機(jī)區(qū)，在合成中，可在需要隨機(jī)化的位置加入核普酸混合物。能結(jié)合特定目標(biāo)靶的適體的制備和篩選方法是眾所周知的，例如美國專利第5,475,096號和美國專利第5,270,163號，各專利通過引用結(jié)合到本文中。該技術(shù)通常包括從候選適體混合物中進(jìn)行選擇并逐步重復(fù)結(jié)合，將結(jié)合的適體與未結(jié)合適體分離開來并擴(kuò)增。因為在混合物中，對應(yīng)于最高親和力適體來說只有少量序列(可能僅有一分子適體)存在，通常需要設(shè)定劃分標(biāo)準(zhǔn)，使得在分離期間，混合物中大量的適體(約5-50%)保留下來。每輪都濃縮了對靶標(biāo)具有高親和性的適體?？芍貜?fù)3-6輪選擇和擴(kuò)增循環(huán)，以產(chǎn)生能以高親和力和高特異性結(jié)合靶標(biāo)(例如P1GF)的適體。疾病組織檢測、診斷和成〗象的方法基于蛋白質(zhì)的體外診斷本發(fā)明提供使用包括P1GF結(jié)合肽、P1GF融合蛋白、P1GF抗體或片段、雙特異性抗體和抗體片段在內(nèi)的P1GF配體，體外和/或體內(nèi)篩選生物樣品P1GF抗原的存在。在示例性免疫測定中，P1GF抗體、融合蛋白或其片段可用于如下所述的液相中或結(jié)合到固相載體上。在優(yōu)選的實施方案中，特別是包括體內(nèi)給其片段是人源化的。另優(yōu)選P1GF抗體或其片段是完全人P1GF抗體。還優(yōu)選P1GF融合蛋白包含人源化P1GF抗體或完全人P1GF抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，已知多種技術(shù)用于測定特定基因的表達(dá)水平，可以采用任何這類已知方法，例如免疫測定、RT-PCR、mRNA純化和/或cDNA制備，然后通過與基因表達(dá)測定芯片雜交，可以用來測定個體患者和/或組織中P1GF的表達(dá)水平。用于確定生物樣品中是否含有P1GF抗原的篩選方法的一個實例是放射免疫測定(RIA)。例如在RIA的一種類型中，在放射性標(biāo)記的P1GF抗原存在下，將待測物質(zhì)與PlGFMab混合。在這一方法中，測試物質(zhì)的濃度與結(jié)合到MAb的標(biāo)記PlGF抗原的量成反比，并且與游離的標(biāo)記P1GF抗原的量正相關(guān)。其它合適的篩選方法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是極其顯而易見的?；蛘撸梢赃M(jìn)行體外測定，其中P1GF配體、抗P1GF抗體、融合蛋白或其片段與固相載體結(jié)合。例如，為了將MAb與不溶性支持體(例如多聚物包被的小珠、板或管)連接，可將MAb與多聚物(例如氨基葡聚糖(aminodextran))連接。可用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定生物樣品中P1GF抗原的存在。在直接竟?fàn)嶦LISA中，將純或半純的抗原制劑與不溶于流體或待測細(xì)胞提取物的固相支持體結(jié)合，加入一定量可檢測標(biāo)記過的可溶性抗體、抗體片段或P1GF配體，以檢測和/或定量測定固相抗原與標(biāo)記P1GF結(jié)合分子之間所形成的二元絡(luò)合物。夾心ELISA需要少量的抗原，該測定法不需要抗原充分純化。因此，對于檢測臨床樣品抗原的直接竟?fàn)嶦LISA,優(yōu)選用夾心ELISA。參見例如Field等，4:1463(1989);Spandidos等，^""Ootc^^m.9:821(1989)。在夾心ELISA中，一些未標(biāo)記的MAb或抗體片段("捕獲抗體")與固相支持體結(jié)合，使得試驗樣品與捕獲抗體接觸，加入一些可檢測標(biāo)記過的可溶性抗體(或抗體片段)，以檢測和/或定量測定捕獲抗體、抗原與標(biāo)記抗體間所形成的三元絡(luò)合物。抗體片段是抗體的組成部分，例如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab等。在本文中，抗體片段是與P1GF抗原表位結(jié)合的P1GFMAb的組成部分。術(shù)語"抗體片段"還包括任何合成或基因改造的、像抗體一樣通過與特異性抗原結(jié)合形成復(fù)合物而起作用的蛋白質(zhì)。例如，抗體片段包括由輕鏈可變區(qū)組成的分離片段、由重鏈和輕鏈可變區(qū)組成的"Fv"片段和其中輕鏈和重鏈可變區(qū)通過狀接頭連接的重組單鏈多肽分子?？贵w融合蛋白是經(jīng)重組產(chǎn)生的抗原結(jié)合分子，其中兩個以上相同或不同的特異性的相同或不同的單鏈抗體或抗體片段節(jié)段連接。融合蛋白可包含單個抗體組分、不同抗體組分的多價或多特異性組合或相同抗體組分的多個拷貝。融合蛋白還可包含與診斷/檢測和/或治療藥劑綴合的抗體或抗體片段。術(shù)語P1GF抗體包括人源化抗體、人抗體、鼠抗體、其抗體片段、免疫綴合物及其片段和抗體融合蛋白及其片段。實施夾心ELISA的方法是眾所周知的。參見例如Field等，出處同上；Spandidos等，出處同上；Moore等，"Twin-SiteELISAsforfosandmycOncoproteinsUsingtheAMPAKSystem"，載于METHODSINMOLECULARBIOLOGY,第10巻，第273-281頁(TheHumanaPress,Inc.1992)。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，可以通過用PIGF配體替換第一未標(biāo)記抗體或第二標(biāo)記抗體來進(jìn)行類似于夾心ELISA的測定。在夾心ELISA中，可溶性抗體或抗體片段必需與PIGF表位結(jié)合，該表位與由捕獲抗體識別的表位不同。可以進(jìn)行夾心ELISA以確定P1GF抗原是否存在于活檢樣品中?；蛘?，進(jìn)行該測定以定量測定存在于體液臨床樣品中P1GF抗原的含量?？梢酝ㄟ^包括稀釋純化PIGF抗原在內(nèi)的方法進(jìn)行定量測定。在其它實施方案中，可以采用蛋白質(zhì)印跡分析檢測和定量測定樣品中存在的P1GF。該技術(shù)一般包含通過以分子量為基礎(chǔ)的凝膠電泳，分離樣品蛋白質(zhì)，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到合適的固相支持體(例如硝化纖維素膜、尼龍膜或衍生化尼龍膜)，使樣品與特異性結(jié)合PIGF的抗體或配體溫育。在固相支持體上抗P1GF抗體或配體與P1GF特異性結(jié)合。這些抗體或配體可以是直接標(biāo)記的，或者可以隨后用特異性結(jié)合到抗P1GF抗體或配體的經(jīng)標(biāo)記的第二抗體檢測。P1GF配體、Mab、融合蛋白及其片段也適于制備藥盒。這種藥盒可包括裝栽物，該裝載物被分隔成裝栽一種或多種包裝容器(例如小瓶、管等)的密實空間，各所述包裝容器裝有免疫測定的單獨成分。例如，可能在一種包裝容器中裝有固定在固相支持體上的捕獲抗體，另外的包裝容器則裝有可檢測標(biāo)記的抗體溶液。此外包裝容器可裝有包含P1GF抗原連續(xù)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)溶液。P1GF抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液可用來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以P1GF抗原濃度為橫坐標(biāo)，以檢測信號為縱座標(biāo)繪制曲線而得。得自含P1GF抗原樣品的結(jié)果可插入該曲線圖中，求出生物樣品中P1GF抗原的濃度。還可以用P1GF配體、抗P1GF抗體、融合蛋白及其片l殳才企測由組織樣本制備的組織切片中存在的P1GF抗原?？梢圆捎眠@種原位檢測法測定存在的P1GF抗原，并測定P1GF抗原在被檢測組織中的分布。可以將可檢測標(biāo)記的P1GF配體或抗體涂在冷凍或石蠟包埋的組織切片上完成原位檢測。原位檢測的常規(guī)技術(shù)為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所IA^口。參見侈1^口Ponder，"CellMarkingTechniquesandTheirApplication"，載于MAMMALIANDEVELOPMENT:APRACTICALAPPROACH113-38,Monk(編著)(IRLPress1987)和Coligan,第5.8.1-5.8.8頁。P1GF配體、抗P1GF抗體、融合蛋白及其片段可以用任何合適的標(biāo)記部分進(jìn)行可檢測性標(biāo)記，標(biāo)記部分例如》文射性同位素、酶、熒光標(biāo)記、染料、色原體(chromagen)、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記或順磁標(biāo)記。這些可檢測標(biāo)記P1GF抗體的制備和檢測方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知，下面將詳細(xì)介紹。標(biāo)記部分可以是通過使用Y計數(shù)器或(3閃爍計數(shù)器或者通過放射自顯影這類方法檢測的放射性同位素。在一個優(yōu)選的實施方案中，診斷性綴合物是Y輻射同位素、(5輻射同位素或正電子輻射同位素。標(biāo)記部分是指在預(yù)定條件下會產(chǎn)生信號的分子。標(biāo)記部分的實例包括;故射性同位素、酶、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記和順f茲標(biāo)記。標(biāo)記部分與P1GF抗體的結(jié)合用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)完成。關(guān)于這方面的典型方法參見Kennedy等，Clin.Chim.Acta70:1(1976),Schurs等，Clin.Chim.Acta81:1(1977),Shih等，Int'lJ.Cancer46:1101(1990)?；诤怂岬捏w外診斷在具體實施方案中，可對核酸進(jìn)行分析以確定P1GF的表達(dá)水平，特別是用核酸擴(kuò)增方法。可以按照標(biāo)準(zhǔn)方法，從生物樣品所含細(xì)胞中分離出作為才莫板用于擴(kuò)增的核酸序列(mRNA和/或cDNA)。該核酸可以是分級分離RNA或是完整細(xì)胞RNA。如果使用RNA，則可能需要將RNA轉(zhuǎn)化成互補(bǔ)的cDNA。在一個實施方案中，RNA是全細(xì)胞RNA,直接用作模板用于擴(kuò)增。在一個實例中，用本領(lǐng)域已知的任何方法，通過擴(kuò)增(例如用PCR)P1GFmRNA或cDNA序列，檢測和/或定量測定擴(kuò)增產(chǎn)物，來進(jìn)行P1GF表達(dá)的測定，所述方法包括但不限于TaqMan測定法(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)、瓊脂糖或聚丙酰胺凝月交電泳和溴化乙錠染色、與包含P1GF特異性探針的微陣列雜交、RNA印跡法、點漬法、狹線印跡等。各種形式的擴(kuò)增法是本領(lǐng)域眾所周知的，任何這類已知方法都可以使用。一般來說，擴(kuò)增包括使用與待擴(kuò)增的靶核酸序列選擇性或特異性雜交的一種或多種引物。皿本文定義的術(shù)語引物是指包括能夠以模板依賴方法引起新生核酸合成的任何核酸。通常，引物是長度為10-20個石tt對的寡核普酸，但是也可采用更長的序列?？梢噪p鏈或單鏈形式提供引物，雖然優(yōu)選單鏈形式。根據(jù)獲自標(biāo)準(zhǔn)Watson-Crick堿基配對(即腺噪呤與胸腺嘧啶或尿嘧啶結(jié)合，烏噪呤與胞嘧啶結(jié)合)的互補(bǔ)序列設(shè)計，設(shè)計引物的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。用于篩選和設(shè)計擴(kuò)增引物的計算機(jī)程序可從技術(shù)人員熟知的商業(yè)和/或公共來源獲得。已知用于檢測P1GF表達(dá)的具體引物序歹'K例如Regnault等，2003，J.550:641-56)。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，本文所公開的特異性序列僅是示例性，在實施要求保護(hù)的方法時，可以使用其它的引物和/或探針序列?？傻玫皆S多模板依賴方法以擴(kuò)增給定樣品中存在的標(biāo)記序列。最著名的擴(kuò)增方法之一是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(稱為PCR),美國專利第4,683，195、4，683,202和4,800,159號中有詳細(xì)介紹。本發(fā)明的一個實施方案可包括從個體獲得合適的樣品并檢測P1GF信使RNA。一旦獲得組織樣品，則樣品可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如細(xì)胞分離、外膜消化、mRNA的寡脫氧胸苷酸分離等)制備分離的核酸。還可用本領(lǐng)域已知試劑盒(Pierce，APBiotech等)進(jìn)行mRNA分離。為了定量測定mRNA的擴(kuò)增量，可進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄酶PCR擴(kuò)增方法。RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA的方法是眾所周知的，參見Sambrook等，1989。其它反轉(zhuǎn)錄方法利用熱穩(wěn)定DNA聚合酶?？梢詰?yīng)用上述體外和原位;險測方法，輔助_珍斷病理病癥或?qū)Σ±聿“Y進(jìn)行疾病分期。例如，這些方法可用來檢測表達(dá)P1GF抗原的肺瘤，例如轉(zhuǎn)移癌。體內(nèi)診斷PlGF配體和/或抗體可用于體內(nèi)診斷。用標(biāo)記肽或Mab的診斷成像方法是眾所周知的。例如，免疫閃爍照相(immunoscintigraphy)技術(shù)，P1GF配體或抗體用Y輻射^:射性同位素標(biāo)記并導(dǎo)入患者體內(nèi)。用Y照相機(jī)檢測Y輻射放射性同位素的位置和分布。