冷休克蛋白質組合物和用于其用途的方法以及試劑盒的制作方法
【專利說明】冷休克蛋白質組合物和用于其用途的方法以及試劑盒
[0001] 本申請是申請日為2009年3月2日、申請?zhí)枮?00980106857. 9、發(fā)明名稱為"冷 休克蛋白質組合物和用于其用途的方法以及試劑盒"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 優(yōu)先權聲明
[0003] 本申請要求提交于2008年2月29日的美國臨時申請?zhí)?1/067, 596,提交于2008 年10月9日的美國臨時申請?zhí)?1/195, 747,以及提交于2008年5月16日的日本申請?zhí)?2008-129745的優(yōu)先權，這些公開的內容在此處全部并入本文作為參考。
[0004] 序列列表
[0005] 隨本文一并提交書寫形式的及計算機可讀形式的序列列表。計算機可讀形式記錄 的信息與書寫形式的序列列表是相同的。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 在研究領域，將DNA的合成用于多種目的。其中，除了化學合成短鏈DNA如寡聚核 苷酸之外，通過使用了DNA聚合酶的酶促方法進行DNA合成中的大部分。PCR可在體外容易 地擴增所需要的核酸片段，有極高的價值，并已經成為生物學、醫(yī)學、農業(yè)和其他領域中不 可缺少的工具。在由PCR擴增DNA的過程中，許多情況下都要求反應的高特異性。盡管開 發(fā)了新型DNA聚合酶，也優(yōu)化了反應混合物的組成以減少非-特異性擴增，但是仍然需要對 PCR擴增特異性的改進。
[0008] 除了使用DNA作為模板材料的傳統(tǒng)PCR方法之外，還可使用RNA-依賴的DNA聚合 酶逆轉錄酶實現(xiàn)DNA的合成。在研究領域中，常常有必要分析衍生自多種基因的mRNA分 子。逆轉錄酶使得用RNA作為模板合成cDNA的逆轉錄反應成為可能，并且因此，已經在對 mRNA分子的分析上實現(xiàn)了卓越的進步。通過在克隆技術和PCR技術的應用，其中使用了逆 轉錄酶的mRNA分子的分析現(xiàn)在在遺傳學研究中是不可缺少的實驗技術，并且已經成為多 種領域如生物學、醫(yī)學、農業(yè)中絕對必要的技術。
[0009] 迄今已經產生了一些手段以改進逆轉錄反應的反應性，例如，已經研究了在高溫 下進行的逆轉錄反應過程；在其中使用了逆轉錄酶以及具有3' -5'外切核酸酶活性的酶的 cDNA合成過程（JP專利號3910015);其中使用了核酸-結合蛋白質如Ncp7、reCA、SSB及 T4gp32的過程（W0 00/55307);等等。盡管有一些對逆轉錄反應的反應性的改進，然而可能 無法合成全長的cDNA，并且甚至在如今，有些情況下所合成的cDNA的量可能不足。因此，對 逆轉錄反應的反應性的改進仍然是正進行的大事，必須要進一步改進。
[0010] 除了對上文描述的兩種DNA合成方法的改進之外，在科學領域還需要可以確定內 切核糖核酸酶的切割位點特異性的技術。例如，mRNA干擾酶為存在于廣泛的細菌基因組中 的毒素_抗毒素系統(tǒng)編碼的序列-特異性內切核糖核酸酶。這些內切核糖核酸酶通常具有 單鏈RNA內的特異性切割位點：大腸桿菌（E.coli)MazF在ACA序列處特異性切割，ChpBK 在ACY序列處（Y為U、A或G)特異性切割，來自質粒R100的PemK在UAH序列處（其中H 為C、A或U)特異性切割，來自結核分枝桿菌（M.tuberculosis)的MazF-mtl和MazF_mt6 分別在UAC和U富含區(qū)域特異性切割。最近，有發(fā)現(xiàn)來自金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的MazF同源物在VUUV'處進行切割（其中V和V'為A、C或G，且可以相同或不相 同）。然而確定分支結核桿菌的一些MazF同源物的切割特異性的之前嘗試卻失敗了。尤其 是對于確定其中識別長于三個堿基的特異性序列的切割特異性，使用足夠長以覆蓋所有可 能的靶標序列的RNA底物是至關重要的。使用長RNA作為底物的一個主要問題在于盡管其 為單鏈RNA，卻形成非常穩(wěn)定的二級結構。為了使用這種或任何其他長RNA作為內切核糖 核酸酶的底物，必須解折疊其二級結構。因此，還有對開發(fā)用以確定內切核糖核酸酶如mRNA 干擾酶的切割-位點特異性的新技術的需要。
