本發(fā)明屬于小分子食品環(huán)境污染物的免疫化學和殘留生物分析技術領域，具體涉及一種呋蟲胺半抗原、完全抗原和抗體及其制備方法與應用。
背景技術：
呋蟲胺是由日本三井化學株式會社研發(fā)的新一代煙堿類農(nóng)藥，是繼吡蟲啉等第一代、噻蟲嗪等第二代煙堿農(nóng)藥后的又一類具有新結構的煙堿類農(nóng)藥。呋蟲胺分子中具有的呋喃環(huán)和開環(huán)的胍基取代了前兩類氯代吡啶基、氯代噻唑基或者閉環(huán)胍基，是煙堿類農(nóng)藥分子結構中唯一不含鹵素原子和芳香環(huán)的種類，殺蟲活性和安全性更高。呋蟲胺也是一種煙堿乙酰膽堿受體(nachr)激動劑，具有較好的胃毒、觸殺和根部內(nèi)吸性，活性高、安全性高、持效期長，殺蟲譜廣等優(yōu)點，廣泛用于水稻、蔬菜、果樹中的飛虱、椿象類、二化螟、蚜蟲類、粉虱類、蛾類、薊馬類等的防治，對已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性的很多害蟲具有較好的防治效果，是煙堿類農(nóng)藥的最新品種。
即使呋蟲胺的毒性較小，但是大量使用仍不免會在農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境中造成殘留，長期的低濃度的殘留也會對人類健康和環(huán)境造成危害，特別是對家蠶、蜜蜂等生物還是具有一定的毒性，歐盟已經(jīng)禁用了包括吡蟲啉等在內(nèi)的三種新煙堿類殺蟲劑在很多種作物中的應用，在美國epa要求在戶外使用呋蟲胺時一定要測定其對非靶標昆蟲，比如傳粉昆蟲的影響。而且，很多國家都制定了越來越嚴格的殘留限量標準。美國對呋蟲胺的限量標準根據(jù)作物不同從0.05-50mg/kg，日本的肯定列表規(guī)定呋蟲胺的限量標準為0.01-2mg/kg。農(nóng)藥殘留現(xiàn)在主要是靠氣相色譜、液相色譜及其與質(zhì)譜聯(lián)用技術，該類技術具有精密度高等優(yōu)點，但是它們具有儀器設備昂貴、條件要求高、過程繁瑣不易掌握、成本高昂等特點，特別對于農(nóng)產(chǎn)品等附加值低、保鮮要求高的產(chǎn)品不適合，因此對于快速、成本低廉、靈敏度高的分析技術比較迫切。
其中，酶免疫反應是發(fā)展較早，較為成熟的一種快速分析方法。但是與大分析相比較而言，小分子不容易引起機體的免疫反應，即不具備免疫原性，被稱為半抗原；但是具有特定結構的小分子可以與抗體產(chǎn)生反應，即小分子具有反應原性，因此如果將小分子連接到具有免疫原性的大分子上，做成人工抗原，就可以使機體產(chǎn)生免疫應答，產(chǎn)生針對小分子結構的抗體。但是不是任何小分子與大分子連接都會產(chǎn)生針對這個小分子的抗體，也不是產(chǎn)生的抗體都能針對此小分子產(chǎn)生特異性結合，因此在小分子半抗原結構的設計非常重要，首先要設計合理的半抗原結構既能容易實現(xiàn)反應又能夠較恰當?shù)哪M目標分析物的結構；其次，要選擇合適的與大分子的結合位點、選擇合適長度和合適結構的連接臂，凸顯小分子的特征結構、易于產(chǎn)生免疫應答的結構能刺激機體產(chǎn)生反應；再次，考慮到還要分子的空間結構、電子云密度、構型構像等的諸多因素，都可能會對抗體的性質(zhì)產(chǎn)生較大影響。
基于抗原抗體特異性結合的免疫反應的分析技術主要是elisa和eia，其中以elisa應用更為廣泛，elisa技術發(fā)展自70年代，農(nóng)藥等小分子免疫檢測技術發(fā)展自80年代，elsia以根據(jù)酶標的抗體分解底物顯示顏色的深度或吸光度與待測物質(zhì)含量之間的關系來進行測定。這一技術手段具有靈敏度高、分析速度快、抗基底干擾能力強等優(yōu)點，得到了較快的發(fā)展。該技術最重要的在于小分子半抗原結構的設計、連接位點的選擇、連接臂結構和長度的選擇等等會影響抗體結構的重要方面，也是該技術的關鍵點和高質(zhì)量抗體的保障。關于呋蟲胺人工半抗原、人工抗原、抗體以及以此為基礎的免疫分析方法尚未見報道。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種呋蟲胺半抗原、完全抗原和抗體。
本發(fā)明的目的還在于提供上述呋蟲胺半抗原、完全抗原和抗體的制備方法。