參見例如Srivastava(編著)，RADIOLABELEDMONOCLONALANTIBODIESFORIMAGINGANDTHERAPY(PlenumPress1988),Chase,"MedicalApplicationsofRadioisotopes，，，載于REMINGTON'S45PHARMACEUTICALSCIENCES,第18版，Gennaro等(編著)，第624-652頁(MackPublishingCo.,1990)和Brown，"ClinicalUseofMonoclonalAntibodies"，載于BIOTECHNOLOGYANDPHARMACY227-49,Pezzuto等(編著)(Chapman&Hall1993)。另外優(yōu)選使用正電子輻射放射性核素(PET同位素)，例如具有511keV的能量，例如氟-18(18F)、鎵-68(^Ga)和碘-124(124I)。這類成像可用以下方式進(jìn)行通過直接標(biāo)記P1GF配體，或者用預(yù)尋耙成像方法(pretargetedimagingmethod),參見Goldenberg等,"AntibodyPretargetingAdvancesCancerRadioimmunodetectionandRadiotherapy,"(提交手牙高)，另參見美國專利/>布號20050002945、20040018557、20030148409和20050014207,所述各文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。對于診斷成像，可以用中間官能團(tuán)，使放射性同位素直接或間接與P1GF配體或抗體結(jié)合。有用的中間官能團(tuán)包括螯合劑例如乙二胺四乙酸和二乙烯三胺五乙酸。例如參見Shih等(出處同上和)美國專利號第5,057，313號。遞送給患者的放射劑量，通過選擇以下方面最佳組合的同位素，盡可能維持在低水平最小半衰期，最小體內(nèi)滯留和允許檢出和準(zhǔn)確測量的最低用量的同位素。與P1GF抗體結(jié)合并適于診斷成像的放射性同位素的實例包括"m丁c和111111。為了進(jìn)行體內(nèi)診斷，P1GF閨己體、抗體、融合蛋白及其片段還可以用順磁離子和多種放射造影劑標(biāo)記。特別用于磁共振成像的造影劑包含軋、錳、鏑、鑭或鐵離子。其它造影劑包含鉻、銅、鈷、鎳、錸、銪、鋱、鈥或釹。P1GF配體、抗體及其片段還可與超聲造影/增強(qiáng)劑綴合。例如，一種超聲造影劑是包含人源化PlGFIgG或其片段的脂質(zhì)體。另優(yōu)選超聲造影劑為充氣脂質(zhì)體。在一個優(yōu)選的實施方案中，雙特異性抗體可與造影劑綴合。例如，雙特異性抗體可包含用于超聲成像的一種以上的圖像增強(qiáng)劑。在一個優(yōu)選的實施方案中，造影劑為脂質(zhì)體。優(yōu)選脂質(zhì)體包含脂質(zhì)體外表面共價連接的二價DTPA-肽。另更優(yōu)選脂質(zhì)體是充氣的。顯像劑和放射性同位素在某些實施方案中，要求保護(hù)的肽或蛋白質(zhì)可與用于各種患病器官、組織或細(xì)胞類型成像和診斷的顯像劑連接。許多合適的顯像劑為本領(lǐng)域所知，與蛋白質(zhì)或肽連接的方法一樣為本領(lǐng)域所知(參見例如美國專利5,021,236和4,472,509，所述兩項專利通過引用結(jié)合到本文中)。某些連接方法包括使用金屬螯合物，采用例如有機(jī)螯合劑(如DTPA)與蛋白質(zhì)或肽連接(美國專利4,472,509)。蛋白質(zhì)或肽還可以在偶聯(lián)劑(例如戊二醛或高碘酸鹽)存在下與酶反應(yīng)。可以在這些偶聯(lián)劑存在下，或者通過與異硫氰酸鹽反應(yīng)，來制備帶有熒光素標(biāo)記的綴合物?？赡苡米髟煊皠┑捻槾烹x子的非限制性實例包括鉻(III)、錳(n)、鐵(m)、鐵(n)、鈷(n)、鎳(n)、銅(n)、釹(m)、釤(ni)、鐿(ni)、釓(in)、釩(n)、鋱(m)、鏑(in)、鈥(m)和鉺(m)，特別優(yōu)選為釓。用于其它方面的離子(例如x光成像)，包括但不限于鑭(ni)、金(ni)、鉛(n)，尤其為鉍(ni)?？赡苡米黠@像劑或治療藥物的放射性同位素包括攻211、14碳、51鉻、36氯、57鈷、58鈷、銅62、銅64、銅67、152Eu、氟18、鎵67、鎵68、3氬、碘123、碘124、碘125、碘"1、銦川、52鐵、59鐵、32磷、33磷、錸186、錸188、SC47、75硒、銀111、35硫、锝941\锝""1、釔86和釔90。1251常常優(yōu)選用于某些實施方案，锝^m和銦m由于它們的能量低，并適于長期檢測故常常也是優(yōu)選的?？梢园凑毡绢I(lǐng)域眾所周知的方法制備放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)或肽。例如，它們可能通過與^典化鈉或碘化鉀和化學(xué)氧化劑(例如次氯酸鈉)或者與酶促氧化劑(例如乳過氧化物酶)接觸^皮碘化。蛋白質(zhì)或肽可以通過配體交換法用锝"1示記，例如用錫溶液還原高锝酸酸鹽，使還原锝與交聯(lián)葡聚糖柱螯合，將肽施于該柱上，或者用直接標(biāo)記技術(shù)，例如將高锝酸鹽、還原劑(例如SNCl2)、緩沖溶液(例如鄰苯二甲酸鈉鉀溶液)和肽溫育。常常用來使以金屬離子形式存在的放射性同位素與肽結(jié)合的中間官能團(tuán)包括二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、DOTA、NOTA、吟啉螯合劑和乙二胺四乙酸(EDTA)。供使用的還有熒光標(biāo)記，包括羅丹明、異硫氰酸焚光素和腎造影劑。在某些實施方案中，要求保護(hù)的蛋白質(zhì)或肽與第二結(jié)合配體或與酶(酶標(biāo)記)連接，所述第二配體和酶在與顯色底物接觸時會產(chǎn)生有色產(chǎn)物。合適酶的實例包括脲酶、堿性磷酸酶、(辣根)過氧化氫酶和葡糖氧化酶。優(yōu)選的第二結(jié)合配體為生物素和抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白化合物。這類標(biāo)記的使用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，參見例如美國專利3，817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241,所述專利通過引用結(jié)合到本文中。這些熒光標(biāo)記優(yōu)選用于體外，但是也可以在體內(nèi)應(yīng)用時使用，特別是內(nèi)窺鏡法或血管內(nèi)4企測法。在替代實施方案中，P1GF配體、抗體或其它蛋白質(zhì)或肽可以用熒光標(biāo)記做標(biāo)記。光檢測標(biāo)記的非限制性實例包括Alexa350、Alexa430、AMCA、^J^吖啶、BODIPY630/650、BODIPY650/665、BODIPY-FL、BODIPY曙R6G、BODIPY國TMR、BODIPY-TRX、5-M^-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基熒光素、5-氣基-2',4',5',7'-四氯熒光素、5-#絲熒光素、5-欺基羅丹明、6-羧基羅丹明、6-夢媒四甲基氨基、CascadeBlue、Cy2、Cy3、Cy5,6-FAM、丹石黃酰氯、熒光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧雜-l,3-二唑)、OregonGreen488、OregonGreen500、OregonGreen514、PacificBlue、酞酸、對苯二甲酸、異酞酸、曱酚紫(cresylfastviolet)、甲酚藍(lán)紫(cresylblueviolet)、亮甲酚藍(lán)、對氨基苯曱酸、藻紅、酞菁、偶氮甲堿、花青、黃嘌呤、琥珀酰熒光素、牙希土金屬穴狀4乜合物、三-耳關(guān)吡。定二胺銪(europiumtrisbipyridinediamine)、銪穴狀化合物或螯合物、二胺、雙花青苷、LaJolla藍(lán)色染料、別藻藍(lán)蛋白(allopycocyanin)、別藻藍(lán)蛋白B(allococyaninB)、藻藍(lán)蛋白C、藻藍(lán)蛋白R、硫胺素、藻紅青素、藻紅蛋白R、REG、羅丹明綠、異石克氰酸羅丹明、羅丹明紅、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四曱基羅丹明異硫醇)、四甲基羅丹明及德克薩斯紅。這些或其它發(fā)光標(biāo)記可獲自商業(yè)來源例如MolecularProbes(Eugene,OR)。有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物包括氨基苯二酰肼、異氨基苯二酰肼、芳香族吖咬輸酯(acridiniumester)、咪唑、吖咬鏡和草酸酯，或生物發(fā)光化合物例如螢光素、螢光素酶和水母發(fā)光蛋白?？稍诶缡中g(shù)中、內(nèi)窺鏡檢查或血管內(nèi)腫瘤或疾病診斷中使用診斷性免疫綴合物。在各種實施方案中，有用的標(biāo)記可包含金屬納米粒子。已經(jīng)知道納米粒子的制備方法(參見例如美國專利第6,054，495、6,127,120、6,149,868號；Lee和Meisel,J.尸/z,C力ew.86:3391-3395,1982)。納米粒子也可購自商業(yè)來源(例如NanoprobesInc.,Yaphank,NY;Polysciences,Inc.,Warrington,PA)。改性納米粒子是市售的，例如得自Nanoprobes，Inc.(Yaphank,NY)的Nanogold⑧納米粒子?？梢再徺I用于與蛋白質(zhì)或肽綴合的官能化納米粒子。交聯(lián)劑在某些實施方案中，可以使用本領(lǐng)域已知的各種交聯(lián)劑，來標(biāo)記蛋白質(zhì)或肽，所述交聯(lián)劑例如同型-雙官能交聯(lián)劑、雜雙官能交聯(lián)劑和/或光活化交聯(lián)劑。這類試劑的非限制性實例包括雙亞氨酸酯；1,5-二氟-2,4-(二硝基苯)；辛二酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯；酒石酸二琥珀酰亞胺酯；二甲基-3,3'-二硫-雙亞氨丙酸酯；N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯；4-(溴氨基乙基)-2-硝基苯疊氮；和4-疊氮基乙二醛。在一個示例性的實施方案中，碳二亞胺交聯(lián)劑，例如DCCD或EDC，可用于將酸性殘基與氨基或其它基團(tuán)交聯(lián)。這些試劑可以被改性以連4妻不同類型的標(biāo)記，例如熒光標(biāo)記。雙官能交聯(lián)劑已經(jīng)廣泛用于各種目的。攜帶兩個相同官能團(tuán)的同型雙官能試劑已經(jīng)證明能高效誘導(dǎo)相同或不同的大分子或大分子亞基間的交聯(lián)，并將多肽配體與其特異性結(jié)合位點連接。雜雙官能試劑含有兩個不同官能團(tuán)。通過利用兩個不同官能團(tuán)的不同反應(yīng)性，可以有選擇性地、按順序控制交聯(lián)。按官能團(tuán)的特異性，可將雙官能交聯(lián)劑分為例如氨基、巰基、胍基、口引咮基、羧基特異性基團(tuán)。其中，針對游離氛基的試劑尤其常用，因為它們是市售的，容易合成，應(yīng)用時反應(yīng)條件溫和。大部分雜雙官能交聯(lián)劑都含有伯氨基反應(yīng)基團(tuán)和巰基反應(yīng)基團(tuán)。在另一實例中，描迷了雜雙官能交聯(lián)劑及其使用方法(美國專利5,889,155，所述專利通過引用結(jié)合到本文中)。交聯(lián)劑將親核酰肼殘基與親電子馬來酰亞胺殘基連接起來，在一個實例中使醛與游離巰基偶聯(lián)。這些交聯(lián)劑可被改性以交聯(lián)不同官能團(tuán)。用于克隆、基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的載體在某些實施方案中，可以使用表達(dá)載體來表達(dá)肽或蛋白質(zhì)，例如融合蛋白，然后再對其進(jìn)行純化和使用。在其它實施方案中，表達(dá)載體可用于例如基因療法。表達(dá)需要的合適信號是由載體提供的，載體包括各種調(diào)節(jié)元件，例如來自病毒或哺乳動物來源的增強(qiáng)子/啟動子，它們驅(qū)動目標(biāo)基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。也已知道設(shè)計用于使信使RNA在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性和可翻譯性最優(yōu)化的元件。調(diào)節(jié)元件術(shù)語"表達(dá)構(gòu)建體"或"表達(dá)載體"是指包括含有基因產(chǎn)物編碼核酸的任何類型的遺傳構(gòu)建體，其中部分或全部核酸編碼序列能夠被轉(zhuǎn)錄。在優(yōu)選的實施方案中，編碼基因產(chǎn)物的核酸處于啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下。"啟動子"是指由細(xì)胞合成機(jī)器識別、或者被導(dǎo)入合成機(jī)器中的DNA^列，是啟動基因特異性轉(zhuǎn)錄所必需的。術(shù)語"處于轉(zhuǎn)錄控制之下"是指相對于核酸來說啟動子處于控制RNA聚合酶啟動和基因表達(dá)的正確位置和方向?！阏J(rèn)為用于控制目標(biāo)核酸序列表達(dá)的具體啟動子并不重要，只要它能指導(dǎo)核酸在靶細(xì)胞中的表達(dá)即可。因此當(dāng)靶向人體細(xì)胞時，優(yōu)選將核酸編碼區(qū)放置在啟動子附近并使之處于啟動子控制之下，使其能在人體細(xì)胞中表達(dá)。一般來說，這類啟動子可包括人或病毒啟動子。在不同實施方案中，人巨細(xì)胞病毒(CMV)即時早期基因啟動子、SV40早期啟動子、勞斯肉瘤病毒長末端重復(fù)序列、大鼠胰島素啟動子和甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子，都可用于得到目標(biāo)編碼序列的高水平表達(dá)。也包括使用本領(lǐng)域熟知的其它病毒啟動子或哺乳動物細(xì)胞啟動子或噬菌體啟動子，以達(dá)到目標(biāo)編碼序列的表達(dá)，只要表達(dá)水平足以滿足特定目的。