本發(fā)明屬于植物有效成分提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種二氫呋喃聯(lián)苯類化合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

藤黃科(garcinial.)植物全球約450種，產(chǎn)亞洲、非洲南部及波利尼西亞西部，我國有21種，分布于廣東、廣西、云南等南部省區(qū)。藤黃科植物還是天然呫噸酮（xanthones）類成分的主要資源之一，富含異戊烯基取代的呫噸酮（xanthones），這類成分結(jié)構(gòu)新穎多樣，且具有廣泛的藥理活性，尤以藤黃酸(gambogicacid)最具代表性，具有廣譜強(qiáng)效的抗腫瘤活性，是近年來抗腫瘤天然產(chǎn)物的研究熱點(diǎn)之一，我國學(xué)者正在開發(fā)其注射液為抗腫瘤一類新藥。除呫噸酮（xanthone）類外，苯甲酮類(benzophenones)、雙黃酮類(bioflavonoids)和聯(lián)苯類(biphenyls)等化合物也是本科植物的特征性成分，也具有多種生物活性。為了更有效地利用我國藤黃科植物資源，從中尋找具有開發(fā)前景的活性成分，我們選擇對藤黃科植物開展較系統(tǒng)的活性成分研究工作。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的是提供一種聯(lián)苯類化合物；第二目的在于提供所述聯(lián)苯類化合物的制備方法；第三目的在于提供所述聯(lián)苯類化合物在制備抗輪狀病毒藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的聯(lián)苯類化合物是以干燥的藤黃科喬木枝條、葉或果實(shí)為原料，經(jīng)浸膏提取、有機(jī)溶劑萃取、硅膠柱層析、高效液相色譜分離得到的，該化合物分子式為c18h18o4，命名為2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran，具有下述結(jié)構(gòu)式：

。

本發(fā)明的第二目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的聯(lián)苯類化合物的制備方法，是以干燥的藤黃科喬木枝條、葉和/或果實(shí)為原料，經(jīng)浸膏提取、有機(jī)溶劑萃取、硅膠柱層析、高效液相色譜分離獲得，具體為：

a、浸膏提?。簩⑻冱S科喬木枝條、葉或果實(shí)粗粉碎到20~40目，用有機(jī)溶劑超聲提取2~4次，每次40~60min，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮提取液至1/4~1/2體積時，靜置，濾除沉淀物，濃縮成浸膏a；

b、有機(jī)溶劑萃取：浸膏a中加入重量比1~2倍量的水，用與水等體積的有機(jī)溶劑萃取3~5次，合并有機(jī)溶劑萃取相，減壓濃縮成浸膏b；

c、硅膠柱層析：將浸膏b用重量比1.5~3倍量的有機(jī)溶劑溶解，然后用浸膏重0.8~1.2倍的100~200目硅膠拌樣，然后上硅膠柱層析，裝柱硅膠為100~200目，用量為浸膏b重量6~8倍量；用體積比為1:0~0:1的混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分；

d、反相柱層析：將以7:3配比的有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫得到的洗脫液上反相柱層析，反相柱是用反相材料c-8、c-18、ods或mci裝柱；用體積含量為20~100%的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集各部分洗脫液并濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分；

e、高效液相色譜分離：將以體積含量55~80%甲醇水溶液洗脫得到的洗脫液經(jīng)高效液相色譜分離純化，即得所述的聯(lián)苯類化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran；

f、e步驟所述的高效液相色譜分離純化是以50~70%的甲醇為流動相，流速10~14ml/min，21.2×250mm，5um的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為254nm，每次進(jìn)樣45~60ul，收集16~32min的色譜峰，多次累加后蒸干。即得所述的聯(lián)苯類化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。

本發(fā)明聯(lián)苯類化合物是首次被分離出來的，通過核磁共振和其他波譜技術(shù)測定方法確定為聯(lián)苯類化合物，并表征其具體結(jié)構(gòu)為：