本發(fā)明的目的還在于提供上述半抗原、完全抗原和抗體在呋蟲胺含量檢測免疫分析方法的建立方面的應用。
一種呋蟲胺半抗原，所述呋蟲胺半抗原的分子結構如式i所示：
一種呋蟲胺免疫原，是由上述的半抗原與牛血清半蛋白偶聯(lián)而來，其分子結構如式ii所示：
一種呋蟲胺包被原，是由上述的半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)而來，其分子結構如式iii所示：
一種呋蟲胺抗體，是能與上述呋蟲胺免疫原或呋蟲胺包被原發(fā)生特異性反應的igg抗體。
上述呋蟲胺半抗原的制備方法，按照如下步驟進行：
(1)將呋蟲胺2.00-2.50g溶于無水三口瓶中的20-30ml乙醇中，連接冷凝裝置，加熱至乙醇回流；
(2)三口瓶中通入氮氣保護，磁力攪拌步驟(1)制備的呋蟲胺乙醇溶液，緩慢投入8.50-11.25g二水合氯化亞錫，至完全溶解，氮氣保護回流反應4-6h；
(3)反應完成后往三口瓶中加蒸餾水，邊加邊攪拌，至不再生成渾濁物，將混合液12000rpm/min離心，棄去沉淀，再重復離心3次；
(4)將上清用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，真空旋蒸至干，得目標產(chǎn)物。
上述呋蟲胺免疫原的制備方法，按照如下步驟進行：
(1)將0.1g的bsa溶于5.0mlph＝5.0的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.040-0.045g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽，完全溶解后再攪拌15min，加0.020-0.025gn-n-羥基琥珀酰亞胺，溶解后攪拌40min；
(2)將權利要求1中所述的半抗原0.020-0.031g溶解到1.0ml的dmf中，將步驟(1)制備的反應液的ph調(diào)制至8.0，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此ph為8.0的溶液中，攪拌反應過夜；
(3)將步驟(2)制備的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心，然后進行定容，計算完全抗原濃度，測定結合比，分裝凍存；
上述呋蟲胺免疫原的制備方法，按照如下步驟進行：
(1)將0.1g的ova溶于5.0mlph＝6.0的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.030-0.039g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽，完全溶解后再攪拌15min，加0.010-0.030gn-n-羥基琥珀酰亞胺溶解后攪拌40min；
(2)將權利要求1所述的半抗原0.020-0.031g溶解到1.0ml的dmf中，將步驟(1)制備的反應液的ph調(diào)制至8.0，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此ph為8.0的溶液中，攪拌反應過夜；
(3)將步驟(2)制備的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心，然后進行定容，計算完全抗原濃度，測定結合比，分裝凍存。
上述呋蟲胺抗體的制備方法，按照如下步驟進行：
(1)免疫：選用新西蘭大白兔，采用皮下注射法進行免疫，一共進行五次免疫，具體做法是：
第一次免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏完全佐劑進行乳化，然后進行注射免疫；
第二次至第四次免疫：用1.0mg上述免疫原4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏不完全佐劑進行乳化，然后進行注射免疫；
第五次免疫為加強免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水直接進行注射免疫；
第二至第五次免疫分別在第一次免疫后，15天，30天，45天，60天后進行，從第三次免疫后開始，每次免疫后7天從兔子耳緣靜脈取血，測定血清效價；