[0011] 在多種微生物體內發(fā)現(xiàn)有冷休克蛋白質，人們認為其在對生長溫度下移的適 應中起到一些作用。其中，已經鑒定CspA為一種主要的冷休克蛋白質。從大腸桿菌 (Escherichiacoli)中分離出編碼CspA的基因，并使用其基因產生了重組CspA(見TO 90/09444)。然而，冷休克蛋白質的常規(guī)提出的應用限于其作為冷凍保護蛋白質的用途，其 保護農田中不受冷凍或霜凍損害。
[0012] 本發(fā)明提供了用于改進的DNA合成反應（具有改進的反應性）的包含冷休克蛋白 質的組合物，使用這些組合物用于合成DNA的方法，在這些方法中使用的試劑盒，以及通過 這些方法產生的組合物。本發(fā)明進一步提供用于鑒定內切核糖核酸酶切割位點的包含冷休 克蛋白質的組合物，使用這些組合物用于鑒定內切核糖核酸酶切割位點的方法，以及在這 些方法中使用的試劑盒。
[0013] 發(fā)明概述
[0014] 根據本發(fā)明，提供了使用DNA聚合酶用于DNA合成的組合物，使用這種組合物用于 合成DNA的方法，用于這種DNA合成方法的試劑盒，以及根據所提供這種方法合成的DNA組 合物。本發(fā)明的一個目標是使得使用DNA聚合酶進行DNA合成成為可能，其中反應的反應 性得到改進。
[0015] 本發(fā)明的一個實施方式涉及用于DNA合成的組合物，其包含冷休克蛋白質和DNA 聚合酶。在本發(fā)明的特定實施方式中，作為此冷休克蛋白質的示例為CspA或其同源物，優(yōu) 選地，為衍生自大腸桿菌的CspA或其同源物。組合物可包含超過0. 5yg的CspA每25yL 組合物。根據這種實施方式的組合物可包含兩種或多種DNA聚合酶。進一步地，根據這種 實施方式的組合物可包含至少一種引物和至少一種脫氧核苷酸。這種組合物可進一步包 括液體媒介物，如反應緩沖溶液。
[0016] 本發(fā)明的一個進一步的實施方式包含A)冷休克蛋白質；B)至少一種選自DNA聚 合酶、引物、脫氧核苷酸、和DNA的組分；以及C)液體媒介物。
[0017] 本發(fā)明的一個進一步的實施方式涉及合成DNA的方法，其包括步驟:A)制備包含 冷休克蛋白質、DNA聚合酶、至少一種引物、至少一種脫氧核苷三磷酸、和DNA的混合物；以 及B)孵育步驟A)中制備的混合物。
[0018] 本發(fā)明的另一個實施方式涉及用于DNA合成的試劑盒，其包含冷休克蛋白質和 DNA聚合酶。根據這種實施方式的試劑盒可進一步包含液體媒介物或關于如何使用試劑盒 的紙質或電子形式的說明書。這種試劑盒的組分可單獨地或分開地存在。
[0019] 本發(fā)明還涉及由包括以下步驟的方法合成的DNA組合物：A)制備包含冷休克蛋白 質、DNA聚合酶、至少一種引物、至少一種脫氧核苷的混合物、和DNA;以及B)孵育步驟A)中 制備的混合物。
[0020] 本發(fā)明還涉及有利地用于逆轉錄反應的組合物，使用所述組合物的CDNA合成方 法，有利地用于逆轉錄反應的試劑盒，以及由此方法合成的cDNA組合物。根據本發(fā)明，可實 現(xiàn)這種令人滿意的逆轉錄反應，其在特異性、合成鏈的長度、合成量等等方面是出眾的。 [0021] 本發(fā)明的一個實施方式涉及用于逆轉錄反應的組合物，其包含冷休克蛋白質或其 同源物；和逆轉錄酶。在根據本發(fā)明的這種實施方式中，冷休克蛋白質的實例是CspA或其 同源物，CspA的一個實例為衍生自大腸桿菌的CspA。在一些實施方式中，CspA可以從大約 0. 5yg-大約20ygCspA每20yL的組合物的量存在。逆轉錄酶的實例為衍生自莫洛尼鼠 類白血病病毒的逆轉錄酶和/或衍生自禽成髓細胞瘤病毒的逆轉錄病毒的逆轉錄酶和/或 其組合。進一步地，根據本發(fā)明的此實施方式中的組合物可進一步包含至少一種引物和至 少一種脫氧核苷酸。組合物的進一步的實施方式包含液體媒介物，如反應緩沖溶液。其他 實施方式包含寡聚（dT)引物或具有隨機序列的寡聚核苷酸引物或其組合。
[0022] 本發(fā)明的一個進一步的實施方式包含用于逆轉錄反應的組合物，其包含：A)冷休 克蛋白質；B)至少一種選自逆轉錄酶、引物、脫氧核苷酸、和RNA的組分；以及C)液體媒介 物。
[0023] 本發(fā)明的一個進一步的實施方式涉及用于合成cDNA的方法，包括:A)制備包含冷 休克蛋白質、逆轉錄酶、至少一種引物、至少一種脫氧核苷、和RNA的混合物；以及B)孵育步 驟A)中制備的混合物。
