根據(jù)其所附的說明書代替了PrimeScript(注冊 商標）RTase，制備包含2iigCspA的20iiL逆轉(zhuǎn)錄反應溶液和不包含CspA的20iiL逆轉(zhuǎn)錄 反應溶液。SuperscriptIIIRTase為衍生自MMLV的逆轉(zhuǎn)錄酶的變體。
[0167] 結(jié)果是，在SuperscriptIIIRTase用作逆轉(zhuǎn)錄酶的情況下，不管CspA存在或不 存在，都未檢測到來自PolyA附近的6, 930個堿基的長鏈cDNA產(chǎn)物。當將溶液置于冰上更 久時，距離PolyA大約7kb遠的區(qū)域中139bp的合成cDNA的量在不包含CspA的溶液中有 所增加。在包含CspA的逆轉(zhuǎn)錄溶液的情況下，相同區(qū)域中的cDNA的量幾乎沒有增加，并且 置于冰上20分鐘的溶液中合成的cDNA的量為不包含CspA的反應溶液的1/87 (圖7)。因 此，證實了在冰上制備并放置逆轉(zhuǎn)錄反應溶液時，盡管使用了SuperscriptIIIRTase作為 逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄反應溶液中的CspA可幾乎完全抑制來自不同于PolyA的非-特異性延伸 產(chǎn)物（背景）的合成。
[0168] 實施例8
[0169] 證實在使用寡聚dT作為引物的逆轉(zhuǎn)錄反應中，來自PolyA以外的非-特異性延伸 產(chǎn)物（背景）的量
[0170] 根據(jù)類似于實施例6的方法確定CspA的作用，除了使用ReverseTranscriptase XL(AMV)(由TAKARABIOINC?制造）代替了PrimeScript(注冊商標）RTase制備包含 1iiL 的 1yg/yL人心臟總RNA(由Clontech制造）、1iiL的 50iiM寡聚dT、1. 6iiL各 2. 5mM的 dNTP混合物、2iiL的ReverseTranscriptaseXL(AMV)緩沖液、0? 5iiL的 40U/iiL核酸酶 抑制劑、0? 8uL的 25U/uLReverseTranscriptaseXL(AMV)以及l(fā)uL的 2iig/iiLCspA 的20yL逆轉(zhuǎn)錄反應溶液和不包含CspA的20yL逆轉(zhuǎn)錄反應溶液。逆轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)為 衍生自AMV的逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0171] 結(jié)果是，在ReverseTranscriptaseXL(AMV)用作逆轉(zhuǎn)錄酶的情況下，不管反應溶 液中CspA存在或不存在，都未檢測到來自PolyA附近的6, 930個堿基的長鏈cDNA產(chǎn)物。 當將溶液置于冰上更久時，距離PolyA大約7kb遠的區(qū)域中139bp的cDNA的量在不包含 CspA的溶液中有所增加。在包含CspA的逆轉(zhuǎn)錄溶液的情況下，相同區(qū)域內(nèi)中的cDNA的量 幾乎沒有增加，并且置于冰上20分鐘的溶液中合成的cDNA的量為不包含CspA的反應溶液 的1/84 (圖8)。因此，證實了在冰上制備并放置逆轉(zhuǎn)錄反應溶液時，盡管使用了衍生自AMV 的逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄反應溶液中的CspA可幾乎完全抑制來自PolyA以外的非-特異性延伸 產(chǎn)物（背景）的合成。
[0172] 實施例9
[0173] 在使用寡聚dT作為引物的逆轉(zhuǎn)錄反應中，對長鏈cDNA合成反應的抑制
[0174] 根據(jù)類似于實施例1的方法，使用PrimeScript(注冊商標）RTase(由TAKARABI0 INC.制造）制備包含2ygCspA的20yL逆轉(zhuǎn)錄反應溶液以及不包含CspA的20yL逆轉(zhuǎn) 錄反應溶液。將所制備的溶液置于冰上0-20分鐘，并在42 °C下進行逆轉(zhuǎn)錄反應30分鐘，然 后在95°C加熱5分鐘，然后停止反應。根據(jù)類似于實施例6的方法，將2yL的分別的反應 溶液進行靶向來自肌營養(yǎng)不良蛋白基因的P〇lyA附近的6, 930個堿基的長鏈的實時PCR，這 樣對從逆轉(zhuǎn)錄反應合成的cDNA的量進行定量。
[0175] 結(jié)果是，在不包含CspA的反應溶液中，與完全沒有將溶液置于冰上相比，在溶液 置于冰上20分鐘的情況下來自PolyA附近的6, 930個堿基的長鏈延伸產(chǎn)物的量減少到 52%。在包含CspA的反應溶液中，盡管將其置于冰上20分鐘，所合成的cDNA的量卻完全沒 有減少（圖9)。看起來是因為反應溶液中CspA幾乎完全抑制了來自PolyA以外的非-特 異性延伸反應，所以獲得了CspA的作用，而且PolyA沒有抑制延伸反應。