化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran，為橙黃色膠狀物；紫外光譜（溶劑為甲醇），λmax（logε）：570(1.79),266(3.69),226(3.82),204(3.96)nm；紅外光譜（溴化鉀壓片）vmax3432,2924,2852,1630,1503,1450,1374,1243,1173,1096,1054,1027,905,855,824,591cm^–1；hresims顯示本發(fā)明化合物準(zhǔn)分子離子峰m/z298.1202[m]⁺（計算值為298.1205），結(jié)合¹³c和¹hnmr譜（圖1和圖2，碳譜氫譜數(shù)據(jù)歸屬見圖4）給出其分子式為c18h18o4。¹hnmr（c5d5n，500mhz）和¹³cnmr（c5d5n，125mhz）數(shù)據(jù)，見圖4。

hresims顯示其準(zhǔn)分子離子峰為298.1202[m]⁺(計算值298.1205)，結(jié)合¹³cnmr譜確定分子式為c18h18o4，不飽和度為10。紅外吸收光譜在3432cm^-1表明羥基的存在，在1630、1503cm^-1表明苯環(huán)的存在，紫外光譜在204、226、266nm有最大吸收也證實(shí)了苯環(huán)的存在。¹³cnmr和¹hnmr譜數(shù)據(jù)顯示了聯(lián)苯結(jié)構(gòu)的特征信號。¹hnmr數(shù)據(jù)顯示有一個芳香質(zhì)子δh6.81(1h,s)，表明該化合物是具有五取代的聯(lián)苯結(jié)構(gòu)。芳香質(zhì)子δh6.81(1h,s)為h-5，是因?yàn)樵趆mbc中顯示它和c-4(δc128.8)、c-9(δc118.7)、c-7(δc132.1)、c-6(δc150.0)和c-1′′(δc132.5)有相關(guān)。¹hnmr數(shù)據(jù)顯示了一個對位取代的苯環(huán)[δh7.58(2h,d,j=8.5hz,h-2′′,h-6′′)和7.33(2h,d,j=8.5hz,h-3′′,5′′)]，一個異丙烯基香豆酮的部分信號[δh3.44(1h,dd,j=15.2,9.0hz,h-3),3.23(h,dd,j=15.2,8.6hz,h-3),5.30(1h,t,j=8.6hz,h-2),4.88(1h,s,h-2′),5.22(1h,s,h-2′)和1.72(3h,s,h-3′)]，還有一個甲氧基(δh3.84,3h,s,6-ome)。在hmbc中，h-3和c-4、c-9、c-8(δc149.1)相關(guān)，h-2和c-8、c-9相關(guān)，可以知道異丙烯基香豆酮和c-8、c-9相連。甲氧基(δh3.84)的取代在c-6位，可由它與c-6的hmbc的相關(guān)確認(rèn)。根據(jù)其分子式可知兩個羥基分別位于c-7、c-4′′位。至此，該化合物的結(jié)構(gòu)得到確定，命名為2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。

本發(fā)明的第三目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的聯(lián)苯類化合物在制備抗輪狀病毒藥物中的應(yīng)用。經(jīng)抗輪狀病毒活性實(shí)驗(yàn)，選用病毒唑作為對照，2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran對輪狀病毒的cc50和ec50值分別為164.2和12.9μmol/l，其具有較好的抗輪狀病毒活性。本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)簡單活性好，可作為抗輪狀病毒藥物的先導(dǎo)性化合物，有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran的核磁共振碳譜（¹³cnmr）。

圖2為化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran的核磁共振氫譜（¹hnmr）。

圖3為化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran的主要hmbc（→）相關(guān)。

圖4為化合物的碳譜氫譜數(shù)據(jù)歸屬。

圖5為化合物的抗輪狀病毒活性。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明所述的聯(lián)苯類化合物是以干燥的藤黃科喬木的枝條、葉或果實(shí)為原料，經(jīng)浸膏提取、有機(jī)溶劑萃取、硅膠柱層析、高效液相色譜分離得到的，該化合物分子式為c18h18o4，命名為2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran，具有下述結(jié)構(gòu)式：