[0024] 本發(fā)明的一個進一步的實施方式包含用于逆轉錄反應的試劑盒，包含：A)冷休克 蛋白質；B)至少一種選自逆轉錄酶、引物、脫氧核苷酸、和RNA的組分；以及C)液體媒介物。 根據這個實施方式的試劑盒可進一步包含液體媒介物或關于如何使用試劑盒的紙質或電 子形式的說明書。這種試劑盒的組分可單獨地或分開地存在。這個實施方式的試劑盒可進 一步包含用于進行基因擴增反應的試劑。
[0025] 本發(fā)明進一步涉及由包括以下步驟的方法合成的cDNA組合物：A)制備包含冷休 克蛋白質、逆轉錄酶、至少一種引物、至少一種脫氧核苷、和RNA的溶液；以及B)孵育步驟 A)中制備的溶液。
[0026] 本發(fā)明進一步涉及用于鑒定內切核糖核酸酶切割位點的組合物，使用這些組合物 用于鑒定內切核糖核酸酶切割位點的方法以及用于這些方法的試劑盒。
[0027] 本發(fā)明的一個實施方式涉及用于鑒定內切核糖核酸酶切割位點的組合物，A)冷休 克蛋白質；以及B)至少一種選自RNA底物和內切核糖核酸酶的組分。在根據本發(fā)明的這種 實施方式中，冷休克蛋白質的實例為CspA或其同源物，CspA的一個實例是衍生自大腸桿菌 的CspA。在優(yōu)選的實施方式中，RNA底物長于1024個堿基并含有大約相等數(shù)量的每種堿 基。這種RNA底物的一個實例為細菌噬菌體MS2RNA。這種實施方式的組合物可進一步包含 液體媒介物。
[0028] 本發(fā)明的另一個實施方式涉及用于確定內切核糖核酸酶切割位點的方法，其包括 步驟:A)制備包含冷休克蛋白質、RNA底物、和內切核糖核酸酶的混合物；以及B)孵育步 驟A)中制備的混合物。這種方法可進一步包括通過電泳分析混合物。
[0029] 本發(fā)明的一個進一步的實施方式涉及用于確定內切核糖核酸酶切割位點的試劑 盒，其包含冷休克蛋白質和RNA底物。此實施方式的試劑盒可進一步包含液體媒介物，如反 應緩沖溶液。
[0030] 此實施方式可進一步包含關于如何使用試劑盒的紙質或電子形式的說明書。在這 種實施方式中，冷休克蛋白質和RNA底物可單獨或組合存在。
[0031] 如本文使用的，冷休克蛋白質為那些在暴露于生長溫度下移引起的冷休克時在生 物體，尤其是微生物體中表達的蛋白質的集體名稱。當大腸桿菌的孵育溫度從37°C降低到 15°C時，會高水平地瞬時表達叫做CspA的冷休克蛋白質。已知大腸桿菌有八種不同的蛋 白質，CspB-CspI，其與CspA具有高的氨基酸序列同一性。在這些蛋白質中，CspB、CspG和 CspI為冷休克蛋白質。進一步地，通常已知這些冷休克蛋白質的同源物存在于其他微生物 如枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis)(CspB)、熱溶芽抱桿菌（Bacilluscaldolyticus) (CspB)、海棲熱袍菌（Thermotogamaritima) (CspB，CspL)和胚芽乳桿菌（Lactobacillus plantarum) (CspL)。在本發(fā)明中，CspA的同源物指的是具有顯示與衍生自大腸桿菌的CspA 的氨基酸序列至少50%的序列同一性的氨基酸序列的冷休克蛋白質。在本發(fā)明中，可使用 這些冷休克蛋白質。在本發(fā)明中使用的冷休克蛋白質的實例優(yōu)選地為CspA，更優(yōu)選地是衍 生自革蘭氏-陰性細菌的CspA，甚至更優(yōu)選地是衍生自大腸桿菌的CspA?？赏ㄟ^重組DNA 技術或從微生物體中分離而制備本發(fā)明中使用的CspA。
[0032] 同源物指的是與目標蛋白質具有序列同源性的實體，優(yōu)選地顯示與另一種多肽的 氨基酸序列有至少50%的序列同一性，并且在結構特征或生物學功能上具有相似性。
[0033] 如本文使用的，脫氧核苷酸指的是通過磷酯鍵鍵合于脫氧核糖的磷酸基團，所述 脫氧核糖鍵合于有機堿基。天然DNA包括四種不同的核苷酸。這些核苷酸分別由可在天 然DNA中找到的腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶堿基構成。腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸 腺嘧啶堿基分別縮寫為A、G、C和T。脫氧核苷酸包括游離的單磷酸、二磷酸和三磷酸（更 具體地，磷酸基團的每種包含一個、兩個或三個磷酸部分）。因此，脫氧核苷酸包括脫氧核 苷酸三磷酸（例如，dATP、dCTP、dITP、dGTP和dTTP)及其衍生物。脫氧核苷酸衍生物包括 [aS]dATP、7-deaza-dGTP、7-deaza-dATP以及顯示出針對核酸分解的抗性的脫氧核苷酸衍 生物。脫氧核苷酸衍生物包括例如，以這樣的方式標記的脫氧核苷