[0176] 從獲得的結(jié)果中證實了反應溶液中CspA使得對反應溶液制備后對逆轉(zhuǎn)錄反應必 要的時間量的關注變得不必要，并可實現(xiàn)達到了高質(zhì)量的cDNA合成反應，其中來自PolyA 的cDNA合成的背景很少，而且非?？赡芫哂腥L。
[0177] 實施例10
[0178] 在其中使用寡聚dT作為引物的逆轉(zhuǎn)錄反應中，對長鏈cDNA合成反應的抑制2
[0179] 根據(jù)類似于實施例9的方法進行測試，除了根據(jù)SuperscriptIIIRTase所 附的說明書使用SuperscriptIIIRTase(由InvitrogenCorporation制造）代替 PrimeScript(注冊商標）RTase,制備包括2iigCspA的20iiL逆轉(zhuǎn)錄反應溶液和不包括 CspA的20yL逆轉(zhuǎn)錄反應溶液，在50°C下進行30分鐘的逆轉(zhuǎn)錄反應，在70°C下對溶液加熱 15分鐘,然后停止反應。對由逆轉(zhuǎn)錄反應合成的cDNA的量進行定量以證實CspA的作用。
[0180]結(jié)果是，在不包含CspA的反應溶液中，與完全沒有將溶液置于冰上相比，在溶液 置于冰上20分鐘的情況下來自PolyA附近的長鏈延伸產(chǎn)物的量減少到11 %。在包含CspA 的反應溶液中，盡管將其置于冰上20分鐘，但與完全沒有將溶液置于冰上相比，所合成的 cDNA的量是80% (圖10)。盡管使用SuperscriptIIIRTase作為逆轉(zhuǎn)錄酶，證實了CspA 可抑制對由在冰上制備并放置逆轉(zhuǎn)錄反應溶液產(chǎn)生的來自PolyA的長鏈cDNA合成反應的 抑制。
[0181] 實施例11
[0182] 在其中使用寡聚dT作為引物的逆轉(zhuǎn)錄反應中，對長鏈cDNA合成反應的抑制
[0183] 根據(jù)類似于實施例9的方法進行測試，除了使用ReverseTranscriptaseXL(AMV) (由TAKARABI0INC?制造）代替了PrimeScript(注冊商標）RTase制備包含 1iiL的 1iig/ UL人心臟總RNA(由Clontech制造）、1iiL的 50iiM寡聚dT、1. 6iiL各 2. 5mM的dNTP混 合物、2uL的ReverseTranscriptaseXL(AMV)緩沖液、0? 5uL的 40U/uLRibonuclease Inhibitor、。. 8uL的 25U/uLReverseTranscriptaseXL(AMV)以及 1uL的 2ug/uL CspA的20yL逆轉(zhuǎn)錄反應溶液和不包含CspA的20yL逆轉(zhuǎn)錄反應溶液。對逆轉(zhuǎn)錄反應合 成的cDNA的量進行定量以證實CspA的作用。
[0184]結(jié)果是，在不包含CspA的反應溶液中，與完全沒有將溶液置于冰上相比，在溶液 置于冰上20分鐘的情況下來自PolyA附近的長鏈延伸產(chǎn)物的量減少到33%。在包含CspA 的反應溶液中，盡管將其置于冰上20分鐘，與完全沒有將溶液置于冰上相比，所合成的 cDNA的量為75% (圖11)。盡管使用衍生自AMV的逆轉(zhuǎn)錄酶作為逆轉(zhuǎn)錄酶，證實了CspA可 抑制對由制備逆轉(zhuǎn)錄反應溶液產(chǎn)生的來自PolyA的長鏈cDNA合成反應的抑制。
[0185] 實施例12
[0186]CspA對使用天然RNA作為模板的逆轉(zhuǎn)錄反應發(fā)揮的作用
[0187] 用酶儲存緩沖液稀釋制備實施例中所制備的5iig/iiL的CspA溶液以制備 0? 2yg/yL的CspA溶液、1yg/yL的CspA溶液和2yg/yL的CspA溶液。下一步，以這 樣的方式分別制備總體積為10UL的各種混合物：將1iiL的酶儲存緩沖液，0. 2iig/iiL的 CspA溶液，1iig/iiL的CspA溶液、2iig/iiL的CspA溶液或5iig/iiL的CspA溶液分別加 至luL的liig/yL人心臟總RNA(由Clontech制造），1iiL的50iiM寡聚dT, 1iiL的各 lOmM的dNTP混合物，以及6yL的滅菌蒸餾水。關于不包含CspA并使用酶儲存緩沖液制備 的混合物，制備兩種不同的混合物。這樣的混合物之一進行RNA變性步驟，在65°C下五分 鐘，另一種不進行此步驟。對于包含CspA的混合物不進行RNA變性步驟。