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本發(fā)明所述的聯(lián)苯類化合物的制備方法，其特征在于是以干燥的藤黃科喬木枝條、葉和/或果實(shí)為原料，經(jīng)浸膏提取、有機(jī)溶劑萃取、硅膠柱層析、高效液相色譜分離獲得，具體為：

a、浸膏提?。簩⑻冱S科喬木枝條、葉或果實(shí)粗粉碎到20~40目，用有機(jī)溶劑超聲提取2~4次，每次30~60min，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮提取液至1/4~1/2體積時，靜置，濾除沉淀物，濃縮成浸膏a；

b、有機(jī)溶劑萃?。航郺中加入重量比1~2倍量的水，用與水等體積的有機(jī)溶劑萃取3~5次，合并有機(jī)溶劑萃取相，減壓濃縮成浸膏b；

c、硅膠柱層析：將浸膏b用重量比1.5~3倍量的丙酮溶解，然后用浸膏重0.8~1.2倍的80~100目硅膠拌樣，然后上硅膠柱層析，裝柱硅膠為100~200目，用量為浸膏b重量6~8倍量；用體積比為1:0~0:1的混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分；

d、反相柱層析：將以7:3配比的有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫得到的洗脫液上反相柱層析，反相柱是用反相材料c-8、c-18、ods或mci裝柱；用體積含量為20~100%的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集各部分洗脫液并濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分；

e、高效液相色譜分離：將以體積含量55~80%甲醇水溶液洗脫得到的洗脫液經(jīng)高效液相色譜分離純化，即得所述的聯(lián)苯類化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran；

f、e步驟所述的高效液相色譜分離純化是以50~70%的甲醇為流動相，流速10~14ml/min，21.2×250mm，5um的反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為254nm，每次進(jìn)樣45~60ul，收集16~32min的色譜峰，多次累加后蒸干。即得所述的聯(lián)苯類化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran：

a步驟所述的有機(jī)溶劑為70~100%的丙酮、乙醇或甲醇；

b步驟所述的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚或苯；

c步驟所述的混合有機(jī)溶劑為正己烷-丙酮、氯仿-丙酮、氯仿-甲醇、石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯；

c步驟所述的混合有機(jī)溶劑的體積配比為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1。

本發(fā)明所述的聯(lián)苯類化合物在制備抗輪狀病毒藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的藤黃科植物不受地區(qū)和品種限制，均可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

實(shí)施例1

取干燥的藤黃科喬木枝條、葉和/或果實(shí)5.7kg，粗粉碎至40目，用70%的丙酮超聲提取5次，每次60min，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮至體積的1/4；靜置，濾除沉淀物，濃縮成368g浸膏a；在浸膏a中加入600g水，用與水等體積的氯仿萃取4次，合并萃取相，減壓濃縮成247g浸膏b；用200目硅膠1600g裝柱，在浸膏b中加入600g的丙酮溶解，然后加入100目硅膠250g拌樣，拌樣后上柱；用體積比分別為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1的氯仿-甲醇混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分，得到9個部分，體積比7:3的氯仿-甲醇混合有機(jī)溶劑的洗脫液c為67g；用反相材料c-18裝柱，洗脫液c上反相柱，以體積含量為20~100%的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集各部分洗脫液并濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分；取以體積含量50~70%甲醇水溶液洗脫得到的洗脫液，再以60%的甲醇為流動相，流速8ml/min，21.2×250mm，5um的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為254nm，每次進(jìn)樣50ul，收集15min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的聯(lián)苯類化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。

實(shí)施例2

取干燥的藤黃科喬木枝條、葉和/或果實(shí)3kg，粗粉碎至20目，用100%的乙醇超聲提取3次，每次60min，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮至體積的1/3；靜置，濾除沉淀物，濃縮成189g浸膏a；在浸膏a中加入360g的水，用與水等體積的氯仿萃取4次，合并萃取相，減壓濃縮成158g浸膏b；用100目硅膠900g裝柱，在浸膏b中加入260g的丙酮溶解，然后加入100目硅膠260g拌樣，拌樣后上柱；用體積比分別為1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的正己烷-丙酮混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分；體積比9:1的正己烷-丙酮混合有機(jī)溶劑的洗脫液c為76g；用反相材料c-8裝柱，洗脫液c上反相柱，以體積含量為20~100%的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集各部分洗脫液并濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分；取以體積含量50~70%甲醇水溶液洗脫得到的洗脫液，再以68%的甲醇為流動相，流速14ml/min，21.2×250mm，5um的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為254nm，每次進(jìn)樣50ul，收集21min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的聯(lián)苯類化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。