當(dāng)使用cDNA插入序列時，通常包含聚腺苷酸化信號，以《I起基因轉(zhuǎn)錄物適當(dāng)聚腺苷酸化。一般認(rèn)為聚腺苷酸化信號的性質(zhì)并不是成功實施本發(fā)明的關(guān)鍵，可以使用任何的這類序列，例如人生長激素和SV40聚腺苷酸化信號。另外作為表達(dá)構(gòu)建體元件提供的有終止子。這些元件可起到增加信使水平并使從構(gòu)建體連讀到其它序列的作用減到最小。選擇標(biāo)記在某些實施方案中，可通過在表達(dá)構(gòu)建體中包含標(biāo)記，在體外或體內(nèi)鑒定含有核酸構(gòu)建體的細(xì)胞。這類標(biāo)記可以賦予細(xì)胞可鑒定的變化，便于鑒定含有表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)胞。通常所包含的藥物選擇標(biāo)記有助于克隆和轉(zhuǎn)化子的選擇。例如，賦予以下藥物抗性的基因是有用的選擇標(biāo)記新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、零霉素(zeocin)和組氨醇?；蛘撸梢允褂妹?，例如單純皰滲病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)。也可使用免疫學(xué)標(biāo)記。一般認(rèn)為所用的選擇標(biāo)記并不重要，只要它能與編碼基因產(chǎn)物的核酸同時表達(dá)即可。選擇標(biāo)記的其它實例是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。表達(dá)載體的遞送有數(shù)種可將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞的方式。在某些實施方案中，表達(dá)構(gòu)建體包括病毒構(gòu)建體或衍生自病毒基因組的改造構(gòu)建體。某些病毒通過受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞后，整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，并且穩(wěn)定和有效地表達(dá)病毒基因，病毒的這種能力使得它們成為將外源基因轉(zhuǎn)移到哺乳動物細(xì)胞的頗有吸引力的備選方法(Ridgeway，載于Fectowj5Wve_yo/A/o/ecw/arC7謹(jǐn)'wgFectora朋d772e/rRodriguez等編著，Stoneham:Butterworth，第467畫492頁，1988;Nicolas和Rubenstein,載于F"ectora:爿wrve少o/脂/ecw/arvectorsawe/f/zez>wses,Rodriguez和Denhardt纟扁著,Stoneham:Butterworth,第494-513頁，1988;Baichwal和Sugden,1986,載于G騰7>a"<er,KucherlapatiR編著，NewYork,PlenumPress,第117-148頁；Temin,載于Gewerra似/er，KucherlapatiR編著,NewYork,PlenumPress,笫149-188頁，1986)。優(yōu)選的基因治療載體一般為病毒載體。雖然一些可以接受外源基因材料的病毒受它們可容納核苷酸的數(shù)量和它們感染的細(xì)胞范圍的限制，但是已經(jīng)證實這些病毒成功地進(jìn)行基因表達(dá)。然而，腺病毒不會將其基因材料整合到宿主基因組內(nèi)，因此基因表達(dá)不需要宿主復(fù)制，這使它們非常理想地適用于快速、有效的異源基因表達(dá)。制備復(fù)制感染病毒的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。在使用病毒遞送系統(tǒng)時，所需要的是充分純化病毒體，使之基本不含不良污染物，例如干擾缺損病毒顆粒或內(nèi)毒素和其它致熱原，因此在接受載體構(gòu)建體的細(xì)胞、動物或個體中，不會引起任何不良反應(yīng)。優(yōu)選的載體純化方法包括使用浮力密度梯度離心，例如氯化銫梯度離心。用作基因載體的DNA病毒包括乳多空病毒(例如猿病毒40、牛乳頭瘤病毒和多瘤病毒)(Ridgeway，1988;Baichwal和Sugden,1986)和腺病毒(Ridgeway，1988;Baichwal和Sugden,1986)。體內(nèi)遞送的一個優(yōu)選方法包括使用腺病毒表達(dá)栽體。雖然已經(jīng)知道腺病毒載體整合到基因組DNA的能力低，但是這一特性被這些載體提供的基因轉(zhuǎn)移的高效率所抵償。"腺病毒表達(dá)載體"是指包括但不限于含有腺病毒序列的構(gòu)建體，該腺病毒序列足以(a)支持構(gòu)建體的包裝，和(b)表達(dá)克隆到其中的反義或有義多核普酸。復(fù)制缺陷型腺病毒載體的產(chǎn)生和繁殖依賴于輔助細(xì)胞系(稱為293)，該細(xì)胞系用Ad5DNA片段從人胚腎細(xì)胞轉(zhuǎn)化而得，組成型地表達(dá)蛋白E1(Graham等，丄G饑Wra/,36:59-72，1977)。因為腺病毒基因組中的E3區(qū)可有可無(Jones和Shenk,Ce〃，13:181-188,1978)，現(xiàn)有腺病毒載體，在293細(xì)胞幫助下，在E1區(qū)、E3區(qū)或兩區(qū)中攜帶有夕卜源DNA(Graham和Prevec，載于A/o/ecw/arWo/ogy..Gewe7"ra似/erEx/mswz'o"尸rotoco/,E丄Murmy編著，HumanaPress,Clifton,NJ,7:109-128,1991)。輔助細(xì)胞系可衍生自人細(xì)胞，例如人胚腎細(xì)胞、肌細(xì)胞、造血細(xì)胞或其它人胚胎間充質(zhì)細(xì)胞或上皮細(xì)胞?；蛘撸o助細(xì)胞可衍生自可容許人腺病毒的其它哺乳動物物種的細(xì)胞。這些細(xì)胞包括例如非洲綠猴腎細(xì)胞或其它猴胚胎間充質(zhì)細(xì)胞或上皮細(xì)胞。如上所述，優(yōu)選的輔助細(xì)胞系是293。Racher等人(5,'c^c/2"o/ogyrec/2m々wes,9:169-174,1995)公開了培養(yǎng)293細(xì)胞和繁殖腺病毒的改進(jìn)方法。在一個方案中，將單個細(xì)胞接種到l升硅化轉(zhuǎn)瓶(Techne，Cambridge,UK)中，轉(zhuǎn)瓶內(nèi)含有100-200ml培養(yǎng)基，使天然細(xì)胞聚合物生長。于40rpm攪拌后，用錐蟲藍(lán)評價細(xì)胞存活力。在另一個方案中，如下使用Fibra-Cel微載體(BibbySterlin，Stone，UK)(5g/1)。將細(xì)胞接種體重新懸浮于5ml培養(yǎng)基中，加到250ml錐形瓶的載體(50ml)中，靜置l-4小時，偶爾攪拌。然后培養(yǎng)基用50ml新鮮培養(yǎng)基更換，并開始振蕩。對于病毒產(chǎn)生，使細(xì)胞生長至約80%匯合，此后更換培養(yǎng)基(至25。/。終體積)，加入MOI為0.05的腺病毒。使培養(yǎng)物靜置過夜后，使體積增加至100。/。，再次開始振蕩72小時?？捎煞崔D(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建其它基因轉(zhuǎn)移載體。反轉(zhuǎn)錄病毒是一類單鏈RN病毒，以在感染細(xì)胞中經(jīng)反轉(zhuǎn)錄過程將其RNA轉(zhuǎn)化成雙鏈DNA的能力為特征(Coffin，載于Kra/ogy，F(xiàn)ields等編著，RavenPress,NewYork,第1437-1500頁，1990)。所得DNA然后穩(wěn)定地整合到細(xì)胞染色體成為原病毒并指導(dǎo)病毒蛋白的合成。整合導(dǎo)致病毒基因序列保留在受體細(xì)胞及其子代中。反轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有3個基因，即分別分別編碼衣殼蛋白、聚合酶和包膜組分的gag、pol和env。gag基因上游存在的序列中含有將基因組包裝成病毒體的信號。病毒基因組的5'端和3'端存在2個長末端重復(fù)序列(LTR)序列。這些序列含有強(qiáng)啟動子和增強(qiáng)子序列，也是整合到宿主細(xì)胞基因組所需要的(Coffin，1990)。為了構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒栽體，將目標(biāo)蛋白編碼核酸插入病毒基因組替換某些病毒序列以產(chǎn)生復(fù)制缺陷型的病毒。為了制備病毒體，構(gòu)建含有g(shù)ag、pol和env基因，但卻沒有LTR和包裝組分的包裝細(xì)胞系(Mann等，Ce〃，33:153-159,1983)。如果重組質(zhì)粒含有cDNA而且與反轉(zhuǎn)錄病毒LTR和包裝序列一起導(dǎo)入該細(xì)胞系中(通過例如磷酸鉤沉淀)，則包裝序列使重組質(zhì)粒的RNA轉(zhuǎn)錄物包裝入病毒顆粒內(nèi)，然后病毒顆粒被分泌到培養(yǎng)基中(Nicolas和Rubenstein,1988;Temin,1986;Mann等，1983)。然后收集含有重組反轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基，任選濃縮后，用于基因轉(zhuǎn)移。反轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠感染大量的細(xì)胞類型。然而，整合和穩(wěn)定表達(dá)需要宿主細(xì)胞分裂(Paskind等,Wra/ogy,67:242-248，1975)。其它病毒載體可用作表達(dá)構(gòu)建體。例如可以使用衍生自以下病毒的載體牛痘病毒(Ridgeway，1988;Baichwal和Sugden，1986;Coupar等，Ge"e，68:1-10,1988)、腺伴隨病毒(AAV)(Ridgeway，1988;Baichwal詳口Sugden，1986;Hermonat牙口Muzycska，iVaf/.^4c"ciSc/.81:6466-6470，1984)和皰滲病毒。它們?yōu)楦鞣N哺乳動物細(xì)胞提供數(shù)個有吸引力的特征(Friedmann,ScZence,244:1275-1281，1989;Ridgeway，1988;Baichwal和Sugden，1986;Coupar等，Ge"e,68:1-10，1988;Horwich等，JWra/.,64:642-650,1990)。藥物組合物在一些實施方案中，可將PlGF配體和/或一種或多種其它治療藥物給予患者，例如癌癥患者。這樣的藥物可以藥物組合物的形式給予。一般來說，需要制備基本上不含可能對人或動物有害的雜質(zhì)的組合物。—般可用合適的鹽和緩沖劑以提供穩(wěn)定及可被靶細(xì)胞攝取的治療藥物。水性組合物可包含有效量的P1GF結(jié)合蛋白或肽，溶解或分散于藥學(xué)上可接受的載體或水性介質(zhì)中。術(shù)語"藥學(xué)上或藥理學(xué)上可接受的"是指當(dāng)給予動物或人時不會產(chǎn)生毒副、致敏或其它不良反應(yīng)的分子實體和組合物。本文所用"藥學(xué)上可接受的載體"包括所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣材料、抗菌藥、抗真菌藥、等滲劑和吸收延緩劑等。用于藥學(xué)活性物質(zhì)的這些介質(zhì)和成分的應(yīng)用是本領(lǐng)域眾所其在治療組合物中應(yīng)用也都包括在本發(fā)明內(nèi)。補(bǔ)充的活性成分也可摻到組合物中。本文要求保護(hù)的方法和組合物可包括典型的藥物制劑。可通過任何常用途徑給予這些組合物，只要通過該途徑可到達(dá)耙組織。它包括口服、經(jīng)鼻、口腔、直腸、陰道或局部?；蛘?，可以通過原位，真皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、動脈內(nèi)或靜脈內(nèi)注射給予。這些組合物通常作為藥學(xué)上可接受的組合物給予。適于使用的藥物形式包括無菌水性溶液或者用于制備無菌溶液或分散體的無菌粉劑。在制備和保存條件下必需是穩(wěn)定的，并且保存時必需防止微生物(例如細(xì)菌和真菌)的污染作用。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)的溶劑或分散介質(zhì)、其合適的混合物和植物油?？梢酝ㄟ^例如使用包衣材料(例如卵磷脂)、在分散體的情況下通過維持所需要的粒徑及通過使用表面活性劑，來維持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。可以用各種抗菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯類、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，來防止微生物的作用。在許多情況下，優(yōu)選包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。通過在組合物使用延緩吸收的成分(例如單硬脂酸鋁和明膠)，可^f吏組合物的吸收延緩。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，可以通過包括例如口服或胃腸外(例如靜脈內(nèi))在內(nèi)的各種途徑給予患者藥物組合物。在某些情況下，P1GF配體可以露在脂質(zhì)體表面或者摻入脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體由石粦脂或其它脂質(zhì)組成，一般是無毒、生理上可接受的和可代謝的載體，相對易于制備和給藥。在某些實施方案中，必需給予患者有效量的治療藥，例如P1GF配體。"有效量，，是產(chǎn)生所需作用的藥物劑量。有效量將取決于例如藥物的功效和所需效果。例如，治療增生性疾病(例如黃斑變性或子宮內(nèi)膜異位癥)可能需要較少量的抗血管生成藥，相比之下，癌癥治療則需要更大用量，以減少或消除實體瘤，或者防止或減少其轉(zhuǎn)移?？捎帽绢I(lǐng)域眾所周知的方法，確定用子特定目的具體藥物的有效量。治療藥物化療藥物在某些實施方案中，化療藥物可與一種或多種抗血管生成藥(例如P1GF配體)共同給予?