(2)抗體純化：當抗血清中的抗體對權利要求3中所述的呋蟲胺包被原效價達到1∶60000-1∶80000時，兔頸部靜脈取血，離心獲得抗血清，使用辛酸-硫酸銨法對抗血清進行純化，制備得權利要求4中所述的igg抗體。
上述呋蟲胺包被原和呋蟲胺抗體的應用，用于呋蟲胺含量檢測免疫分析方法的建立。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明設計合成的半抗原能夠很好的模擬呋蟲胺分子結構特征，為呋蟲胺特征結構的暴漏和高特異性抗體的產(chǎn)生做好基礎；抗體具有高的特異性，檢測限達到1.28μg/l；上述半抗原合成簡單，收率高，反應易于控制；本發(fā)明合成的半抗原的方法簡單，易于掌握，所建立的酶聯(lián)免疫方法靈敏度和準確度高，操作簡單，成本低，非常適合于現(xiàn)場檢測。因此，本發(fā)明為高效，低廉、快速的免疫檢測產(chǎn)品打下很好的基礎，具有良好的應用前景和經(jīng)濟效益。
附圖說明
圖1為實施例2半抑制濃度即ic50的值測定曲線。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
實施例1
呋蟲胺半抗原制備方法，步驟包括：
(1)將呋蟲胺2.10g溶于無水三口瓶中的25ml乙醇中，連接冷凝裝置，加熱至乙醇回流；
(2)三口瓶中通入氮氣保護，磁力攪拌上述乙醇溶液，緩慢投入8.5g二水合氯化亞錫，至完全溶解，氮氣保護回流反應4h；
(3)反應完成后往三口瓶中加蒸餾水，邊加邊攪拌，至不再生成渾濁物，將混合液12000rpm/min離心10min，棄去沉淀，再重復離心3次；
(4)將上清用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，真空旋蒸至干，得目標產(chǎn)物。
免疫原的制備方法為活潑酯法，包括以下步驟：
(1)將0.1g的bsa溶于5.0mlph＝4.5的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.045gedc*hcl[1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽]，完全溶解后再攪拌15min，加0.021gnhs(n-n-羥基琥珀酰亞胺)溶解后攪拌40min。
(2)將1中所述的半抗原0.026g溶解到1.0ml的dmf中，將上一步驟反應液的ph迅速調(diào)制至8.0，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此ph為8.0的溶液中，攪拌反應過夜。
(3)將上一步驟中的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心10min，然后將上清進行定容，計算完全抗原濃度，測定結合比，分裝凍存。
包被原也采用活潑酯法進行制備，步驟如下：
(1)將0.1g的ova溶于5.0mlph＝6.0的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.035gedc*hcl[1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽]，完全溶解后再攪拌15min，加0.015gnhs(n-n-羥基琥珀酰亞胺)溶解后攪拌40min。
(2)將半抗原0.020g溶解到1.0ml的dmf中，將上一步驟反應液的ph迅速調(diào)制至8.5，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此ph為8.5的溶液中，攪拌反應過夜。
(3)將上一步驟中的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心10min，然后將上清進行定容，計算完全抗原濃度，測定結合比，分裝凍存。
抗體的制備：
(1)免疫：選用新西蘭大白兔選用新西蘭大白兔(免疫前先采其血清作為陰性血清)，采用皮下注射法進行免疫，一共進行五次免疫，第一次免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏完全佐劑進行乳化，然后進行注射免疫；第二次至第四次免疫：用1.0mg上述免疫原4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏不完全佐劑進行乳化，然后進行注射免疫；第五次免疫為加強免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水直接進行注射免疫；第二至加強(第五次)免疫分別在第一次免疫后，15天，30天，45天，60天后進行，從第三次免疫后開始，每次免疫后7天從兔子耳緣靜脈取血，測定血清效價；
