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一種cDNA的特異性分子標(biāo)簽及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號:12411838閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種cDNA的特異性分子標(biāo)簽,其全長序列中包含:通用引物序列;轉(zhuǎn)座酶接頭序列P7;隨機序列:(N)n,N為隨機序列,共n個;和poly(T)序列;其中,所述通用引物序列如SEQ ID NO.1所示,所述轉(zhuǎn)座酶接頭序列P7如SEQ ID NO.2所示,所述poly(T)序列共有30個T堿基即T30VN。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述cDNA的特異性分子標(biāo)簽,其特征在于,所述特異性分子標(biāo)簽的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,具體序列如下:AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG(N)nT30VN,其中,N為隨機序列,共n個,n為5-10。

3.如權(quán)利要求1或2所述cDNA的特異性分子標(biāo)簽在cDNA建庫中的應(yīng)用。

4.如權(quán)利要求1或2所述cDNA的特異性分子標(biāo)簽在利用轉(zhuǎn)座酶打斷的cDNA建庫中的應(yīng)用。

5.一種利用轉(zhuǎn)座酶打斷的cDNA建庫方法,其特征在于,包括如下步驟:

1)分離單細(xì)胞,將單細(xì)胞裂解后釋放總RNA;以mRNA為模板、權(quán)利要求1或2所述特異性分子標(biāo)簽為引物逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,所述特異性分子標(biāo)簽加在第一鏈cDNA的5’端,且在逆轉(zhuǎn)錄過程中,利用逆轉(zhuǎn)錄酶的模板轉(zhuǎn)換活性在第一鏈cDNA的3’端加上一段接頭序列,該接頭序列與如SEQ ID NO.1所示的通用引物序列相同;以第一鏈cDNA為模板,以如SEQ ID NO.1所示的通用引物序列為引物通過PCR擴增合成帶所述特異性分子標(biāo)簽的全長cDNA,并進(jìn)行純化;

2)將步驟1)所得全長cDNA與轉(zhuǎn)座酶包埋復(fù)合物進(jìn)行孵育,完成cDNA片段化和加接頭;其中,所述轉(zhuǎn)座酶包埋復(fù)合物包括轉(zhuǎn)座酶和退火接頭;

3)使用上游引物N7和下游引物N5對步驟2)所得的片段化產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴增,富集cDNA的5’端;其中,上游引物N7的序列如SEQ ID NO.4所示,下游引物N5的序列如SEQ ID NO.5所示;

4)對步驟3)所得PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行純化,獲得帶所述特異性分子標(biāo)簽的cDNA的5’端文庫。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用轉(zhuǎn)座酶打斷的cDNA建庫方法,其特征在于,步驟2)中,所述轉(zhuǎn)座酶包埋復(fù)合物中的退火接頭的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;所述的轉(zhuǎn)座酶為Tn5家族轉(zhuǎn)座酶。

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的利用轉(zhuǎn)座酶打斷的cDNA建庫方法,其特征在于,步驟2)中,所述的cDNA片段化和加接頭方法包括:配制反應(yīng)混合液:權(quán)利要求5或6所述轉(zhuǎn)座酶包埋復(fù)合物3-7μl,轉(zhuǎn)座酶反應(yīng)緩沖液4-8μl;將全長cDNA與反應(yīng)混合液混合,用移液器吹打混勻;在PCR儀中50-58℃反應(yīng)10-15min。

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