酸，可以通過(guò)放射性同位 素如32P或35S、熒光部分、化學(xué)發(fā)光部分、生物發(fā)光部分或酶檢測(cè)到。
[0034] 如本文使用的，脫氧核苷酸三磷酸指的是這樣的核苷酸，其糖部分由脫氧核糖組 成，并具有三磷酸基團(tuán)。天然DNA包括四種不同核苷酸，其分別具有腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶 和此胸腺嘧啶作為堿基部分。本發(fā)明組合物中包含的脫氧核苷酸三磷酸為四種脫氧核苷酸 三磷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物。在本發(fā)明中，還可使用脫氧核苷酸三磷酸的衍 生物。脫氧核苷酸三磷酸衍生物包括[?S]dATP，7-deaza-dGTP、7-deaza_dATP和顯示了針 對(duì)核酸消化的抗性的脫氧核苷酸衍生物。核苷酸衍生物還包括，例如，以這樣的方式標(biāo)記的 脫氧核苷酸，可以通過(guò)放射性同位素如32P或35S、熒光分子、化學(xué)發(fā)光分子、生物發(fā)光分子或 酶檢測(cè)到。
[0035] 如本文使用的，反應(yīng)緩沖溶液指的是包括緩沖試劑或緩沖試劑混合物的溶液，可 進(jìn)一步包括二價(jià)陽(yáng)離子和單價(jià)陽(yáng)離子。
[0036] 在本文使用的術(shù)語(yǔ)"或"（例如A或B)的范圍內(nèi)，意指"A或B或二者"。如本文使 用的，術(shù)語(yǔ)"一個(gè)"或"一種"或"這個(gè)"的使用不旨在對(duì)量進(jìn)行限制。例如，詳述的說(shuō)明書中 參考的"一種冷休克蛋白質(zhì)"不旨在指"單一冷休克蛋白質(zhì)"，且這種參考可包含任何單一冷 休克蛋白質(zhì)或多個(gè)冷休克蛋白質(zhì)。
[0037] 附圖簡(jiǎn)述
[0038] 圖1示例說(shuō)明在CspA存在或不存在時(shí)，由TaqDNA聚合酶擴(kuò)增的DNA片段的瓊脂 糖凝膠電泳結(jié)果。在以"M"標(biāo)記的泳道電泳Hindlll-消化的ADNA。
[0039] 圖2示例說(shuō)明在CspA存在或不存在時(shí)，由用于LA-PCR的DNA聚合酶混合物擴(kuò)增 的DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。在以"M"標(biāo)記的泳道電泳Hindlll-消化的XDNA。
[0040] 圖3示例說(shuō)明在CspA存在或不存在時(shí)，由a-型DNA聚合酶擴(kuò)增的DNA片段的瓊 脂糖凝膠電泳結(jié)果。在以"M"標(biāo)記的泳道電泳Hindlll-消化的ADNA。
[0041] 圖4示例說(shuō)明在CspA存在或不存在時(shí)，從多種靶標(biāo)序列擴(kuò)增的DNA片段的瓊脂糖 凝膠電泳結(jié)果。在以"M"標(biāo)記的泳道電泳100bp梯度標(biāo)記物（laddermarker,由TAKARA BIOINC制造）。
[0042] 圖5示例說(shuō)明在熱-處理的或非熱處理的CspA存在時(shí)，由用于LA-PCR的DNA聚 合酶混合物擴(kuò)增的DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。在以"M"標(biāo)記的泳道電泳100bp梯度 標(biāo)記物。
[0043] 圖6為示例說(shuō)明CspA發(fā)揮的抑制非-特異性延伸產(chǎn)物的作用的附圖。
[0044] 圖7為示例說(shuō)明CspA發(fā)揮的抑制非-特異性延伸產(chǎn)物的作用的附圖。
[0045] 圖8為示例說(shuō)明CspA發(fā)揮的抑制非-特異性延伸產(chǎn)物的作用的附圖。
[0046] 圖9為示例說(shuō)明CspA發(fā)揮的改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反應(yīng)性的作用的附圖。
[0047] 圖10為示例說(shuō)明CspA發(fā)揮的改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反應(yīng)性的作用的附圖。