實(shí)施例3

取干燥的藤黃科喬木枝條、葉和/或果實(shí)6kg，粗粉碎至30目，用80%的甲醇超聲提取4次，每次30min，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮至體積的1/2；靜置，濾除沉淀物，濃縮成392g浸膏a；在浸膏a中加入700g的水，用與水等體積的乙醚萃取4次，合并萃取相，減壓濃縮成242g浸膏b；用100目硅膠1600g裝柱，在浸膏b中加入320g的丙酮溶解，然后加入100目硅膠260g拌樣，拌樣后上柱；用體積比分別為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1的氯仿-丙酮混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分；體積比9:1的氯仿-丙酮混合有機(jī)溶劑的洗脫液c為45g；用反相材料ods裝柱，洗脫液c上反相柱，以體積含量為20~100%的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集各部分洗脫液并濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分；取以體積含量50~70%甲醇水溶液洗脫得到的洗脫液，再以55%的甲醇為流動相，流速12ml/min，21.2×250mm，5um的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為254nm，每次進(jìn)樣50ul，收集19min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的聯(lián)苯類化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。

實(shí)施例4

取干燥的藤黃科喬木枝條、葉和/或果實(shí)5.3kg，粗粉碎至40目，用90%的乙醇超聲提取3次，每次45min，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮至體積的1/4；靜置，濾除沉淀物，濃縮成321g浸膏a；在浸膏a中加入680g的水，用與水等體積的石油醚萃取4次，合并萃取相，減壓濃縮成235g浸膏b；用100目硅膠1450g裝柱，在浸膏b中加入290g的丙酮溶解，然后加入100目硅膠265g拌樣，拌樣后上柱；用體積比分別為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、3:2、1:1、1:2、0:1的石油醚-丙酮混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分；體積比9:1的石油醚-丙酮混合有機(jī)溶劑的洗脫液c為52g；用反相材料mci裝柱，洗脫液c上反相柱，以體積含量為20~100%的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集各部分洗脫液并濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分；取以體積含量50~70%甲醇水溶液洗脫得到的洗脫液，再以70%的甲醇為流動相，流速10ml/min，21.2×250mm，5um的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為254nm，收集14min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的聯(lián)苯類化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。

實(shí)施例5

取干燥的藤黃科喬木枝條、葉和/或果實(shí)10kg，粗粉碎至20目，用70%的甲醇超聲提取4次，每次35min，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮至體積的1/2；靜置，濾除沉淀物，濃縮成879g浸膏a；在浸膏a中加入1700g的水，用與水等體積的苯萃取5次，合并萃取相，減壓濃縮成445g浸膏b；用200目硅膠3330g裝柱，在浸膏b中加入900g的丙酮溶解，然后加入100目硅膠580g拌樣，拌樣后上柱；用體積比分別為1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的石油醚-乙酸乙酯混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分；體積比9:1的石油醚-乙酸乙酯混合有機(jī)溶劑的洗脫液c為105g；用反相材料c-18裝柱，洗脫液c上反相柱，以體積含量為20~100%的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集各部分洗脫液并濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分；取以體積含量50~70%甲醇水溶液洗脫得到的洗脫液，再以50%的甲醇為流動相，流速12ml/min，21.2×250mm，5um的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為254nm，收集31min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的聯(lián)苯類化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。

實(shí)施例6

取干燥的藤黃科喬木枝條、葉和/或果實(shí)8.1kg，粗粉碎至20目，用100%的丙酮超聲提取4次，每次30min，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮至體積的1/2；靜置，濾除沉淀物，濃縮成638g浸膏a；在浸膏a中加入1200g的水，用與水等體積的苯萃取5次，合并萃取相，減壓濃縮成362g浸膏b；用200目硅膠2400g裝柱，在浸膏b中加入500g的丙酮溶解，然后加入100目硅膠400g拌樣，拌樣后上柱；用體積比分別為1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的石油醚-丙酮混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分；體積比9:1的石油醚-乙酸乙酯混合有機(jī)溶劑的洗脫液c為87g；用反相材料ods裝柱，洗脫液c上反相柱，以體積含量為20~100%的甲醇水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集各部分洗脫液并濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分；取以體積含量50~70%甲醇水溶液洗脫得到的洗脫液，再以62%的甲醇為流動相，流速12ml/min，21.2×250mm，5um的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為254nm，收集22min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的聯(lián)苯類化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。