；熕幬锇ǖ幌抻?-氟尿嘧啶、博來霉素、白消安、喜樹堿、卡鉑、苯丁酸氮芥、順柏(CDDP)、環(huán)磷酰胺、放線菌素D、柔紅霉素、多柔比星、雌激素受體結(jié)合劑、依托泊香(VP16)、法尼基(farnesyl)-蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、吉西他濱、異環(huán)磷酰胺、氮芥、美法侖、絲裂霉素、諾維本、硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、丙卡巴耕、雷洛昔芬、他莫昔芬、泰素、temazolomide(DTIC含水形式)、反鉑、長春堿和曱氨蝶呤、長春新堿或上述藥物的任何類似物或衍生變異體?；熕幖捌浣o藥方法、劑量等是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(參見例如"PhysiciansDeskReference",Goodman和Gilman的"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics"禾口"Remington'sPharmaceuticalSciences",所述文獻(xiàn)的相關(guān)部分通過引用結(jié)合到本文中)。劑量上的某些變動取決于所治療患者的情況。負(fù)責(zé)給藥的人員在任何情況下都要為每個患者確定合適劑量。激素皮質(zhì)類固醇激素可提高其它化學(xué)治療藥的有效性，因此，它們經(jīng)常用于聯(lián)合治療。潑尼松和地塞米松是皮質(zhì)類固醇激素藥的實例。己酸幾孕酮、醋酸甲羥孕酮和醋酸甲地孕酮等孕酮類藥，已經(jīng)用于子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌。己烯雌酚和炔雌醇等雌激素藥，已經(jīng)用于乳腺癌和前列腺癌等癌癥。他莫昔芬等抗雌激素藥已經(jīng)用于乳腺癌等癌癥。丙酸睪酮和氟曱睪酮等雄激素藥也已用于治療乳腺癌。血管生成抑制劑在某些實施方案中，本文所公開的PIGF配體可與例如以下的一種或多種抗血管生成藥聯(lián)用血管生長抑素、baculostatin、人血管能抑素(canstatin)、乳腺絲抑蛋白、抗VEGF抗體、抗血管生長因子抗體、抗Flk-l抗體、抗Flt-l抗體、層粘連蛋白肽、纖連蛋白肽、纖溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白介素-12、IP-IO、Gro-p、血小板應(yīng)答蛋白、2-甲M^雌二醇、增殖蛋白相關(guān)蛋白、carboxiamidotriazole、CMIOI、馬立馬司他、戊聚糖多聚碌iJ臾酯、促血管生成素-2、干擾素-a、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利諾胺、沙利度胺、己酮可可堿、染料木堿、TNP-470、內(nèi)皮生長抑素、紫杉醇、accutin、血管生長抑素(angiostatin)、西多福韋、長春新堿、博來霉素、AGM-1470、血小板因子4或二甲胺四環(huán)素。免疫調(diào)節(jié)劑本文所用的術(shù)語"免疫調(diào)節(jié)劑"包括細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長因子、淋巴毒素和造血因子，例如白介素、集落刺激因子、干擾素(例如干擾素-ot、-P和-力和稱為"S1因子"的干細(xì)胞生長因子。合適的免疫調(diào)節(jié)劑部分的實例包括IL-2、IL-6、IL誦IO、IL畫12、IL-18、IL-21、干擾素-Y、TNF-a等。術(shù)語"細(xì)胞因子"是由一個細(xì)胞群體釋放、并作為細(xì)胞間介質(zhì)而作用于另一細(xì)胞的蛋白質(zhì)或肽的通稱。本文更廣泛采用的細(xì)胞因子的實例包括淋巴因子、單核因子、生長因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子包括生長激素，例如人生長激素、N-甲硫氨酰人生長激素和牛生長激素；曱狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，例如濾泡刺激激素(FSH)、甲狀腺刺激激素(TSH)和黃體激素(LH);肝生長因子；前列腺素、成纖維細(xì)胞生長因子；催乳素；胎盤催乳激素、OB蛋白；腫瘤壞死因子-a和肺瘤壞死因子-p;米勒管抑制物(mullerian-inhibitingsubstance);小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；活化素(activin);血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO);神經(jīng)生長因子，例如NGF-p;血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF),例如TGF-a和TGF-p;胰島素樣生長因子-I和-II;紅細(xì)胞生成素(EPO);骨誘導(dǎo)因子(osteoinductivefactor);干擾素，例如干擾素-a、p和y;集落刺激因子(CSF)，例如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF);粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF);和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF);白介素(IL)，例如IL-1、IL畫loc、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-ll、IL-12;IL-13、IL-14、IL-15、IL曙16、IL-17、IL-18、IL曙21、LIF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、kit-配體或FLT-3、血管生長抑素、血小板應(yīng)答蛋白、內(nèi)皮生長抑素、肺瘤壞死因子和LT。本文所用術(shù)語細(xì)胞因子包括天然來源或來自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)以及天然序列細(xì)胞因子的生物活性等同物。趨化因子通常作為化學(xué)引誘物起作用，以將免疫效應(yīng)細(xì)胞募集到趨化因子表達(dá)的位點上。有利之處可能是使趨化因子基因與例如細(xì)胞因子基因聯(lián)合表達(dá)，以加強(qiáng)其它免疫系統(tǒng)組分募集到治療位點上。趨化因子包括但不限于RANTES、MCAF、MIP1-a、MIP1-(3和IP-10。技術(shù)人員應(yīng)了解的是，已知某些細(xì)胞因子也具有化學(xué)引誘效果，并且也可歸類在趨化因子術(shù)語之內(nèi)。同樣，術(shù)語免疫調(diào)節(jié)劑和細(xì)胞因子在其各自成員中是重疊的。放射性同位素療法和放免療法在某些實施方案中，本文所公開和要求保護(hù)的肽和/或蛋白質(zhì)可用于放射性核素治療或放免治療方法(參見例如Govindan等，2005,『ec/w7o/ogyCawcerjReseorrc/zc&7Vea加eW,4:375-91;Sharkey和Goldenberg,2005,丄M/c/,A/d46:115S-127S;Goldenberg等(提交手稿),"AntibodyPretargetingAdvancesCancerRadioimmunodetectionandRadioimmunotherapy"，所述各文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)。在具體的實施方案中，P1GF配體可按下述方法直接用放射性同位素標(biāo)記，然后給予患者。在替代實施方案中，可以按上述預(yù)尋靶方法，采用經(jīng)放射性標(biāo)記的半抗原肽或P1GF配體給予放射性同位素，并在給予雙特異性抗體(其定位于患病組織P1GF表達(dá)增加的位點上)之后注射。用于治療患病組織的放射性同位素包括但不限于mIn、177Lu、212Bi、2、、211At、62Cu、64Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、川Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、"Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Ai^211Pb。治療性放射性核素的優(yōu)選衰變能范圍為20-6,000keV，對于俄歇發(fā)射體(Augeremitter)的優(yōu)選范圍為60-200keV,對于p發(fā)射體為100-2,500keV,而對于a發(fā)射體為4,000-6,000keV。有用的P粒子發(fā)射放射性核素的最大衰變能優(yōu)選為20-5,000keV,更優(yōu)選100-4,000keV,最優(yōu)選500-2,500keV。還優(yōu)選基本衰變俄歇發(fā)射粒子的放射性核素。例如，Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-lll、Sb-119、1-125、Ho國161、Os-189m和lr-192。有用的(3粒子發(fā)射放射性核素的衰變能優(yōu)選<1，000keV，更優(yōu)選〈100keV，最優(yōu)選〈70keV。還優(yōu)選伴有a粒子產(chǎn)生的基本衰變的放射性核素。這樣的放射性核素包括但不限于Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。有用的a粒子發(fā)射放射性核素的衰變能優(yōu)選為2,000-10,000keV，更優(yōu)選3,000-8,000keV，最優(yōu)選4,000-7,000keV。例如，"Cu因其半衰期為61.5小時并且充足供應(yīng)(3粒子和Y射線，被認(rèn)為是用于放免治療的更有希望的放射性同位素，可采用螯合劑對溴乙酰氨基-卡基-四乙胺四乙酸(TETA),將"Cu與PlGF配體(例如抗P1GF抗體)綴合在一起?；蛘?，可使用二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)，將發(fā)射高能P粒子的WY與肽、抗體、融合蛋白或其片段綴合在一起。額外的潛在放射性同位素包括"C、13N、150、75Br、98Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、mmTe、mmTe、125mTe、、%、、、、，丄、、、、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、20T1、225Ac、76Br、〗69yb等。在另一個實施方案中，輻射敏化劑可與棵的或綴合的PIGF配體、抗體或抗體片段聯(lián)用。例如，輻射敏化劑可與放射性標(biāo)記的配體、抗體或抗體片段聯(lián)用。當(dāng)與僅用放射性標(biāo)記的配體、抗體或抗體片段治療相比時，添加輻射敏化劑可導(dǎo)致功效增強(qiáng)。輻射敏化劑參見D.M.Goldenberg(主編)，CANCERTHERAPYWITHRADIOLABELEDANTIBODIES,CRCPress(1995),所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。通常以類似方式產(chǎn)生肽、抗體、體片段或融合蛋白，所述肽、抗體、體片段或融合蛋白具有加載硼附加物的載體用于熱中子活化治療。然而，有利的是可以等待直到未靶定的免疫綴合物清除后再進(jìn)行中子輻射。使用與P1GF配體結(jié)合的抗體可加速清除。參見美國專利第4,624,846號對該基本原理的描述。例如，硼附加物例如碳硼烷，可以與P1GF配體抗體連接?？梢杂么箲覀?cè)鏈上的羧基官能團(tuán)，制備碳硼烷，正如本領(lǐng)域眾所周知的一樣。可通過^友硼烷的氛基活化并與載體上的胺縮合，使碳硼烷與栽體(例如氨基葡聚糖)連接起來。然后將中間綴合物與P1GF抗體綴合。給予P1GF抗體綴合物之后，通過熱中子輻射活化硼附加物并轉(zhuǎn)化成放射性原子，其通過a-發(fā)射衰變，產(chǎn)生高毒性、短射程效果。藥盒各種實施方案可涉及含有適于治療或診斷患者患病組織的組分的藥盒。示例性的藥盒可含有至少一種P1GF配體。任選其它藥盒成分可包括一種或多種其它抗血管生成藥、化療藥物、雙特異性抗體或如上所述的其它成分。如果含有給藥組分的組合物并非配制成經(jīng)消化道(例如口服)給予的劑型，則可包括能夠通過某些其它途徑遞送藥盒組分的裝置。一類裝置(例如用于胃腸外給藥)是注射器，用于將組合物注射到患者體內(nèi)。也可使用吸入裝置?？蓪⑺幒薪M分包裝在一起，或分開包裝在兩個以上單獨的容器中。在一些實施方案中，容器可以是含有適于重配的無菌凍干組合物制劑的小瓶(管)。藥盒也可含有適于重配和/或稀釋其它試劑的一種或多種緩沖劑?？墒褂玫钠渌萜靼ǖ幌抻诖⒈P、盒、管等?？蓪⑺幒薪M分經(jīng)無菌包裝并保存在容器內(nèi)?？砂ǖ牧硪徊糠质墙o藥盒使用人員的使用說明書實施例本文包括以下實施例，用于說明本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，在隨后實施例中公開的技術(shù)代表著已被證實是在實施本發(fā)明中效果良好的技術(shù)，因此可視為在實施中構(gòu)成優(yōu)選才莫式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員按照本說明書應(yīng)當(dāng)理解的是，可以在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，對已公開的具體實施方案做出改動，卻仍然保持相似或類似的結(jié)果。實施例1.P1GF對腫瘤細(xì)胞生長、移動、血管生成和轉(zhuǎn)移的作用方法與材料免疫組織化學(xué)、組織病理學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)通過標(biāo)準(zhǔn)方法，用1-5嗎/1111第一抗體和1:500稀釋的？