[0048] 圖11為示例說(shuō)明CspA發(fā)揮的改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反應(yīng)性的作用的附圖。
[0049] 圖12為示例說(shuō)明CspA發(fā)揮的改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反應(yīng)性的作用的附圖。圖6-12中M 標(biāo)注了將2. 5iiL的入-Hindlll消化產(chǎn)物（由TAKARABIOINC?制造）標(biāo)記物進(jìn)行電泳 的泳道。
[0050] 圖13為示例說(shuō)明CspA發(fā)揮的改進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反應(yīng)性的作用的附圖。圖13中M 標(biāo)注了將2. 5iiL的入-Hindlll消化產(chǎn)物（由TAKARABIOINC?制造）標(biāo)記物進(jìn)行電泳的 泳道。
[0051] 圖14描繪了MS2RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及CspA的MazF-mt3的內(nèi)切核糖核酸酶活 性的增強(qiáng)。圖 14A描繪了由MF0LD(http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/ mfold-simple.html)預(yù)測(cè)的MS2ssRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。37°C下的最小折疊能為-1460. 69kcal/ 摩爾。箭頭指示由引物延伸分析鑒定的MazF-mt3的切割位點(diǎn)，藍(lán)點(diǎn)箭頭指示引物延伸分析 沒(méi)有檢測(cè)到的MazF-mt3的預(yù)測(cè)切割位點(diǎn)。圖14B描繪了通過(guò)RNA伴侶分子CspA對(duì)內(nèi)切核 糖核酸酶活性的增強(qiáng)。在37°C下，使用（泳道3、4、5和6)或不使用（泳道1和2)純化的 N-末端加His-標(biāo)簽的MazF-mt3,使用（泳道2和5, 32iig;泳道4,16iig;泳道6,64iig) 或不使用（泳道1和3)純化的CspA蛋白質(zhì)，進(jìn)行部分消化全長(zhǎng)MS2mRNA。消化反應(yīng)混合 物（10U1)由 1.6iig的MS2RNA底物，1.6iig的]\&^卩1^3(把8)6，16、32或641^的〇8口八 及 10mMTris-HCl(pH7. 8)中 0? 5ii1 的RNase抑制劑（Roche)構(gòu)成。反應(yīng)產(chǎn)物在 1. 2%(lx TBE)瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。
[0052] 圖15A-H描繪了使用（His) 6MazF-mt3對(duì)MS2RNA的體外切割，顯示MazF-mt3特異 性地在UUC⑶位點(diǎn)處進(jìn)行切割。泳道1代表了對(duì)照反應(yīng)，其中沒(méi)有加入蛋白質(zhì)；泳道2,其 中只加入CspA蛋白質(zhì)的對(duì)照反應(yīng)；泳道3,MS2RNA只與（His)6MazF-mt3 ;泳道4,MS2RNA 與（His)6MazF-mt3和CspA蛋白質(zhì)一同孵育。在RNA序列上以箭頭指示切割位點(diǎn)，并使用右 邊顯示的RNA梯度（ladder)確定這些位點(diǎn)。在圖15H中，將RNA梯度精簡(jiǎn)到C(堿基3390) 和G(堿基3394)殘基之間，但是通過(guò)比較上游和下游區(qū)域與標(biāo)準(zhǔn)序列闡明了序列。
[0053]圖 16A-D描繪了使用（His)6MizF-mt3 對(duì)MS2RNA的體外切害I]，顯示MazF-mt3 特 異性地在⑶(XU位點(diǎn)處進(jìn)行切割。泳道1，其中沒(méi)有加入蛋白質(zhì)的對(duì)照反應(yīng)；泳道2,其中 只加入CspA蛋白質(zhì)的對(duì)照反應(yīng)；泳道3，MS2RNA僅與（His)6MazF-mt3 -同孵育；泳道4， MS2RNA與（His)6MazF-mt3和CspA蛋白質(zhì)一同孵育。在RNA序列上以箭頭指示強(qiáng)的和弱的 切割位點(diǎn)，并且使用右邊顯示的RNA梯度確定這些位點(diǎn)。