(2)抗體純化：當抗血清中的抗體對呋蟲胺包被原效價達到1∶60000時，兔頸部靜脈取血，離心獲得抗血清，使用辛酸-硫酸銨法粗體，葡聚糖凝膠純化對抗血清進行制備，制得igg抗體。
實施例2
呋蟲胺半抗原制備方法，步驟包括：
(1)將呋蟲胺2.40g溶于無水三口瓶中的25ml乙醇中，連接冷凝裝置，加熱至乙醇回流；
(2)三口瓶中通入氮氣保護，磁力攪拌上述乙醇溶液，緩慢投入10.00g二水合氯化亞錫，至完全溶解，氮氣保護回流反應5h；
(3)反應完成后往三口瓶中加蒸餾水，邊加邊攪拌，至不再生成渾濁物，將混合液12000rpm/min離心10min，棄去沉淀，再重復離心4次；
(4)將上清用乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，真空旋蒸至干，得目標產(chǎn)物。
免疫原的制備方法為活潑酯法，包括以下步驟：
(1)將0.1g的bsa溶于5.0mlph＝5.5的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.042gedc*hcl[1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽]，完全溶解后再攪拌15min，加0.023gnhs(n-n-羥基琥珀酰亞胺)溶解后攪拌40min。
(2)將1中所述的半抗原0.026g溶解到1.0ml的dmf中，將上一步驟反應液的ph迅速調(diào)制至8.5，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此溶液中，攪拌反應過夜。
(3)將上一步驟中的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心10min，然后將上清進行定容，計算完全抗原濃度，測定結合比，分裝凍存。
包被原也采用活潑酯法進行制備，步驟如下：
(1)將0.1g的ova溶于5.0mlph＝5.0的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.034gedc*hcl[1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽]，完全溶解后再攪拌15min，加0.014gnhs(n-n-羥基琥珀酰亞胺)溶解后攪拌40min。
(2)將半抗原0.020g溶解到1.0ml的dmf中，將上一步驟反應液的ph迅速調(diào)制至9.0，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此溶液中，攪拌反應過夜。
(3)將上一步驟中的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心10min，然后將上清進行定容，計算完全抗原濃度，測定結合比，分裝凍存。
抗體的制備：
(1)免疫：選用新西蘭大白兔，采用皮下注射法進行免疫，一共進行五次免疫，第一次免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏完全佐劑進行乳化，然后進行注射免疫；第二次至第四次免疫免疫：用1.0mg上述免疫原4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏不完全佐劑進行乳化，然后進行注射免疫；第五次免疫為加強免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水直接進行注射免疫；第二至加強(第五次)免疫分別在第一次免疫后，15天，30天，45天，60天后進行，從第三次免疫后開始，每次免疫后7天從兔子耳緣靜脈取血，測定血清效價；
(2)抗體純化：當抗血清中的抗體對呋蟲胺包被原效價達到1∶70000時，兔頸部靜脈取血，離心獲得抗血清，使用辛酸-硫酸銨法粗體，葡聚糖凝膠純化對抗血清進行制備，制得igg抗體。