110標(biāo)記的第二抗體(BiosourceInternational,Camarillo,CA)進(jìn)行流式纟田胞術(shù)。使用細(xì)胞Quest軟件(CellQuestsoftware),從BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀(BDBiosciences)中收集數(shù)據(jù)。對于P1GF和VEGF表達(dá)，用標(biāo)準(zhǔn)免疫組織化學(xué)方法(Taylor等，2002a)，使得自USBiomaxInc.(Rockville，MD)的石蠟包埋的原發(fā)性乳腺癌組織陣列與TARP，NCI(Bethesda，MD)染色。組織陣列還可探測Flt-l或NRP-l(ABXIS，Seoul,Korea)。使載玻片脫蠟，用適當(dāng)?shù)恼Ｑ宸忾]，與購自SantaCruzBiotechnology,Inc.(SantaCruz,CA)的抗體一起溫育。與第一抗體溫育后，在3%^02中猝滅內(nèi)源過氧化物酶，隨后使用生物素化的第二抗體。將抗生物素蛋白-生物素-辣根過氧化物酶(HRP)綴合物涂在經(jīng)洗滌的載玻片上。將載玻片與HRP底物3,3'-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB，得自Sigma,St.Louis，MO)溫育10分鐘，用蘇木精(Sigma)復(fù)染。在100倍下觀察經(jīng)染色的載玻片，通過指定反映染色強(qiáng)度的相對數(shù)值給染色強(qiáng)度評級弱(0.25-0.5),中等(0.5-1.0)，高(l.0-2.0)，強(qiáng)(〉2.0);得分按0.25個點遞增。所有載玻片都由一名研究人員讀數(shù)(盲測)，由另一名抽查。僅評價看似有活力的腫瘤區(qū)域，將表示總強(qiáng)度和被染色細(xì)胞％的數(shù)值賦予各載玻片。分值不包括細(xì)胞外、結(jié)締組織和白細(xì)胞的染色。還評價了本底染色(由對照Ag8抗體表示)，然后減去本底染色。如果染色強(qiáng)度為o.5以上，則腫瘤樣本^^見作陽性。人肺瘤異種移植物樣品用蘇木精和伊紅染色。細(xì)胞系為了進(jìn)一步表征所使用的細(xì)胞系，對于P1GF或VEGF表達(dá)，用流式細(xì)胞術(shù)測定MCF-7、MDA-MB-231和-468(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Mannassas,VA)。對于雌二醇受體a的表達(dá)(SantaCruzBiotechnology),還通過細(xì)胞單層培養(yǎng)物的IHC，進(jìn)行MDA-MB-231和-468和MCF-7的測定。MCF-7為陽性，MDA-MB-231和-468對于雌激素受體為陰性。對于Flt-l,還通過IHC，對MDA-MB-231和-468異種移植物腫瘤進(jìn)行探測，結(jié)果為陽性。未得到MCF-7腫瘤的Flt-l測試。噬菌體的分離和篩選按照供應(yīng)商的方法，噬菌體文庫(Ph.D,12噬菌體展示肽文庫試劑盒，NewEnglandBiolabs，Inc.，Ipswich,MA)4皮用來淘選重組人PlGF-2(P1GF)或重組人VEGF165(VEGF)(R&DSystems,Flanders,NJ)。隨后用P1GF或者用對應(yīng)于P1GF分子上推定受體結(jié)合部位的肽進(jìn)行淘選。噬菌體進(jìn)行三輪淘選后，接種到瓊脂上，經(jīng)一系列10倍稀釋后用于滴定。從滴定板中挑選充分分離的噬斑，擴(kuò)增用于進(jìn)一步研究。測序由擴(kuò)增噬斑分離出DNA，用Ph.D.試劑盒所推薦的引物(噬菌體特異性的M13)測序，Ph.D.試劑盒即熱測序酶放射性標(biāo)記終止子《盾環(huán)觀J序i式劑盒(ThermoSequenaseRadiolabeledTerminatorCycleSequencingKit)(USB,Swampscott,MA)。結(jié)合肽l(BP1)含有20個氨基酸。對照肽CPA得自從BP1中用A置換H、R和D殘基。BPl和CPA是商用合成的(UniversityofGeorgia),#支用于體外和體內(nèi)研究。檢測肽序列與Flt-l或PlGF上的推定配體結(jié)合部位的同源性。一種肽，即結(jié)合肽l(BP1)，與結(jié)構(gòu)域2的Flt-l結(jié)合部位的位置同源性最小，對應(yīng)Y199和L204(Davis-Smyth等，1998，《/說o/C/em273:3216-3222;Iyer等，2001,J說o/C&m276:12153-12161),且其序列不比其它的長。其它肽長度為9-12個氨基酸，根據(jù)淘選間序列的一致性進(jìn)行選擇。得自分離噬菌體的兩個噬斑序列是相同的(結(jié)合肽3，BP3)。肽序列肽名稱序列BP1SHRYRLAIQLHASDSSSSCV(SEQIDNO:1)BP2QDDHLTTGR(SEQIDNO:2)BP3QEAFNRLTSRMH(SEQEDNO:3)BP4RMPYSEHSAPLG(犯QIDNO:4)用于與P1GF、VEGF或Flt-l結(jié)合的噬菌體或游離肽的測定對于各包被孔，使用噬菌體展示系統(tǒng)供應(yīng)商推薦的淘選方案，另外的孔在緩沖液(作為緩沖液對照)中溫育。去除包被溶液后，板在室溫下用2%BSA的PBS溶液封閉1.5小時。還封閉另一個未包神支板，用于稀釋噬菌體。封閉后，經(jīng)擴(kuò)增的噬菌體(~108噬菌體/1111)用封閉緩沖液按l:20稀釋，將各稀釋液50inl加入PlGF包被/封閉孔中和僅封閉孔中。噬菌體在室溫下進(jìn)行結(jié)合l-2小時。倒空各板，通過浸泡洗滌并倒空三次(洗滌液0.05%吐溫-20(Tween-20)的PBS溶液)。與HRP綴合的抗M13-嗟菌體抗體(AmershamBiosciences,Buckinghamshire,England)用封閉緩沖液按l:1000稀釋后，加到所有孔中，并在室溫下溫育1小時。各板如所述經(jīng)浸泡洗滌。加入底物，30-60分鐘后，在410nm下讀取吸光度。96孔板用10)ug/mlP1GF、10pg/ml重組人Flt-l融合蛋白(R&DSystems)或10pg/mlVEGF包被，通過包被96孔板來測定游離肽結(jié)合。用2.5或25U/ml肝素(Sigma,St.Louis,MO)進(jìn)行竟?fàn)帨y定。在C端依次用接頭和FLAG表位(DYKDDDDKSEQIDN0:5)合成BP1、BP3、BP4和BP3合成型(scrBP3)。加入第一試劑30分鐘后，加入第二試劑，再孵育30分鐘。通過探測FLAG表位評價肽結(jié)合(Prickett等，Biotechniques7:580-9,1989;Castrucci等，J.Virol.66:4647-53,1992)。在490nm下讀取吸光度。在基于ELISA的結(jié)合測定中，CPA與P1GF和VEGF結(jié)合，但是對Flt-1的親和性削弱(50%)。CPA肽在體外和體內(nèi)始終是無活性的。腫瘤細(xì)胞存活力在低血清(iy。)條件下進(jìn)行MTT(3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基溴化四唑，Sigma)測定，確定P1GF對細(xì)胞存活力的作用，肽的毒性及其對P1GF介導(dǎo)的乳腺肺瘤細(xì)胞生長的作用(Mosmann，1983,J7mmwwo/A/ef/265:55-63;Modrak等,2000,5Zoc/2emB/o//2>^尺es268:603-606)。肽濃度為1-2^M，外源PlGF的濃度為2nM。所測人乳腺腫瘤系為MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF-7(ATCC,Mannasses,VA)。筒單地說，將培養(yǎng)基中的5-10X1(^個細(xì)胞/ml接種到96孔板中，培養(yǎng)基含有1。/。胎牛血清(FBS)。24小時后，細(xì)胞用各種肽以l-2pM的濃度處理(4種結(jié)合肽)，一式四份和/或用rhuPlGF按2nM的濃度處理。在規(guī)定時間后，將0.5mg/mlMTT(5mg/ml母液用無血清RPMI培養(yǎng)基按l:10稀釋)力口到各孔(Mosmann,1983)中。當(dāng)細(xì)胞中紫色結(jié)晶清楚可見時，各板似乎已充分發(fā)育，用酸/醇(0.04MHCl/異丙醇)終止反應(yīng)。在570nm下讀取結(jié)晶溶解后的吸光度。選擇24小時的時間點，因為該時間可測到P1GF對腫瘤細(xì)胞遷移的體外作用(參見下述傷口愈合測定)。另用含有10。/。FBS的培養(yǎng)基進(jìn)行這些測定，得到類似的結(jié)果。傷口愈合測定為了測定P1GF、VEGF和BP肽對乳腺胂瘤和正常人內(nèi)皮細(xì)胞(HEC)的功能作用，進(jìn)行傷口愈合測定(Verma等，2001,Ce〃M'cra編3:169-180;Sung等，2003,￡"xpCe//■287:209-218;Itokawa等，Afo/.C朋cw77je廠.1:295-302,2002)。將MCF-7、MDA-謹(jǐn)-231和MDA-MB-468乳腺腫瘤細(xì)胞系或HEC接種到培養(yǎng)皿的無菌玻璃封蓋玻片上或6孔板中。當(dāng)細(xì)胞70-80%匯合時，用無菌塑料移液管尖刮擦單層培養(yǎng)物。封蓋玻片用無菌PBS洗滌，然后用PlGF或VEGF(2nM)、肽(2jaM)、或者用抗體(0.67-lixg/ml)單獨或聯(lián)合處理。抑制劑濃度為50jnMPD98059(PD98)(促分裂原活化蛋白激酶激酶l[MEK1]抑制劑)、5nM渥曼青霉素(-舞脂酰肌醇3激酶[PI3K]抑制劑)或人重組可溶性Flt-l(sFlt-l)(R&D系統(tǒng))。將肽或sFlt-l與含有P1GF、VEGF的培養(yǎng)基溫育10分鐘后加入細(xì)胞。將細(xì)胞與PD98和渥曼青霉素預(yù)溫育15-30分鐘后加入P1GF。用顯微鏡檢查經(jīng)染色(Wright-Giemsa)和封好的封蓋玻片。通過統(tǒng)計分離自傷口邊緣并且似乎正向傷口中央遷移的細(xì)胞數(shù)，求出5-10個100倍視野的值。結(jié)果用100倍視野中遷移到傷口的平均細(xì)胞數(shù)表示。在某些情況下，結(jié)合得自獨立實驗的數(shù)據(jù)以調(diào)整表中不同處理的內(nèi)容。細(xì)胞侵襲測定向生長因子還原的基質(zhì)膠侵襲室(growthfactor-reducedMatrigelinvasionchamber)(BDBiosciencesDiscoveryLabware,Bedford,MA)加入5x104細(xì)胞，測定細(xì)胞侵襲(Taylor等，2003b;Passaniti等，1992，丄"6/"ve"67，519-528)。Matrigel⑧塞中的各添加物與100]li1PBS(總體積)在室溫下一起預(yù)溫育10分鐘后，將各添加物加到基質(zhì)膠中。將生長因子(2.0或0.2nM)、肽(2jig/ml)或抗體(liLig/ml)加到低血清(0.1。/。胎牛血清[FBS])培養(yǎng)基中的細(xì)胞內(nèi)。包括了基線和基于化學(xué)引誘物的侵襲(10%FBS)。在24小時(MDA-MB-231)或48小時(MCF-7、MDA-MB-468)染色后，在100倍放大倍率下，通過統(tǒng)計侵襲室膜底部的細(xì)胞數(shù)，來確定侵襲細(xì)胞數(shù)目。提供3-5個獨立實驗的結(jié)果。肽治療對體內(nèi)胖瘤生長的作用將組織培養(yǎng)基中生長的人乳腺腫瘤細(xì)胞系MDA-MB-231經(jīng)皮下(s.c.)植入到棵小鼠兩脅。當(dāng)腫瘤可見時，給小鼠稱重，并測量肺瘤。當(dāng)胂瘤體積平均約0.06-0.12cn^時，開始用肽治療。小鼠用200嗎肽的PBS溶液通過腹膜內(nèi)注射治療兩周，間隔3-4天。在每次治療時，給動物稱重并測量腫瘤。在第二個實驗中，包括了對照肽CPA。最終治療后第三天，收獲腫瘤和肺。在各小鼠總數(shù)為4片載玻片或切片的所有肺組織中，統(tǒng)計存在的集落(colony)(<20個細(xì)胞)、簇(cluster)(〉20-100個細(xì)胞)和結(jié)節(jié)(nodule)(>100個細(xì)胞)，以確定肺(得自實驗l)的腫瘤負(fù)荷。數(shù)據(jù)用每個治療組(3-4只小鼠/組)各大小轉(zhuǎn)移的平均數(shù)表示。統(tǒng)計每個治療組的各總數(shù)的合計數(shù)，除以該組小鼠的總數(shù)。通過下列公式確定轉(zhuǎn)移的抑制百分比％抑制=(#模擬品治療-#治療/#模擬品治療)x100。將生長在組織培養(yǎng)基中的MDA-MB-231植入SLID小鼠的乳腺脂肪墊(mfp)中(3xl()S個細(xì)胞，4-5只小鼠/組)。在該模型中，較不可能發(fā)生大量的肺轉(zhuǎn)移(Richert等，^"ea^Ca"cer化&7:R819-27,2005)。植入后第5天，當(dāng)所有小鼠中可觸到小腫瘤時，開始肽治療(8次治療)。最終肽治療后三天，取出腫瘤并稱重。如上所述收獲肺，并用顯微鏡檢查轉(zhuǎn)移。統(tǒng)計分析用ANOVA評價結(jié)合、存活力、移動、血管生成、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移腫瘤負(fù)荷。尸<0.05^^見為有顯著性。結(jié)果P1GF在原發(fā)性人乳腺癌和乳腺腫瘤細(xì)胞系中進(jìn)行組成型表達(dá)如上所述，通過組織陣列的免疫組織化學(xué)染色，研究原發(fā)性乳腺癌和乳腺腫瘤細(xì)胞系的組成型P1GF和P1GF受體表達(dá)的頻率。結(jié)果(見表1)表明P1GF陽性樣品的比例比VEGF的高(PlGF為43。/。-60。/。；VEGF為13。/。-14。/。)。P1GF受體NRP-1的表達(dá)不限于乳腺癌實質(zhì)(27。/。)，但肺瘤內(nèi)皮除外。另一方面，對于Flt-l，腫瘤實質(zhì)和內(nèi)皮都為陽性(分別為65%和56%)。表l:原發(fā)性乳腺癌的P1GF、VEGF、NRP-l和Flt-l表達(dá)。<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>用來源。ND,未進(jìn)行。