實(shí)施例7

取實(shí)施例1制備的化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran，為橙黃色膠狀物；測定方法為：用核磁共振，結(jié)合其它波譜技術(shù)鑒定結(jié)構(gòu)：

（1）紫外光譜（溶劑為甲醇），λmax（logε）：570(1.79),266(3.69),226(3.82),204(3.96)nm；

（2）紅外光譜（溴化鉀壓片）vmax3432,2924,2852,1630,1503,1450,1374,1243,1173,1096,1054,1027,905,855,824,591cm^–1；

（3）hresims顯示本發(fā)明化合物準(zhǔn)分子離子峰m/z298.1202[m]⁺（計算值為298.1205），結(jié)合¹³c和¹hnmr譜（圖1和圖2，碳譜氫譜數(shù)據(jù)歸屬見圖4）給出其分子式為c18h18o4。¹hnmr（c5d5n，500mhz）和¹³cnmr（c5d5n，125mhz）數(shù)據(jù)，見圖4；

hresims顯示其準(zhǔn)分子離子峰為298.1202[m]⁺(計算值298.1205)，結(jié)合¹³cnmr譜確定分子式為c18h18o4，不飽和度為10。紅外吸收光譜在3432cm^-1表明羥基的存在，在1630、1503cm^-1表明苯環(huán)的存在，紫外光譜在204、226、266nm有最大吸收也證實(shí)了苯環(huán)的存在。¹³cnmr和¹hnmr譜數(shù)據(jù)顯示了聯(lián)苯結(jié)構(gòu)的特征信號。¹hnmr數(shù)據(jù)顯示有一個芳香質(zhì)子δh6.81(1h,s)，表明該化合物是具有五取代的聯(lián)苯結(jié)構(gòu)。芳香質(zhì)子δh6.81(1h,s)為h-5，是因?yàn)樵趆mbc中顯示它和c-4(δc128.8)、c-9(δc118.7)、c-7(δc132.1)、c-6(δc150.0)和c-1′′(δc132.5)有相關(guān)。¹hnmr數(shù)據(jù)顯示了一個對位取代的苯環(huán)[δh7.58(2h,d,j=8.5hz,h-2′′,h-6′′)和7.33(2h,d,j=8.5hz,h-3′′,5′′)]，一個異丙烯基香豆酮的部分信號[δh3.44(1h,dd,j=15.2,9.0hz,h-3),3.23(h,dd,j=15.2,8.6hz,h-3),5.30(1h,t,j=8.6hz,h-2),4.88(1h,s,h-2′),5.22(1h,s,h-2′)和1.72(3h,s,h-3′)]，還有一個甲氧基(δh3.84,3h,s,6-ome)。在hmbc中，h-3和c-4、c-9、c-8(δc149.1)相關(guān)，h-2和c-8、c-9相關(guān)，可以知道異丙烯基香豆酮和c-8、c-9相連。甲氧基(δh3.84)的取代在c-6位，可由它與c-6的hmbc的相關(guān)確認(rèn)。根據(jù)其分子式可知兩個羥基分別位于c-7、c-4′′位。至此，該化合物的結(jié)構(gòu)得到確定，命名為2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。

實(shí)施例8

取實(shí)施例2制備的化合物，為橙黃色膠狀物；按實(shí)施例6中的方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定，結(jié)果為：其結(jié)構(gòu)同實(shí)施例6，分子式為c18h18o4。確認(rèn)實(shí)施例2制備的化合物為所述的聯(lián)苯類化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。

實(shí)施例9

取實(shí)施例3制備的化合物，為橙黃色膠狀物；按實(shí)施例6中的方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定，結(jié)果為：其結(jié)構(gòu)同實(shí)施例6，分子式為c18h18o4。確認(rèn)實(shí)施例3制備的化合物為所述的聯(lián)苯類化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran；