呋蟲胺抗體在檢測呋蟲胺含量的應用，包括如下步驟：
(1)包被：用包被緩沖液(ph＝9.6，0.1mol/l的碳酸鹽溶液)稀釋包被原(在7中已定容)到2μg/ml，100μl/孔，室溫孵育3h后，用洗板液(含有0.02％吐溫20的磷酸鹽緩沖液)洗滌孔3次；
(2)封閉：每孔加入200μl含有1％ova，0.02％吐溫20的ph＝7.4的磷酸鹽封閉緩沖液封閉室溫封閉40min，用洗板液洗滌孔3次；
(3)加樣：將待測樣品溶于ph7.4的磷酸緩沖液中，每孔50μl(或每孔加入50μl梯度濃度的標樣，包括0點，即只加入50μl空白磷酸鹽緩沖液的空白孔)，同時設置完全相同的另一組加樣組，測定陰性血清孔的值；
(4)競爭反應：將抗體溶于ph7.4的磷酸緩沖液中，加入待測樣品或標樣后，每孔加入50μl抗體溶液，孵育80min后用洗板液洗滌三次；
(5)加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗：將二抗用ph7.4的磷酸緩沖液20000倍稀釋，每孔加入100μl，室溫孵育70分鐘后，甩出反應液拍凈酶標板洗孔3次；
(6)顯色反應：底物反應液由a液(一水合檸檬酸0.49g，十二水合磷酸氫二鈉1.94g，溶于100ml水)9.5ml，b液(過氧化氫脲75mg溶于10ml水，4℃避光保存)32μl，c液(四甲基聯(lián)苯胺(tmb)50mg溶于無水乙醇25ml，4℃避光保存)0.5ml，混合而成，現(xiàn)用現(xiàn)配，顯色時每孔加入50μl，20min后每孔加入50μl2.5mol/l的硫酸終止反應后在自動酶標儀上讀數(shù)。
根據(jù)顏色反應的吸光度值，根據(jù)公式抑制率i(％)＝[1-(a樣品-a陰性)/(a空白-a陰性)]*100％，其中a樣品是指加有待測樣品或者標液孔的吸光度，a陰性是指相同條件下不加抗體血清而加入陰性血清的孔的吸光值，a空白是待測物濃度為0時的孔的吸光度，計算出不同呋蟲胺濃度對抗體的抑制率，并做出抑制的標準曲線，橫坐標為呋蟲胺標準溶液濃度的對數(shù)值，縱坐標為抑制率，找出半抑制濃度即ic50的值，ic50越低說明抗體的靈敏度越高，如圖1，ic50為0.0059μg/ml。
實施例3
呋蟲胺半抗原制備方法，步驟包括：
(1)將呋蟲胺2.10g溶于無水三口瓶中的30ml乙醇中醇中，連接冷凝裝置，加熱至乙醇回流；
(2)三口瓶中通入氮氣保護，磁力攪攪拌上述乙醇溶液，緩慢投入二水合8.5g氯化亞錫，至完全溶解，氮氣保護回流反應6h；
(3)反應完成后往三口瓶中加蒸餾水，邊加邊攪拌，至不再生成渾濁物，將混合液12000rpm/min離心10min，棄去沉淀，再重復離心3次；
(4)將上清用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，真空旋蒸至干，得目標產(chǎn)物。
免疫原的制備方法為活潑酯法，包括以下步驟：
(1)將0.1g的bsa溶于5.0mlph＝4.5的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.045gedc*hcl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)，完全溶解后再攪拌15min，加0.021gnhs(n-n-羥基琥珀酰亞胺)溶解后攪拌40min。
(2)將1中所述的半抗原0.026g溶解到1.0ml的dmf中，將上一步驟反應液的ph迅速調(diào)制至8.0，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此ph為8.0的溶液中，攪拌反應過夜。
(3)將上一步驟中的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心10min，然后將上清進行定容，計算完全抗原濃度，測定結合比，分裝凍存。
包被原也采用活潑酯法進行制備，步驟如下：
(1)將0.1g的ova溶于5.0mlph＝6.0的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.035gedc*hcl[1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽]，完全溶解后再攪拌15min，加0.015gnhs(n-n-羥基琥珀酰亞胺)溶解后攪拌40min。