[0054] 圖17A-R描繪了使用（His)6MazF-mt7對(duì)MS2RNA的體外切割。泳道1，其中沒(méi)有 加入酶的對(duì)照反應(yīng)；泳道2,其中只加入了CspA蛋白質(zhì)的對(duì)照反應(yīng)；泳道3,MS2RNA僅與 (His)6MazF-mt3 一同孵育；泳道 4，MS2RNA與（His)6MazF_mt3 和CspA蛋白質(zhì)一同孵育。在 RNA序列上以箭頭指示強(qiáng)的和弱的切割位點(diǎn)，并且使用右邊顯示的RNA梯度確定這些位點(diǎn)。
[0055] 發(fā)明詳述
[0056] (1)根據(jù)本發(fā)明的、用于使用DNA聚合酶的改進(jìn)的DNA合成的組合物
[0057] 本發(fā)明的組合物包含冷休克蛋白質(zhì)或其同源物和DNA聚合酶。驚人地，與不存在 冷休克蛋白質(zhì)的DNA合成反應(yīng)相比較，在使用包含冷休克蛋白質(zhì)和DNA聚合酶的反應(yīng)混合 物的情況下，DNA合成反應(yīng)的反應(yīng)性有所改進(jìn)。
[0058] 在本發(fā)明中，盡管沒(méi)有具體的限制，上文的DNA合成方式的反應(yīng)性改進(jìn)指的是減 少非-特異性擴(kuò)增，增加衍生自靶標(biāo)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物的量，等等?？赏ㄟ^(guò)以常規(guī)方法分析反 應(yīng)混合物中合成的產(chǎn)物而對(duì)些改進(jìn)進(jìn)行定量，所述常規(guī)方法如在瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳。
[0059] 根據(jù)本發(fā)明的DNA合成方法，抑制了DNA的非-特異性合成。常規(guī)地，已經(jīng)知道應(yīng) 當(dāng)將DNA合成的反應(yīng)混合物保持在低溫直到反應(yīng)開(kāi)始，以防止非-特異性反應(yīng)的發(fā)生。使 用根據(jù)本發(fā)明的組合物使得可以直接使用置于室溫的混合物進(jìn)行DNA合成反應(yīng)。
[0060] 沒(méi)有特別地限制可用于本發(fā)明的DNA聚合酶；然而，優(yōu)選的是熱穩(wěn)定性DNA聚合 酶。作為可用于本發(fā)明的DNA聚合酶，示例的是衍生自真細(xì)菌如屬于棲熱菌屬（Thermus)或 芽孢桿菌屬（Bacillus)的細(xì)菌的DNA聚合酶（衍生自粞熱水生菌（Thermusaquaticus)， 熱堅(jiān)芽孢桿菌（Bacilluscaldotenax)等等的DNA聚合酶），衍生自古細(xì)菌如屬于種屬 火球菌屬（Pyrococcus)或熱球菌屬（Thermococcus)的DNA聚合酶(衍牛.自激烈火球菌 (Pyrococcusfuriosus),Thermococcuslitralis,thermococcuskodakaraensis等的DNA 聚合酶）。在本發(fā)明的DNA合成方法中，優(yōu)選的是可用于PCR的熱穩(wěn)定DNA聚合酶。
[0061] 在本發(fā)明的組合物中可包含兩種或更多種DNA聚合酶。例如，可在本發(fā)明中使用 具有3' ->5'外切核酸酶活性的DNA聚合酶和另一種基本上不具有3' ->5'外切核酸酶活 性的DNA聚合酶。使用這種DNA聚合酶組合的技術(shù)被稱為L(zhǎng)A-PCR(長(zhǎng)而精確的PCR)。
[0062] 除了冷休克蛋白質(zhì)和DNA聚合酶之外，根據(jù)本發(fā)明的組合物可進(jìn)一步包含至少一 種引物、至少一種脫氧核苷酸三磷酸、和/或反應(yīng)緩沖溶液。
[0063] 引物是具有與模板DNA互補(bǔ)的核苷酸序列的寡聚核苷酸。只要其能在本發(fā)明使用 的反應(yīng)條件下與模板DNA退火，則關(guān)于引物沒(méi)有特定的限制。
[0064] 由于進(jìn)行的是特異性退火過(guò)程，引物長(zhǎng)度優(yōu)選的為至少六個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地至 少10個(gè)核苷酸。根據(jù)寡聚核苷酸的合成，引物長(zhǎng)度優(yōu)選地為至多100個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地 至多30個(gè)核苷酸?？赏ㄟ^(guò)已知方法化學(xué)合成寡聚核苷酸。寡聚核苷酸可為衍生自天然來(lái) 源的寡聚核苷酸，例如，可通過(guò)以限制性內(nèi)切酶消化從天然來(lái)源制備的DNA而進(jìn)行制備。