圖4化合物的¹h和¹³cnmr數(shù)據(jù)（溶劑為c5d5n）(125and500mhz)。

實(shí)施例10

取實(shí)施例4制備的化合物，為橙黃色膠狀物；按實(shí)施例6中的方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定，結(jié)果為：其結(jié)構(gòu)同實(shí)施例6，分子式為c18h18o4。確認(rèn)實(shí)施例4制備的化合物為所述的聯(lián)苯類化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。

實(shí)施例11

取實(shí)施例5制備的化合物，為橙黃色膠狀物；按實(shí)施例6中的方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定，結(jié)果為：其結(jié)構(gòu)同實(shí)施例6，分子式為c18h18o4。確認(rèn)實(shí)施例5制備的化合物為所述的聯(lián)苯類化合物2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran。

實(shí)施例12

取實(shí)施例1~5所制備的任一聯(lián)苯類化合物進(jìn)行細(xì)胞毒活性檢測試驗(yàn)，試驗(yàn)情況如下：

細(xì)胞株:羅猴腎細(xì)胞系(ma-104)由上海微蒙生物科技有限公司提供。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計:ma-104細(xì)胞與不同濃度化合物溫育72小時,每株細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)一次,用兩次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用改良mtt法評價化合物對細(xì)胞增殖的抑制程度,計算抑制率,根據(jù)抑制率采用logit方法計算ic50,比較化合物的體外抗腫瘤活性。

ec50即指半數(shù)有效濃度，是指引起50％試驗(yàn)動物產(chǎn)生某一特定反應(yīng)，或是某反應(yīng)指標(biāo)被抑制一半時的濃度。

cc50即指半數(shù)細(xì)胞毒性濃度，是指對半數(shù)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用所需濃度。在本實(shí)驗(yàn)中，指致50％細(xì)胞死亡所需的藥物濃度。

化合物細(xì)胞毒性測定

化合物用二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，dmso)溶解，于微波消毒10min，用mem配成lmg/ml的母液備用，mem溶液稀釋成所需濃度。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加l×10⁵/ml濃度的ma-104細(xì)胞懸液，100ul/孔，37℃、5%co2孵箱培養(yǎng)24h，在生長良好的單層細(xì)胞上分別加入濃度分別為lmg/ml、0.2mg/ml、40ug/ml、8ug/ml、1.25ug/ml的化合物;100ul/孔，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)正常細(xì)胞對照。置于37℃，5%co2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24h后，mtt法檢測細(xì)胞存活率。

化合物對病毒感染預(yù)防作用

以濃度為10⁴/ml，每孔l00ul接種細(xì)胞于96孔板中，培養(yǎng)24小時，見細(xì)胞長成單層并生長狀況良好，用濃度分別為100ug/ml、75ug/ml、50ug/ml、25ug/ml、lug/ml的化合物在37℃孵箱預(yù)先作用細(xì)胞1.5h，pbs洗滌后以100tcid50/ml的輪狀病毒每孔100ul吸附1h后棄去，加mem培養(yǎng)基100ul/孔維持，置37℃、5%co2孵箱，每日觀察細(xì)胞病變情況。48h后以mtt法檢測病毒抑制率。

細(xì)胞存活率測定

采用mtt法，在培養(yǎng)48h的細(xì)胞中加入5mg/ml甲基噻唑基四唑(methylthiazolyltetrazolium，mtt)20ul，繼續(xù)培養(yǎng)3-4h，棄上清，加入dmso每孔100ul，振蕩使孔內(nèi)結(jié)晶完全溶解后立即在490nm波長下測定吸光度a值：

細(xì)胞存活率=藥物組平均a值/細(xì)胞對照組a值×100%

病毒抑制率=[實(shí)驗(yàn)組平均a值一病毒對照組平均a值]/[細(xì)胞對照組平均a值一病毒對照組平均a值]×100%

治療指數(shù)(ti)=半數(shù)毒性濃度(cc50)/半數(shù)抑制濃度(ic50)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)抗輪狀病毒活性實(shí)驗(yàn)，選用病毒唑作為對照，2-isopropenyl-6-methoxy-7-hydroxy-(4-hydroxyphenyl)-dihydrobenzofuran對輪狀病毒的cc50和ec50值分別為164.2和12.9μmol/l，其具有較好的抗輪狀病毒活性（如圖5所示）。