(2)將半抗原0.020g溶解到1.0ml的dmf中，將上一步驟反應液的ph迅速調(diào)制至8.5，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此ph為8.5的溶液中，攪拌反應過夜。
(3)將上一步驟中的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心10min，然后將上清進行定容，計算完全抗原濃度，測定結合比，分裝凍存。
抗體的制備：
(1)免疫：選用新西蘭大白兔(免疫前采其血清作為陰性對照)，采用皮下注射法進行免疫，一共進行五次免疫，第一次免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏完全佐劑進行乳化，然后進行注射免疫；第二次至第四次免疫：用1.0mg上述免疫原4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏不完全佐劑進行乳化，然后進行注射免疫；第五次免疫為加強免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水直接進行注射免疫；第二至加強(第五次)免疫分別在第一次免疫后，15天，30天，45天，60天后進行，從第三次免疫后開始，每次免疫后7天從兔子耳緣靜脈取血，測定血清效價；
(2)抗體純化：當抗血清中的抗體對呋蟲胺包被原效價達到1∶60000時，兔頸部靜脈取血，離心獲得抗血清，使用辛酸-硫酸銨法對抗血清進行純化，制備得igg抗體。
elisa方法的建立
(1)棋盤法確定包被原濃度為2μg/ml，100μl/孔，抗體按照1∶3000稀釋，酶標二抗按照1∶20000稀釋，加入梯度濃度的呋蟲胺，做出抑制的標準曲線，確定出其50％抑制濃度，即ic50(呋蟲胺)；同時在另一些孔中將呋蟲胺替代為與其結構類似的其他農(nóng)藥，也做梯度濃度，找出其半抑制濃度，即ic50(類似物)。抗體的交叉反應率：cr(％)＝ic50(呋蟲胺)/ic50(類似物)，這一值表示了抗體的特異性，值越小，特異性越高，表1列出了該抗體對一些結構類似物的交叉反應率。
表1抗體對一些結構類似物的交叉反應率
實施例4
呋蟲胺半抗原制備方法，步驟包括：
(1)將呋蟲胺2.40g溶于無水三口瓶中的30ml乙醇中醇中，連接冷凝裝置，加熱至乙醇回流；
(2)三口瓶中通入氮氣保護，磁力攪攪拌上述乙醇溶液，緩慢投入10.00g二水合氯化亞錫，至完全溶解，再加入菹草提取物0.05g或婆婆納提取物0.1g，至完全溶解，氮氣保護回流反應6h；所述菹草提取物或婆婆納提取物的提取方法為：將菹草或婆婆納新鮮的葉片放入烘箱在50-80℃條件下烘干，磨成粉末，加4-8倍重量份數(shù)的30％乙醇水溶液回流提取3次，合并濾液，蒸干制成。
(3)反應完成后往三口瓶中加蒸餾水，邊加邊攪拌，至不再生成渾濁物，將混合液12000rpm/min離心10min，棄去沉淀，再重復離心4次；
(4)將上清用乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，真空旋蒸至干，得目標產(chǎn)物。
免疫原的制備方法為活潑酯法，包括以下步驟：
(1)將0.1g的bsa溶于5.0mlph＝5.5的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.042gedc*hcl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)，完全溶解后再攪拌15min，加0.023gnhs(n-n-羥基琥珀酰亞胺)溶解后攪拌40min。
(2)將1中所述的半抗原0.026g溶解到1.0ml的dmf中，再加入菹草提取物0.05g或婆婆納提取物0.1g(制備方法如上所述)，將上一步驟反應液的ph迅速調(diào)制至8.5，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此溶液中，攪拌反應過夜。
(3)將上一步驟中的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心10min，然后將上清進行定容，計算完全抗原濃度，測定結合比，分裝凍存。
包被原也采用活潑酯法進行制備，步驟如下：