[0188] 將4iiL包含于PrimeScript第一鏈cDNA合成試劑盒（由TAKARABIOINC?制造） 中白勺 5xPrimeScriptBuffer>0. 5uLStJ40U/uLRibonucleaselnhibitor、0. 5yL白勺 200U/iiLPrimeScriptRTase、和5iiL的滅菌蒸饋水加至10iiL的這些混合物中，以制備 總共為20iiL的反應溶液。然后將反應溶液進行逆轉(zhuǎn)錄反應，在42°C下30分鐘，并在95°C 下加熱五分鐘以停止反應。下一步，將2. 5yL的這些反應溶液進行靶向肌營養(yǎng)不良蛋白基 因中大約8kb的區(qū)域的PCR。將TaKaRaLATaq(注冊商標）熱啟動版本（由TAKARABIO INC.制造）用作PCR，并且以其所附的說明書中列舉的反應組合物進行反應。作為引物使 用的是具有SEQIDNO: 20中所示核苷酸序列的引物以及具有SEQIDNO: 21中所示核苷酸 序列的引物。在PCR反應溶液中各種引物的濃度為200nM。進一步地，PCR由TaKaRaPCR ThermalCyclerDice(注冊商標）（由TAKARABIOINC.制造）在這樣的條件下進行：30個 循環(huán)，其中98°C10秒_68°C8分鐘構(gòu)成一個循環(huán)。在PCR反應完成后，將3yL的反應溶液 進行瓊脂糖凝膠電泳，以證實擴增產(chǎn)物的鏈長度和量。根據(jù)證實的結(jié)果，估計所合成的cDNA 的量以及每個逆轉(zhuǎn)錄反應中反應的特異性（圖12)。
[0189] 結(jié)果是，PCR后進行的分析顯示在其中天然RNA用作模板的逆轉(zhuǎn)錄反應的反應溶 液中包括CspA的情況下，擴增的大約8kb的長鏈cDNA的量有極大提高，而靶標以外的所擴 增的DNA量有所減少（圖12)。由結(jié)果顯示，當將CspA加入反應溶液中時，可以以高效力及 高特異性進行cDNA合成，這使得RNA變性步驟不必要了。
[0190] 實施例13
[0191]CspA對1-步RT-PCR發(fā)揮的作用
[0192] 靶向肌營養(yǎng)不良蛋白質(zhì)基因中大約2kb的區(qū)域的1 -步RT-PCR，其中將5ng或50ng 的人心臟總RNA(由Clontech制造）用作模板，使用PrimeScript(注冊商標）0neStep RT-PCR試劑盒（由TAKARABIOINC.制造）進行反應。使用具有SEQIDNO:21中所示核苷 酸序列的引物和具有SEQIDN0:22中所示核苷酸序列的引物作為引物。關于1-步RT-PCR 中使用的溶液組成，將5ygCspA加至25yL的反應溶液，在PrimeScript(注冊商標）One StepRT-PCR試劑盒所附的說明書中列舉了此溶液的組成。進一步地，還制備了向其中加入 了 1UL酶儲存緩沖液代替5ygCspA的不包含CspA的反應溶液，以及向其中加入了 1yL 單鏈DNA結(jié)合蛋白質(zhì)（SSB)溶液（由USB公司制造）（5iig/iiLSSB、50mMTris-HCl(pH 7.5)、200mMNaCl，0.1mMEDTA、lmMDTT、50% 甘油）代替 5iigCspA的反應溶液。對這些 反應溶液進行逆轉(zhuǎn)錄反應，在42°C下30分鐘，并在94°C下加熱兩分鐘，然后使用TaKaRa PCRThermalCyclerdice(注冊商標）對其進行PCR反應，條件為30個循環(huán)，其中94°C30 秒-55°C30秒-72°C2分鐘構(gòu)成一個循環(huán)。在反應完成后，對3yL的反應溶液進行瓊脂糖 凝膠電泳以分析反應產(chǎn)物（圖13)。
[0193] 結(jié)果是，在含有CspA的溶液中除大約2kb的靶標大小以外的任何大小的非-特異 性擴增產(chǎn)物有明顯的減少。在加入SSB時，沒有獲得靶標大小的擴增產(chǎn)物。
[0194] 實施例14
[0195]CspA在RT-PCR反應中改進反應的產(chǎn)量和特異性的作用
[0196] 使用人心臟RNA作為用于反應的模板，RT-PCR靶標為肌營養(yǎng)不良蛋白2。 PrimeScriptRTase、RNase抑制劑、ExTaqHS或PrimeStarMax、寡聚核苷酸的存在下進行 反應。在有CspA或沒有CspA時進行復制反應。還測試了不同溫度如42°C或50°C。觀察 到在CspA存在下，非-特異性產(chǎn)物有所減少，而且隨著CspA量的提高（多至2. 5ygCspA 每10ill反應）產(chǎn)物的產(chǎn)量有所改進。在更高的溫度如42°C和50°C下CspA也是有活性的。 發(fā)現(xiàn)有CspA的結(jié)果可與其中用熱處理對RNA中二級結(jié)構(gòu)去穩(wěn)定化的反應相比較。
[0197] 實施例