肺癌和腦腫瘤(成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)也屬于具有相對高頻率表達(dá)的癌(分別為32%和20%，數(shù)據(jù)未顯示)。結(jié)腸癌屬于最低的組成型表達(dá)體(8%),與結(jié)腸胂瘤細(xì)胞系相同(1/4)(未顯示)。用流式細(xì)胞術(shù)分析人乳腺癌細(xì)胞系、MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-468的P1GF和VEGF表達(dá)。對于MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-468，P1GF陽性細(xì)胞的百分比分別為29%、49%和38%。對于MCF-7、MDA-MB-23l和MDA-MB-468，VEGF陽性細(xì)胞的百分比分別為8%、18%和13%。因此，這些細(xì)胞系是相對高的P1GF表達(dá)體和相對低的VEGF表達(dá)體。MDA-MB-23l和-468異種移植物腫瘤都表達(dá)PlGF受體Flt-l。MDA-MB-468的NRP-1染色微弱(未顯示)，文獻(xiàn)中已記載了由MDA-MB-23l表達(dá)NRP-l(Soker等，J.說o/C/zew.271:5761-7,1996)。這些細(xì)胞系凈皮用于隨后的研究。P1GF結(jié)合肽的衍生乳腺癌細(xì)胞相對高頻率的P1GF、NRP-l和Flt-l表達(dá)表示P1GF可對這些細(xì)胞產(chǎn)生直接作用。為了研究P1GF的乳腺癌細(xì)胞的作用，通過噬菌體肽文庫淘選獲得PlGF結(jié)合肽和Flt-l結(jié)合肽(BP)。在至少3輪淘選后獲得結(jié)合肽。結(jié)合肽1和結(jié)合肽2(BP1、BP2)得自對rhuPlGF的淘選，而結(jié)合肽3和結(jié)合肽4(BP3、BP4)得自首先對對應(yīng)于PlGF的推定受體-結(jié)合部位序列肽淘選2輪，然后對rhuPlGF淘選第三輪的噬菌體。BP3是兩個不同噬菌體斑所共有的序列。分離后，在P1GF包被板中對噬菌體進(jìn)行基于ELISA的結(jié)合測定。噬菌體BPl的吸光度讀數(shù)(410nm)為0.024(噬菌體文庫本底0.003)。結(jié)果表明P1GF淘選的噬菌體與P1GF包被孔的結(jié)合比本底增加10-20倍。合成肽BP1(SHRYRLAIQLHASDSSSSCVSEQIDNO:l),其具有C端FLAG表位，用于測定與PlGF和Flt-l及與VEGF的結(jié)合。BP1與P1GF結(jié)合(A4900.100±0.058)，與VEGF165結(jié)合(A4900.299±0.174)，不過與Flt-l的結(jié)合最強(qiáng)(A490，0.886士0.096)。當(dāng)Flt-l-故固定化后，通過向結(jié)合試驗中加入未結(jié)合的Flt-l,來進(jìn)一步測定Flt-l結(jié)合。加入游離Flt-l(2nM)引起B(yǎng)Pl與固定化Flt-l的結(jié)合降低380/0(A490對于僅5fiMBPl為0.527土0.025;加入游離Flt-l和BPl，為0.327±0.127)。進(jìn)行額外的測定以確定P1GF的存在是否會干擾BP1-Flt-1相互作用。濃度為lnM和100nM之間的PlGF對BPl與Flt-l結(jié)合沒有顯著作用。這些發(fā)現(xiàn)表示BPl與Flt-l上不是與結(jié)構(gòu)域2的部位相互作用，而PlGF與Flt-l的主要相互作用則定位在結(jié)構(gòu)域2上。隨后，研究了BP1與存在于Flt-l和PlGF-2的肝素結(jié)合部位的締合。如圖l所示，向Flt-l包一皮的各^1中加入肝素后，再加入BP1導(dǎo)致BP1結(jié)合降4氐64。/。(尸<0.0002)。然而，如果BP1在加入肝素前加入，BP1的結(jié)合僅^皮抑制130/。(尸〉0.Q5)。因此，BP1最可能在肝素結(jié)合部位或在肝素結(jié)合部位附近與Flt-l結(jié)合。BP1本身可含有肝素結(jié)合基序，因為首6個殘基與玻連蛋白中存在的肝素結(jié)合區(qū)的首6個殘基有相同的模式(XBBXBX)。該結(jié)構(gòu)域可用作選擇性結(jié)合肽序列的核心，在抑制血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移和/或腫瘤細(xì)胞移動方面可顯示出功效提高。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解的是，例如在標(biāo)作"X"的位置上氨基酸的隨機(jī)化，可能導(dǎo)致有用的BP1類似物的產(chǎn)生。雖然電荷分布可能很重要，但是其它堿性殘基(例如組氨酸、精氨酸、賴氨酸)在標(biāo)作"B"位置上的置換也可導(dǎo)致有用的BP1類似物的產(chǎn)生。未發(fā)現(xiàn)BP1與VEGF的可測量結(jié)合。料想不到的是，BP1與Flt-l的結(jié)合還是本底的10倍。Flt-l結(jié)合的特異性通過將未結(jié)合Flt-l(2nM)加到基于ELISA的結(jié)合試驗中進(jìn)行測定，這引起5pMBP1與固定化Flt-l的結(jié)合降低38。/。。還測定了肽BP3、肽BP4及BP3合成型(ascrambledversion)(BP3scr)作為游離肽與PlGF和Flt-l的結(jié)合，在高達(dá)50pM的濃度下，與P1GF無可檢測結(jié)合。未發(fā)現(xiàn)這些肽與Flt-l的可檢測結(jié)合。乳腺腫瘤細(xì)胞當(dāng)暴露于P1GF或肽時的存活力對P1GF和所有4種肽對乳腺腫瘤細(xì)胞存活力的作用進(jìn)行了測定。選擇細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-468,因為它們代表了許多原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌。MCF-7為雌激素受體陽性，具有適當(dāng)良好分化的組織結(jié)構(gòu)。MDA-MB-231最初獲自轉(zhuǎn)移性胸膜滲出物(Cailleau等，1974，JAto/Ca"ce〃w對53:661-674)，為雌激素受體陰性，形成不良分化的III級腺癌異種移植物。MDA-MB-468是為雌激素受體陰性，分化不良，在棵小鼠是致瘤的。所有這三種腫瘤組成型產(chǎn)生的PlGF^PlGF陰性結(jié)腸肺瘤細(xì)胞系HT-29的3-4倍(通過流式細(xì)胞術(shù))，且表達(dá)低水平的PlGF受體Flt-l(數(shù)據(jù)未顯示)。MDA-MB-231產(chǎn)生的P1GF最多，MDA-MB-468最低。將P1GF(2nM)加到腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中導(dǎo)致24小時培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)目增力口(對于MDA-MB-231和MDA-MB-468i3<0,04)(圖4)。為了測定肽對P1GF刺激的存活力和增殖的作用，使肽(1-2^VI)與P1GF(2nM)混合。將肽加到^4nGF的MTT測定中的結(jié)果見圖4。將BP4加到含PlGF的MCF-7培養(yǎng)物中(圖4A)導(dǎo)致細(xì)胞存活力顯著降低，與將BP3加到MDA-MB-231中一樣(尸<0.03)。所有這三種肽都降低含P1GF的MDA-MB-468培養(yǎng)物的存活力(未顯示)(尸<0.03)。腫瘤細(xì)胞僅與肽(2)iM)孵育24小時對細(xì)胞存活力無顯著性作用，MCF-7與BP1孵育除外，其中存活力降低21。/。(P〈0.005)。與未處理對照相比，與BP3、MCF-7孵育48小時后同樣喪失存活力(P〉0.05)。P1GF刺激腫瘤細(xì)胞遷移并參與轉(zhuǎn)移P1GF、VEGF和Flt-l，2nM;肽，2pM?？贵w濃度為l|ig/ml。MEK1抑制劑、PD98059(PD98)，50pM。PI3K抑制劑、渥曼青霉素，5nM。結(jié)果用遷移到"傷口，，的平均細(xì)胞數(shù)士SD表示，細(xì)胞數(shù)得自5-10個100倍顯微視野/治療/18-24小時實驗，11=2-4次實驗?？贵w和抑制劑治療的數(shù)值來自包括所有相關(guān)對照的單獨實驗。在兩個實驗中，所有數(shù)值約為大多數(shù)前一實驗數(shù)值的一半，因此通過因子2使之歸一化，然后再與其它實驗平均。UT表示未處理對照。承與UT相比i3<0.01(ANOVA);十與僅P1GF相對P<0.02(ANOVA)。豐與僅PlGF相比i3<0.001(ANOVA)。將處理的平均數(shù)值除以僅P1GF或僅VEGF的數(shù)值，來確定相^f活性。PI3K和MEK1活化通常與酪氨酸激酶受體(RTK)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。另外，活化的PI3K和MEKl涉及肺瘤細(xì)胞遷移(Zeng等，J說o/.C72e肌276:26969-79;Hollande等，爿肌J.尸/z;^/0/.Ga對raz."fe對.丄/ver尸/2，z'o/.280:G910-21,2001)。為了研究P1GF刺激的移動是否是由這些激酶之一的活化所致，MDA-MB-231用P1GF和PI3K抑制劑(渥曼青霉素，5nM)或MEKl抑制劑(PD98059,50jiM[PD98〗)處理。PD98和渥曼青霉素分別顯著抑制PlGF刺激的遷移達(dá)68。/。和72。/。(尸<0.001)(表2)。這些結(jié)果表示P1GF通過PI3K和MEK1途徑的活化，可能是通過經(jīng)Flt-l的PI3K活化，來刺激細(xì)胞移動。因為侵襲基底膜的能力對轉(zhuǎn)移是必不可少的，所以進(jìn)行了添力口P1GF或VEGF的侵襲測定。按2.0nM和0.2nM加入PlGF導(dǎo)致24小時后MDA-MB-231的侵襲增加幾乎3倍(11土8.1未處理對30±13.7(2.0nM)或28士12(0.2nM)PlGF處理，尸<0.05)(圖2)。VEGF(2.0nM或0.2nM)不改變MDA-MB-231的侵襲能力(10±8.0個細(xì)胞)。肽BP1的加入導(dǎo)致P1GF刺激的侵襲降低500/。(15±4.2個細(xì)胞)(對于僅P1GF，尸<0.02)。對照肽CPA，不抑制P1GF的活性(35±17.3個細(xì)胞)。將抗P1GF抗體(0.6fig/ml)加到0.2nMP1GF測定中導(dǎo)致侵襲細(xì)胞減少460/。(15±2.3個細(xì)胞，一次實驗)。總之，這些結(jié)果表示P1GF在侵襲性腫瘤細(xì)胞系MDA-MB-231中刺激侵襲，抑制肽BP1類似于P1GF抗體，可抑制這種活性。MDA-MB-468和MCF-7獲得類似的結(jié)果，但沒有統(tǒng)計顯著性沐3)。表3.P1GF增加乳腺癌細(xì)胞系的侵襲潛力。BP1抑制P1GF介導(dǎo)的侵襲潛力。<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>在使用MDA-MB-231的同位乳腺脂肪墊(mfp)模型中，用BP1治療的腫瘤重量減小23。/。(模擬品治療，0.423±0.089g;CPA，0.416±0.083g;BP1，0.345士0.095)，其都未達(dá)到統(tǒng)計顯著性。植入MDA-MB-231的mfp未產(chǎn)生大的肺結(jié)節(jié)，可能是由實驗期限短所致(4.5周)。然而，接近肺靜脈的微轉(zhuǎn)移(micrometastases)(20至>100個細(xì)胞)是顯而易見的(未顯示)。對于模擬品治療、CPA和BPl,每只小鼠的微轉(zhuǎn)移計數(shù)分別為3.4土1.9，2.8士1.3和0.6±0.5(對于模擬品治療或CPA治療尸<0.02)，轉(zhuǎn)移減少82%。帶有MDA-MB-468異種移植物(平均腫瘤體積0.19cm3)的小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射各個肽(200iag/劑)進(jìn)行治療(圖5)。一周兩次治療4周后，用BP1(圖5A)或BP3(圖5B)治療的小鼠中，腫瘤生長受抑制分別達(dá)49%和58%。兩周治療后BPS對胂瘤生長作用是明顯的(圖5B),而BP1的抑制作用一周后就很明顯(圖5A)。在用BP1治療期間，在第IO天、第14天、第17天和第24天(圖5A)各腫瘤體積的平均變化具有顯著性(尸<0.05)。用BP2的治療無效果；腫瘤以幾乎與才莫擬品治療對照相同的速率繼續(xù)生長(結(jié)果未顯示)。BP4治療造成20%的腫瘤生長抑制(結(jié)果未顯示)。抑制血管生成為了進(jìn)一步研究P1GF結(jié)合肽對內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成的作用，將含有P1GF、BP1、BP2或PBS的基質(zhì)膠基底膜塞經(jīng)皮下植入棵小鼠兩脅。在PBS對照中，內(nèi)部微血管的數(shù)目為16.2±11.4/mm2。僅P1GF的植入物含有28.9±17.2/mm2(是模擬品治療植入物的1.8倍)，具有P1GF和BP1的植入物僅含有12.3±13.0個微血管/mm2(尸〈0.02)。討論數(shù)項研究表明由癌(包括乳腺癌)引起的P1GF表達(dá)，與復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和死亡率有關(guān)(Wei等，Gut54:666-72,2005;Chen等,CancerLett.213:73-82,2004;Parr等，Eur.J.Cancer41:2819-27，2005;Weidner等，Am.J.Pathol.143:401-9，1993;Zhang等，WorldJ.Surg.Oncol.3:68,2005)。P1GF還與許多病理狀態(tài)(Carmeliet等，Nat.Med.7:575-83，2001)和胂瘤新血管形成(Li等，F(xiàn)ASEBJ.20:1495-97，2006;Taylor等，Int.J.Cancer1-5:158-69，2003)有關(guān)。人類癌癥中VEGF和P1GF的臨床研究結(jié)論不一致。