(1)將0.1g的ova溶于5.0mlph＝5.0的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.034gedc*hcl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)，完全溶解后再攪拌15min，加0.014gnhs(n-n-羥基琥珀酰亞胺)溶解后攪拌40min。
(2)將半抗原0.020g溶解到1.0ml的dmf中，再加入菹草提取物0.05g或婆婆納提取物0.1g(制備方法如上所述)將上一步驟反應液的ph迅速調(diào)制至9.0，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此溶液中，攪拌反應過夜。
(3)將上一步驟中的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心10min，然后將上清進行定容，計算完全抗原濃度，測定結合比，分裝凍存。
抗體的制備：
(1)免疫：選用新西蘭大白兔，采用皮下注射法進行免疫，一共進行五次免疫，第一次免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏完全佐劑進行乳化，然后進行注射免疫；第二次至第四次免疫免疫：用1.0mg上述免疫原4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏不完全佐劑進行乳化，然后進行注射免疫；第五次免疫為加強免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水直接進行注射免疫；第二至加強(第五次)免疫分別在第一次免疫后，15天，30天，45天，60天后進行，從第三次免疫后開始，每次免疫后7天從兔子耳緣靜脈取血，測定血清效價；
(2)抗體純化：當抗血清中的抗體對呋蟲胺包被原效價達到1∶70000時，兔頸部靜脈取血，離心獲得抗血清，使用辛酸-硫酸銨法粗體，葡聚糖凝膠純化對抗血清進行制備，制得igg抗體。
呋蟲胺抗體在檢測呋蟲胺含量的應用，包括如下步驟：
(1)包被：用包被緩沖液(ph＝9.6，0.1mol/l的碳酸鹽溶液)稀釋包被原(在7中已定容)到2μg/ml，100μl/孔，室溫孵育3h后，用洗板液(含有0.02％吐溫20的磷酸鹽緩沖液)洗滌孔3次；
(2)封閉：每孔加入200μl含有1％ova，0.02％吐溫20的ph＝7.4的磷酸鹽封閉緩沖液封閉室溫封閉40min，用洗板液洗滌孔3次；
(3)加樣：將待測樣品溶于ph7.4的磷酸緩沖液中，每孔50μl(或每孔加入50μl梯度濃度的標樣，包括0點，即只加入50μl空白磷酸鹽緩沖液的空白孔)，同時設置完全相同的另一組加樣組，測定陰性血清孔的值；
(4)競爭反應：將抗體溶于ph7.4的磷酸緩沖液中，加入待測樣品或標樣后，每孔加入50μl抗體溶液，孵育80min后用洗板液洗滌三次；
(5)加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗：將二抗用ph7.4的磷酸緩沖液20000倍稀釋，每孔加入100μl，室溫孵育70分鐘后，甩出反應液拍凈酶標板洗孔3次；
(6)顯色反應：底物反應液由a液(一水合檸檬酸0.49g，十二水合磷酸氫二鈉1.94g，溶于100ml水)9.5ml，b液(過氧化氫脲75mg溶于10ml水，4℃避光保存)32μl，c液(四甲基聯(lián)苯胺(tmb)50mg溶于無水乙醇25ml，4℃避光保存)0.5ml，混合而成，現(xiàn)用現(xiàn)配，顯色時每孔加入50μl，20min后每孔加入50μl2.5mol/l的硫酸終止反應后在自動酶標儀上讀數(shù)。
根據(jù)顏色反應的吸光度值，根據(jù)公式抑制率i(％)＝[1-(a樣品-a陰性)/(a空白-a陰性)]*100％，其中a樣品是指加有待測樣品或者標液孔的吸光度，a陰性是指相同條件下不加抗體而加入陰性血清的孔的吸光值，a空白是待測物濃度為0時的孔的吸光度，計算出不同呋蟲胺濃度對抗體的抑制率，并做出抑制的標準曲線，橫坐標為呋蟲胺標準溶液濃度的對數(shù)值，縱坐標為抑制率，找出半抑制濃度即ic50的值，ic50越低說明抗體的靈敏度越高，ic50為0.00032μg/ml。
實施例5
呋蟲胺半抗原制備方法，步驟包括：