[0065] 本發(fā)明的組合物可用于制備由DNA聚合酶進(jìn)行的DNA合成的混合物。包括冷休克 蛋白質(zhì)的用于DNA合成反應(yīng)的組合物或包含冷休克蛋白質(zhì)的DNA合成反應(yīng)加速劑也是本發(fā) 明的實(shí)施方式。
[0066] (2)根據(jù)本發(fā)明的、用于使用DNA聚合酶的改進(jìn)的DNA合成的方法
[0067] 本發(fā)明的用于合成DNA的方法包括步驟：
[0068]A)制備包含冷休克蛋白質(zhì)或其同源物、DNA聚合酶、至少一種引物、至少一種脫氧 核苷酸三磷酸、和作為模板的DNA的混合物；以及
[0069] B)孵育步驟A)中制備的混合物。
[0070] 與不存在冷休克蛋白質(zhì)時(shí)的DNA合成反應(yīng)相比，通過(guò)本發(fā)明的方法，DNA合成反應(yīng) 的反應(yīng)性有所改進(jìn)。
[0071] 作為模板的DNA指的是在引物與此DNA退火時(shí)，DNA可用作DNA延伸的模板。用 于本發(fā)明方法的混合物可包含單一模板或具有不同序列的多種模板。分別使用特異性模板 的引物對(duì)可同時(shí)獲得對(duì)應(yīng)于各自模板的產(chǎn)物。這種多種模板可以以相同DNA或不同DNA分 子存在。作為模板的DNA可為雙鏈DNA，單鏈DNA或DNA-RNA雜合體。
[0072] 沒(méi)有特別限制本發(fā)明使用的冷休克蛋白質(zhì)的量，其可為每25yl的反應(yīng)混合物超 過(guò)0. 5iig，優(yōu)選地為2-15iig，更優(yōu)選地為5-12iig。
[0073] 沒(méi)有特別限制本發(fā)明使用的DNA聚合酶的量。例如，其可與常規(guī)DNA合成中使用 的量相同。用于PCR的DNA聚合酶的優(yōu)選的量是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。通常地，在使用 衍生自粞熱水生菌的DNA聚合酶的PCR情況下，使用每25yl反應(yīng)混合物0. 125-5U的DNA 聚合酶。
[0074] 在本發(fā)明中，根據(jù)每種DNA聚合酶產(chǎn)品的說(shuō)明書提出商業(yè)可得的DNA聚合酶的活 性。例如，通過(guò)使用具有50iU終體積的混合物（含有25mMTAPS(25°C下為pH9. 3)，50mM氯 化鉀，2mM氯化鎂，ImMP-巰基乙醇，dATP、dGTP和dTTP各 200iiM，以及 100iiM的[a-32P] dCTP)確定DNA聚合酶的活性。將一單位（下文描述為"1U"）的DNA聚合酶活性定義為 "能夠在74°C下，30分鐘內(nèi)將lOnmol的dNTP并入酸-不可溶性物質(zhì)的酶量"。
[0075] 沒(méi)有特別限制本發(fā)明的方法中使用的各引物的量，其可以為0. 05-2yM。
[0076] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)DNA擴(kuò)增方法，如PCR來(lái)進(jìn)行DNA合成。
[0077] (3)根據(jù)本發(fā)明的、用于使用DNA聚合酶的改進(jìn)的DNA合成的試劑盒
[0078] 根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包含冷休克蛋白質(zhì)以及DNA聚合酶。只要其可用于上文的 DNA合成方法，則不會(huì)特別地限制本發(fā)明試劑盒?？梢詾橛糜跇?biāo)記核酸的試劑盒，用于PCR 的試劑盒，用于估計(jì)核酸的試劑盒，用于定點(diǎn)誘變的試劑盒等等。
[0079] 除了熱休克蛋白質(zhì)和DNA聚合酶之外，本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包含至少一種引 物、至少一種脫氧核苷酸三磷酸、和/或反應(yīng)緩沖溶液?？墒褂蒙衔捻?xiàng)目（1)中所描述的作 為試劑盒的組分（熱休克蛋