例如，在一份報告中，P1GF，而不是VEGF,刺激離體費城染色體陽性的急性髓細(xì)胞性白血病的生長(Ikai等，Eur.J.Haematol.75:273-9,2005)。另一方面，VEGF與腎細(xì)胞癌階段、組織學(xué)等級及其血管供應(yīng)和靜脈侵襲有關(guān)(Matsumoto等，AnticancerRes.23:4953-8，2003)。這些作者凈良道稱，PIGF還是該癌癥獨立的預(yù)后因子。已經(jīng)開發(fā)出大量抗VEGF藥物，包括封閉性抗體在內(nèi)的阻止VEGF-受體結(jié)合的一些小分子和反義寡核苷酸已經(jīng)在臨床試驗中進(jìn)4亍觀'J"i式(Whatmore等，2002,jwg/ogewew's5:45-51;Mulligan-Kehoe等,2002,J說o/C/zem277:49077-49089;Shi和Siemann,2002,6rJCa"cw87:119-126;Yang等，2003，A^/A/349，427-434)。這些研究的結(jié)果提出腫瘤血管生成是復(fù)雜和充足的；也就是說，當(dāng)通過治療降低VEGF時，或者在VEGF表達(dá)較低的肺瘤類型中，可能有建立將血液供應(yīng)給惡性腫瘤的"后備"機(jī)制。P1GF有可能參與這種功能冗余。P1GF還是動脈生成的，引起從先存在的吻合中形成動脈(Pipp等，2003)。以上提供的數(shù)據(jù)顯示P1GF提高乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛力，因為它刺激移動和侵襲，這與在腫瘤中以轉(zhuǎn)移為特征的上皮-間充質(zhì)細(xì)胞間的轉(zhuǎn)化有關(guān)。相比之下，在這些測定中外源性添加VEGF對腫瘤細(xì)胞移動或侵襲不起作用。這些結(jié)果不同于Bachelder等人的結(jié)果(CancerRes.62:7203-6,2002)，其中發(fā)現(xiàn)VEGF是侵襲刺激物(MDA-MB-231)。然而，這項研究沒有包括P1GF;因此，未進(jìn)行生長因子的比較。我們的結(jié)果根據(jù)的是腫瘤細(xì)胞環(huán)境存在P1GF或VEGF，而Bachelder等人(2002)使用RNAi抑制細(xì)胞產(chǎn)生VEGF，其結(jié)果可能不同于VEGF的旁分泌作用。另一份報告顯示，當(dāng)通常是低P1GF和高VEGF表達(dá)體的腫瘤系過度表達(dá)PlGF時的PlGF抑制作用(Xu等，CancerRes.6:3971-7,2006)。這種表達(dá)模式不同于本研究所用乳腺細(xì)胞系的模式，所述細(xì)胞系是高P1GF、低VEGF表達(dá)體，是一種模擬原發(fā)性人乳腺癌的模式。至少一項其它的研究顯示，VEGF和P1GF協(xié)同剌激病理病癥中的血管生成(Carmeliet等，2001)。P1GF或VEGF對胂瘤病理的作用極有可能是復(fù)雜的，可能部分是由它們在腫瘤微環(huán)境中相對充足，以及在腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮中存在它們的活性受體所致。正如本文所公開的一樣，用抗P1GF抗體，以及BP1、所研發(fā)的PlGF-2/Flt-l拮抗肽，抑制P1GF刺激癌細(xì)胞移動和侵襲的能力。曾推測如果P1GF是抑制性的，則它的除去可能使VEGF介導(dǎo)的活性繼續(xù)，然而情況并非如此。對外源P1GF刺激作用潛在的胞內(nèi)機(jī)制進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示PI3K和MEK1途徑可能參與P1GF刺激的遷移。之前已發(fā)現(xiàn)這些途徑與細(xì)胞遷移有關(guān)(Hollande等，2001),但是這些激酶也參與促進(jìn)癌癥進(jìn)程的其它過程，包括蛋白質(zhì)翻譯、基因調(diào)節(jié)、增殖、侵襲和抗凋亡(Zeng等，J.Biol.Chem.276:26969-79，2001;Hollande等，2001;Belka等，Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.58:542-54，2004;Pommery等，Ann.Pharm.Fr.63:69-75，2005;Bancroft等，Clin.CancerRes.7:435-42，2001;Mekhail等，CellCycle3:1027-9，2004;Pollheimer等，Angiogenesis3:159-66，1999)。表達(dá)P1GF的胂瘤細(xì)胞可通過自分泌/旁分泌途徑獲得存活益處，所述途徑賦予它們更多的抗死亡信號，并在需要時使它們遷移至血供給處的。為了闡明P1GF在胂瘤和內(nèi)皮細(xì)il包生物學(xué)中的作用，我們研發(fā)了拮抗肽BPl,它抑制P1GF對肺瘤和內(nèi)皮細(xì)胞的活性，影響體內(nèi)自主轉(zhuǎn)移。本文的結(jié)果表明BPl對PlGF-2/Flt-l-肝素締合產(chǎn)生拮抗作用。肝素結(jié)合是某些受體酪氨酸激酶完全活化必不可少的(Park等，Bioechem.Biophys.Res.Comm.264:730-4,1999;Schlessinger等,Molec.Cell.6:743-50，2000;Ito等，Angiogenesis3:159-66,1999)，我們的發(fā)現(xiàn)支持這一結(jié)論，即PI3K和MEK1途徑的抑制常常與受體酪氨酸激酶(例如Fit-1)抑制由P1GF刺激的細(xì)胞遷移有關(guān)。通過防止肝素與PlGF-2和Flt-l緊密締合，BPl可防止活化信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)部。FGF-FGFR-肝素復(fù)合物結(jié)晶研究證明，肝素使配體和受體多重接觸。這種締合促進(jìn)受體的二聚化，這是活化所必需的(Park和Lee，1999;Schlessinger等，2000;Ito和Claesson-Welsh，1999，Angiogenesis3:159-166)。通過干預(yù)這種復(fù)合物，BPl可防止肝素與PlGF和Flt-l緊密締合。我們發(fā)現(xiàn)包括在血管生成測定中的外源肝素，即使在所加生長因子(例如VEGF或PIGF)不存在時也增加血管的形成(未公布數(shù)據(jù))。在這種情況下，所增加的血管生成非常可能是由肝素介導(dǎo)的對基質(zhì)膠是內(nèi)源的生長因子與遷移到植入物細(xì)胞上的受體之間的相互作用加強(qiáng)所致。除抑制P1GF介導(dǎo)的遷移以外，BPI能夠抑制加入PIGF的基底膜植入物中微血管的生長。這種內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制和胂瘤中血管的形成，與遷移測定數(shù)據(jù)一起，表示P1GF在乳腺癌病理中的功能是刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移，以及可能刺激管形成(數(shù)據(jù)未顯示)，并且還引起腫瘤細(xì)胞自身向血供給處移動。Bae等(Clin.CancerRes.11:2651-61，2005)最近報道了Flt-l拮抗肽的抗癌潛力，該肽抑制VEGF與Flt-l結(jié)合，并且抑制分泌VEGF的結(jié)腸腫瘤異種移植物的生長和轉(zhuǎn)移。用VEGF作為遷移和增殖的刺激物，通過該肽與內(nèi)皮細(xì)胞而不是與腫瘤細(xì)胞的相互作用，來測定該肽的活性。引人注意的是，這些作者所使用肽也抑制PlGF與Flt-l的結(jié)合，其部分功效歸因于這種相互作用。然而，這些作者的肽似乎不同于BP1，因為它干擾Flt-l結(jié)構(gòu)域2生長因子結(jié)合部位(Bae等，2005)，沒有與肝素結(jié)合區(qū)相互作用的證據(jù)。因此，Bae等人提供的肽非常可能按不同于BP1的方式起作用。通過用BP1治療自發(fā)轉(zhuǎn)移的人乳腺癌異種移植物，對癌癥中P1GF的體內(nèi)作用進(jìn)行了研究。用BP1肽治療抑制皮下MDA-MB-231胂瘤的生長，肺部轉(zhuǎn)移的發(fā)生降低94%,在同位(mfp^莫型中，降低82%。這些結(jié)果證實抗Flt-l肽(例如BP1)的生長和轉(zhuǎn)移抑制性能，表明該受體可在某些癌癥進(jìn)程中起關(guān)鍵作用，并代表了抗癌療法的一個靶標(biāo)。總之，我們證實了在某些原發(fā)性人類癌和細(xì)胞系，尤其是乳腺癌中P1GF的表達(dá)增加。P1GF增加了乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和-468的增殖和MCF-7和MDA-MB-231的移動。據(jù)我們所知，這是證明由P1GF直接活化惡性細(xì)胞最早的報道。此外，我們分離的肽BPl,它與PlGF和Flt-1結(jié)合，并且最終破壞體外？16-2/^1配體受體對的活性。被BP1阻斷的活性包括P1GF刺激的腫瘤細(xì)胞存活力和移動，以及基底膜植入物中微血管的形成。另外，用肽BP1治療帶有胂瘤的小鼠抑制乳腺腫瘤異種移植物MDA-MB-468的皮下生長，明顯降低由MDA-MB-231造成的肺轉(zhuǎn)移。實施例2:小鼠角膜測定中抑制P1GF介導(dǎo)的血管生成在體內(nèi)角膜組織中，對P1GF配體阻斷P1GF介導(dǎo)的血管生成能力進(jìn)行了研究。用改良的vonGraefe白內(nèi)障刀在5-6周齡雄性C57B16/J小鼠雙眼形成角膜微嚢袋。將由聚葡萄糖醛酸(polyglucuronicacid)/聚乳酸緩釋劑型組成的微丸(Micropellet)植入各個角膜嚢袋內(nèi)，該微丸含有100ngPlGF或PlGF與lpMBP-l、BP-2、BP-3或BP-4。在小丸植入后第5天，用裂隙燈活組織鏡檢查眼睛。測量血管長度和新血管形成。P1GF誘導(dǎo)強(qiáng)烈的血管生成反應(yīng)并伴有高密度的微血管形成。加入BP-1、BP-3或BP-4抑制角膜組織中P1GF介導(dǎo)的血管生成。治療糖尿病性視網(wǎng)膜病或黃斑變性患者抑制血管形成，改善病癥。實施例3:BP1融合蛋白和綴合物對于口服給藥或者在其它實施方案中，BP1及其類似物可與載體蛋白重組連接或化學(xué)連接。對于天然蛋白質(zhì)中存在的20種常見L-氨基酸組成的肽連接，優(yōu)選重組DNA方法。對于連接含有D-氨基酸、修飾氨基酸或非天然氨基酸的肽才莫擬物或肽，僅化學(xué)綴合方法是目前可行的。正如本文所公開的一樣，提供制備與人IgGl的Fc(hFc)糖類連接的BP1綴合物的通用方法。三種示例性的包含BP1和hFc的融合蛋白的構(gòu)建方法見下。用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)，制備用于在骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)hFc的載體。表達(dá)載體shCD20-Fc-pdHL2(圖6)用作DNA模板以通過PCR擴(kuò)增Fc的編碼序列(鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū))。進(jìn)行兩次PCR。用下述成對引物，第一次PCR擴(kuò)增完整的前導(dǎo)肽序列(A片段)。5'XbaI:TCTAGAGCACACAGGACCTC(SEQIDNO:6)3'Hind3:GAAGCTTGGAGTGGACACCT(SEQIDNO:7)用以下成對引物，笫二次PCR擴(kuò)增鉸鏈和CH2(B片段)5'Hind3:AAGCTTCCGACAAAACTCAC(SEQIDNO:8)3'Sac2:CCGCGGCTTTGTCTTGGCAT(SEQIDNO:9)用Xbal和Sac2消化shCD20-Fc-pdHL2后，將車交大的DNA片段與A片段和B片段連接，得到Fc的表達(dá)載體(hFc-pdHL2)。實施例4.BPl與hFc綴合骨髓瘤細(xì)胞用hFc-pdHL2轉(zhuǎn)染，篩選陽性克隆。使最高的生產(chǎn)克隆在滾瓶中生長，培養(yǎng)物上清液用A蛋白純化，得到hFc。用下述兩種方法之一，進(jìn)行BPl與hFc的綴合。在第一種方法中，hFc用高碘酸鈉氧化，在糖類中產(chǎn)生醛基團(tuán)。脫鹽步驟之后，氧化hFc用雜-交聯(lián)劑(hetero-crosslinker)例如BMPH(Pierce,產(chǎn)品號22297)衍生化以通過酰胼與醛反應(yīng)引入馬來酰亞胺基。除去過量試劑后，馬來酰亞胺偶聯(lián)的hFc通過BPl的半胱氨酸殘基反應(yīng)與BPl綴合。另一方法是將BMPH與BP1偶聯(lián)，用反相HPLC分離所得產(chǎn)物后，使BMPH-BP1與氧化的hFc反應(yīng)。實施例5:BPl-hFc的表達(dá)載體在替代實施方案中，BPl-hFc被構(gòu)建成為由兩個相同多肽組成的融合蛋白，每個多肽由通過柔性接頭(例如(GGGGS)3)與人IgGl的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3連接的BP1組成。兩個多肽通過由4i鏈上的半胱氨酸殘基所形成的二硫鍵共價結(jié)合。預(yù)期BP1-Fc將提供以下優(yōu)勢(1)BP1對VEGFR1肝素結(jié)合區(qū)的親和性可能由于二價BP1而升高；(2)分子大小的增加(-60kDa)可以更好地排除肝素與VEGFRl結(jié)合，導(dǎo)致更有效抑制地P1GF和VEGFR1間的相互作用；和(3)Fc的存在可能延長血清半壽期，并且可通過與在上皮細(xì)胞中表達(dá)的新生Fc受體(FcRn)結(jié)合，實施口服或肺遞藥。在骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)BP1-Fc的載體如下構(gòu)建。簡單地i兌，用保護(hù)編碼BP1的114bp序列的10-15bp重疊序列和(GGGGS)3接頭合成3個長的寡核苷酸，將HindIII位點加到末端。將寡核苷酸退火，用DNA聚合酶延長。使含有BP1和接頭的所得DNA片段純化并克隆到中間載體，然后通過測序證實。然后，用HindIII消化中間載體分離出該片段，克隆到HindlII切割的Fc-pdHL2上(參見實施例3)。因為有兩個可能的方向，通過雙重酶消化鑒定正確的一個并分離(BPl-hFc-pdHL2)。