(1)將呋蟲胺2.10g溶于無水三口瓶中25ml乙醇中醇中，連接冷凝裝置，加熱至乙醇回流；
(2)三口瓶中通入氮氣保護，磁力攪攪拌上述乙醇溶液，緩慢投入二水合8.5g氯化亞錫，至完全溶解，再加入青金石粉末1g或硨磲粉末2g，氮氣保護回流反應6h；
(3)反應完成后往三口瓶中加蒸餾水，邊加邊攪拌，至不再生成渾濁物，將混合液12000rpm/min離心10min，棄去沉淀，再重復離心3次；
(4)將上清用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，真空旋蒸至干，得目標產(chǎn)物。
免疫原的制備方法為活潑酯法，包括以下步驟：
(1)將0.1g的bsa溶于5.0mlph＝4.5的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.045gedc*hcl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)，完全溶解后再攪拌15min，加0.021gnhs(n-n-羥基琥珀酰亞胺)溶解后攪拌40min。
(2)將1中所述的半抗原0.026g溶解到1.0ml的dmf中，再加入青金石粉末1g或硨磲粉末2g，將上一步驟反應液的ph迅速調(diào)制至8.0，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此ph為8.0的溶液中，攪拌反應過夜。
(3)將上一步驟中的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心10min，然后將上清進行定容，計算完全抗原濃度，測定結合比，分裝凍存。
包被原也采用活潑酯法進行制備，步驟如下：
(1)將0.1g的ova溶于5.0mlph＝6.0的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中，加入0.035gedc*hcl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)，完全溶解后再攪拌15min，加0.015gnhs(n-n-羥基琥珀酰亞胺)溶解后攪拌40min。
(2)將半抗原0.020g溶解到1.0ml的dmf中，再加入青金石粉末1g或硨磲粉末2g，將上一步驟反應液的ph迅速調(diào)制至8.5，將溶解有半抗原的dmf溶液加至此ph為8.5的溶液中，攪拌反應過夜。
(3)將上一步驟中的溶液在ph＝7.4的0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液中4℃下透析72h，然后12000rpm/min離心10min，然后將上清進行定容，計算完全抗原濃度，測定結合比，分裝凍存。
抗體的制備：
(1)免疫：選用新西蘭大白兔(免疫前采其血清作為陰性對照)，采用皮下注射法進行免疫，一共進行五次免疫，第一次免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏完全佐劑進行乳化，然后進行注射免疫；第二次至第四次免疫免疫：用1.0mg上述免疫原4℃下慢慢解凍，加生理鹽水和等體積的弗氏不完全佐劑進行乳化，然后進行注射免疫；第五次免疫為加強免疫：取2.0mg上述免疫原溶液，4℃下慢慢解凍，加生理鹽水直接進行注射免疫；第二至加強(第五次)免疫分別在第一次免疫后，15天，30天，45天，60天后進行，從第三次免疫后開始，每次免疫后7天從兔子耳緣靜脈取血，測定血清效價；
(2)抗體純化：當抗血清中的抗體對呋蟲胺包被原效價達到1∶60000時，兔頸部靜脈取血，離心獲得抗血清，使用辛酸-硫酸銨法對抗血清進行純化，制備得igg抗體。
elisa方法的建立
(1)棋盤法確定包被原濃度為2μg/ml，100μl/孔，抗體按照1∶3000稀釋，酶標二抗按照1∶20000稀釋，加入梯度濃度的呋蟲胺，做出抑制的標準曲線，確定出其50％抑制濃度，即ic50(呋蟲胺)；同時在另一些孔中將呋蟲胺替代為與其結構類似的其他農(nóng)藥，也做梯度濃度，找出其半抑制濃度，即ic50(類似物)?？贵w的交叉反應率：cr(％)＝ic50(呋蟲胺)/ic50(類似物)，這一值表示了抗體的特異性，值越小，特異性越高，表1列出了該抗體對一些結構類似物的交叉反應率。
表1抗體對一些結構類似物的交叉反應率