用BPl-hFc-pdHL2轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，篩選高產(chǎn)量克隆。使最高生產(chǎn)基因在滾瓶中生長，培養(yǎng)物上清液用A蛋白純化以獲得BPl-hFc。實施例6:二聚體BPl-hFc(BPl-hFc-ddd2)通過在BPl-hFc的C端上附加被稱為ddd2(SEQIDNO:IO)的特定肽序列，來獲得由二聚體BPl-hFc組成的融合蛋白。二硫4建使二聚體BPl-hFc穩(wěn)定，二聚體BPl-hFc含有4個BPl。ddd2ARA(SEQIDNO:IO)實施例7:BPl-hFcx抗VEGFR2Fab(~160kDa)用產(chǎn)生能夠既靶向VEGFR1又靶向VEGFR2的~160kDa綴合物的A2B技術(shù)，使BPl-Fc通過二硫鍵與抗VEGFR2Fab連接。首先通過將被稱為ad2(SEQIDNO:ll)的特定肽序列附加在CH1的C端，產(chǎn)生B型的抗VEGFR2。為了產(chǎn)生BPl-hFcx抗VEGFR1Fab，將BPl-hFc-ddd2(實施例6)與B型的抗VEGFR2相混合，用TCEP還原1小時。除去TCEP后，加入DMSO至終濃度為10。/。，以誘導(dǎo)2個親本蛋白中各存在的ddd2和ad2之間形成二硫4建。ad2GGCGQ正YLAKQIVDNAIQQAGC(SEQEDNO:11)承承氺根據(jù)本說明書，無需過度實驗，便可制備和實施本文所公開和要求保護(hù)的組合物和方法。雖然在優(yōu)選的實施方案方面描述了組合物和方法，但是對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不偏離本發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍的情況下，可以對本文所述組合物和方法及方法步驟或步驟的順序進(jìn)行改動。更準(zhǔn)確地講，化學(xué)和生理上相關(guān)的某些藥物可以替換本文所述藥物，而又可獲得相同或類似的結(jié)果。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，對所有這些類似的替換和修飾4皮視為落入本發(fā)明所附權(quán)利要求書的精神、范圍和構(gòu)思內(nèi)。權(quán)利要求1.一種包含胎盤生長因子(P1GF)配體的組合物，其中所述配體抑制血管生成、腫瘤生長或腫瘤轉(zhuǎn)移。2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述配體是肽。3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述肽通過針對P1GF的噬菌體展示進(jìn)行鑒定得到。4.權(quán)利要求2的組合物，其中所述肽包^i^自以下序列的至少12個連續(xù)的氨基酸殘基BP-1(SEQIDNO:l)、BP-2(SEQIDNO:2)、BP-3(SEQIDNO:3)或BP-4(SEQIDNO:4)。5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述肽包含BP-1的序列(SEQIDNO:l)。6.權(quán)利要求l的組合物，其中所述配體包含抗體、抗體片段、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、人抗體片段或抗體類似物。7.權(quán)利要求2的組合物，其中所述肽為線狀或環(huán)狀構(gòu)象。8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述肽在肽的兩端包含半胱氨酸殘基，且半胱氨酸殘基彼此鍵合形成環(huán)肽。9.權(quán)利要求l的組合物，其中所述腫瘤是淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑素瘤或癌。10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述腫瘤是乳腺癌。11.權(quán)利要求2的組合物，其中所述肽與PlGF和Fms樣酪氨酸激酶受體Flt-l結(jié)合。12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述肽與P1GF-2和Flt-l上的肝素結(jié)合部位結(jié)合。13.權(quán)利要求12的組合物，其中所述肽抑制肝素與P1GF和/或Flt-l結(jié)合。14.權(quán)利要求12的組合物，其中所述肝素抑制肽與P1GF和/或Flt-l結(jié)合。15.權(quán)利要求2的組合物，其中所述配體與另一種分子或化合物連接。16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述配體與以下成分連接抗體、雙特異性抗體、抗體片段、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、人抗體片段、抗體類似物、Fc片段、Fc-結(jié)合蛋白、抗體-結(jié)合融合蛋白、藥物、前藥、毒素、酶、寡核苷酸、放射性同位素、免疫調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞因子、激素、結(jié)合分子、脂質(zhì)、多聚物、膠束、脂質(zhì)體、納米粒子或其組合。17.權(quán)利要求16的組合物，其中所述配體與結(jié)合到腫瘤抗原上的分子連接。18.權(quán)利要求15的組合物，其中所述配體與結(jié)合到疾病靶標(biāo)上的分子連接。19.權(quán)利要求17的組合物，其中所述分子是雙特異性抗體或其片段，所述抗體或片段具有一個結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原的部位和笫二個結(jié)合P1GF配體的部位。20.權(quán)利要求15的組合物，其中所述配體與單克隆抗體或其片段共價連接，所述單克隆抗體或片段具有結(jié)合疾病靶標(biāo)的部位。21.權(quán)利要求19的組合物，其中雙特異性抗體具有針對腫瘤相關(guān)抗原的結(jié)合部位，所述抗原選自A3、A33抗體特異性抗原、BrE3-抗原、CD1、CDla、CD3、CD5、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、HLA-DR、NCA95、NCA90、HCG及其亞基、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、CSAp、EGFR、EGP-1、EGP-2、Ep-CAM、Ba733、HER2/neu、低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KSl-4、Le-Y、巨噬細(xì)胞抑制因子(MIF)、MAGE、而C1、MUC2、而C3、而C4、PAM-4、PSA、PSMA、RS5、SIOO、TAG-72、p53、生腱蛋白、IL-6、IL-8、胰島素生長因子-1(IGF-1)、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、VEGF、ED-B纖連蛋白、17-lA-抗原、血管生成標(biāo)記、癌基因標(biāo)記和癌基因產(chǎn)物。22.權(quán)利要求l的組合物，其中所述腫瘤選自急性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞性白血病、膽管癌、乳腺癌、宮頸癌、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食管癌、胃癌、頭頸部癌、霍金奇淋巴瘤、肺癌、甲狀腺髓質(zhì)癌、非霍金奇淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌和膀胱癌。23.權(quán)利要求15的組合物，其中所述P1GF配體是結(jié)合肽，所述結(jié)合肽與抗體Fc片段、Fc-結(jié)合蛋白或抗體-結(jié)合融合蛋白共價連接。24.權(quán)利要求23的組合物，其中所述P1GF配體與抗體Fc片段連接，所述抗體是IgGl。25.—種用于抑制腫瘤血管生成、轉(zhuǎn)移、腫瘤生長、腫瘤細(xì)胞存活和/或癌細(xì)力包移動的方法，該方法包^^舌a)獲得與胎盤生長因子(P1GF)結(jié)合的配體；和b)給予受治療者所述配體其中所述配體抑制腫瘤血管生成、轉(zhuǎn)移、腫瘤生長、腫瘤細(xì)胞存活和/或癌細(xì)力包移動。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述配體是肽。27.權(quán)利要求26的方法，該方法進(jìn)一步包括通過噬菌體展示對肽進(jìn)行鑒定。28.權(quán)利要求26的方法，其中所述肽包含選自以下序列的至少12個連續(xù)的氨基酸殘基BP-1(SEQIDNO:l)、BP-2(SEQIDNO:2)、BP國3(SEQIDNO:3)或BP-4(SEQIDNO:4)。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述肽包含BP-1的序列(SEQIDNO:l)。30.權(quán)利要求25的方法，其中所述配體選自抗體、抗體片段、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、人抗體片l殳和抗體類似物。31.權(quán)利要求25的方法，其中所述受治療者患有乳腺癌。32.權(quán)利要求26的方法，該方法進(jìn)一步包括將一種或多種抗癌癥藥物與所述肽聯(lián)合給藥。33.權(quán)利要求25的方法，該方法進(jìn)一步包括給予受治療者磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)或促分裂原活化蛋白激酶激酶1(MEK1)的抑制劑。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述PI3K抑制劑是渥曼青霉素，或者M(jìn)EK1抑制劑是PD98059。35.權(quán)利要求32的方法，其中所述藥物選自化療藥物、放射療法、免疫療法、放免療法、局部高溫、激光輻射和手術(shù)切除。36.權(quán)利要求25的方法，該方法進(jìn)一步包括給予受治療者一種或多種抗血管生成化合物。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述化合物抑制VEGF介導(dǎo)的血管生成。38.權(quán)利要求25的方法，其中所述配體抑制P1GF激活的癌細(xì)胞移動。39.—種治療涉及血管生成的疾病的方法，該方法包括a)獲得與胎盤生長因子(P1GF)結(jié)合的配體；和b)給予受治療者配體其中所述配體抑制血管生成。40.權(quán)利要求39的方法，其中所述疾病選自癌癥、增生、糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑變性、炎性腸病、節(jié)段性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、哮喘、水肺、肺動脈高壓、牛皮癬、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張、心肌血管生成、斑塊新血管形成、再狹窄、血管創(chuàng)傷后新內(nèi)膜形成、毛細(xì)管擴(kuò)張、血友病性關(guān)節(jié)、血管纖維瘤、慢性炎癥相關(guān)的纖維化、肺纖維化、深部靜脈血才全形成和傷口肉芽形成。41.一種使藥物靶向腫瘤或血管內(nèi)皮細(xì)月包的方法，該方法包括a)獲得與胎盤生長因子(P1GF)結(jié)合的配體；和b)將配體與藥物連接；其中P1GF配體與腫瘤和/或血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述配體選自BP-1(SEQIDNO:l)、BP國2(SEQIDNO:2)、BP-3(SEQIDNO:3)和BP-4(SEQIDNO:4)。43.權(quán)利要求41的方法，該方法進(jìn)一步包括給予雙特異性抗體，所述雙特異性抗體具有一個針對P1GF配體的結(jié)合部位和第二個針對腫瘤抗原的結(jié)合部位。44.權(quán)利要求43的方法，其中所述配體-抗體復(fù)合物經(jīng)口;^或吸入給藥，配體-抗體復(fù)合物通過與新生Fc受體轉(zhuǎn)運系統(tǒng)相互作用而#皮吸引。45.—種藥盒，所述藥盒包括P1GF配體和包裝容器。46.權(quán)利要求45的藥盒，該藥盒還包括化療藥物、雙特異性抗體、抗血管生成藥或其組合。47.—種融合蛋白，該融合蛋白包含P1GF配體序列和第二種序列。48.權(quán)利要求47的融合蛋白，其中所述P1GF配體序列包*自以下序列的至少12個連續(xù)的氨基酸BP-1(SEQIDNO:l)、BP-2(SEQIDNO:2)、BP-3(SEQIDNO:3)或BP-4(SEQIDNO:4)。全文摘要本發(fā)明涉及用于抑制血管生成和/或腫瘤生長、存活和/或轉(zhuǎn)移的方法和組合物。在具體實施方案中，該方法和組合物可涉及針對胎盤生長因子(PlGF)，例如BP-1、BP-2、BP-3或BP-4的配體。一些方法可包括單獨給予患者一種或多種PlGF配體，或者與一種或多種其它藥物聯(lián)合給予，其它藥物例如化療藥物、其它抗血管生成藥、免疫治療藥物或放射免疫治療藥物。PlGF配體有效地抑制血管生成、腫瘤細(xì)胞移動、腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤生長和/或腫瘤存活。在某些實施方案中，可以給予患者PlGF配體以改善其它血管生成相關(guān)疾病，例如黃斑變性。在一些實施方案中，可以通過任何已知方法來測定PlGF表達(dá)水平，從而選擇最有可能對PlGF靶向療法作出反應(yīng)的患者。文檔編號A61K38/17GK101534849SQ200680039268公開日2009年9月16日申請日期2006年10月16日優(yōu)先權(quán)日2005年10月19日發(fā)明者A·P·泰勒,D·M·戈登伯格,張健行申請人:分子醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)中心;免疫醫(yī)療公司